Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ môt số loại thực vật tại vườn quốc gia bidoup núi bà, lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực : Trịnh Tuấn Anh MSSV: 1211100332 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan tất nội dung đồ án trực tiếp thực hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực vào chưa công bố hình thức Mọi tài liệu tham khảo dùng đồ án trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm công bố Những số liệu bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá thu thập từ nhiều nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo thích nguồn gốc Tất nội dung, chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trịnh Tuấn Anh năm 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, thầy giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm - Môi trường quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em trình học tập trường Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt tận tâm hướng dẫn chúng em qua buổi học lớp buổi nói chuyện, thảo luận lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học Môi trường - Thực phẩm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em Điều không giúp em thực đồ án tốt mà tảng kiến thức cho công việc sau Em cảm ơn bạn, anh, chị hỗ trợ giúp đỡ em thời gian thực đề tài phòng thí nghiệm Cuối cùng, em xin cảm ơn thầy cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Do kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên đồ án tốt nghiệp em nhiều thiếu sót, mong thầy dạy đề em hồn thiện đồ án tốt thu nhận thêm kiến thức Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đế thầy Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trịnh Tuấn Anh năm 2016 Đồ án tốt nghiệp MUC LUC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 10 Nội dung nghiên cứu 10 Phạm vi nghiên cứu 11 Nội dung Đồ án tốt nghiệp 11 CHƯƠNG TỔNG QUAN 12 1.1 Giới thiệu 12 1.1.1 Vai trò thuốc đời sống 12 1.1.2 Lợi ích sử dụng thuốc 13 1.1.3 Tình hình sử dụng thuốc 13 1.2 Thành phần hóa học thực vật 14 1.2.1 Carbohydrate 14 1.2.1.1 Khái niệm 14 1.2.1.2 Tính chất 14 1.2.1.3 Vai trò 15 1.2.2 Amino acid 15 1.2.2.1 Khái niệm 15 1.2.2.2 Tính chất 16 1.2.2.3 Vai trò 16 1.2.3 Alkaloid 16 1.2.3.1 Khái niệm 16 1.2.3.2 Tính chất 16 1.2.3.3 Vai trò 17 1.2.4 Glycosides 17 1.2.4.1 Khái niệm 17 1.2.4.2 Tính chất 18 1.2.4.3 Vai trò 18 Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Steroids 19 1.2.5.1 Khái niệm 19 1.2.5.2 Tính chất 19 1.2.5.3 Vai trò 19 1.2.6 Tannin 19 1.2.6.1 Khái niệm 19 1.2.6.2 Đặc điểm 20 1.2.6.3 Vai trò 20 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 20 1.2.7.1 Khái niệm 20 1.2.7.2 Tính chất 21 1.2.7.3 Vai trò 21 1.3 Tổng quan hợp chất kháng khuẩn thực vật 21 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 21 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 22 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 23 1.3.3.1 Alkaloids 23 1.3.3.2 Terpenoids tinh dầu 25 1.3.3.3 Phenol đơn acid phenolic 25 1.3.3.4 Lectin polypeptide 27 1.3.3.5 Saponin 27 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 28 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 28 1.4.1.1 Escherichia coli 28 1.4.1.2 Shigella 29 1.4.1.3 Salmonella 30 1.4.1.4 Vibrio 31 1.4.1.5 Listeria 32 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da 33 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 33 1.4.2.2 Staphylococcus aureus 34 1.4.2.3 Enterococcus feacalis 35 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Địa điểm thời gian 36 2.1.1 Địa diểm 36 2.1.2 Thời gian 36 2.2 Vật liệu 36 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 36 2.2.2 Vi sinh vật thị 37 2.2.3 Hóa chất, mơi trường 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 38 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật thị 38 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào VSV đo mật độ quang 39 2.3.4 Phương pháp bảo quản giữ giống 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 40 2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh 40 2.3.7 Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method)40 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 41 2.3.8.1 Carbohydrate 41 2.3.8.2 Alkaloid 42 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43 2.3.8.6 Flavonoid 43 2.3.8.7 Phenolic 44 2.3.8.8 Tannin 44 2.3.8.9 Steroid 44 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.10 Amino acid 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 45 2.4 Bố trí thí nghiệm 46 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% mẫu thuốc 47 2.4.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 49 2.4.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học 50 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi 52 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% từ mẫu khảo sát 53 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 53 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria 54 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella 55 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella 57 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 59 3.3 Kết xác định thành phần hoá học 63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 Kết luận 65 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Đồ án tốt nghiệp DANH MUC HINH ANH Hình 1.2 Cấu trúc phân tử loại Carbonhydrate 15 Hình 1.3.Alanine 15 Hình 1.4 Epherdin Hyoscyamin 16 Hình 1.5 Cardenolic Bufadiennolid 18 Hình 1.6 Steroid 19 Hình 1.7 Tannin 20 Hình 1.8 Limonene Ocimene 21 Hình 1.9 Một số chế kháng sinh 22 Hình 1.10 Solamargine 24 Hình 1.11 Berberine 24 Hình 1.12.Một số Terpenenes Terpenoid 25 Hình 1.13.Một số Quinones thơng thường 26 Hình 1.14 Gallotannin 26 Hình 1.15 Một số Flavonoid 27 Hình 1.16 Saponin 28 Hình 1.17 Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 kính hiển vi 28 Hình 1.18 Ảnh chụp Shigella sp mẫu phân 29 Hình 1.19 Hình ảnh S typhii S typhimurium 30 Hình 1.20 Hình ảnh Vibrio cholerae Vibrio harvey i 31 Hình 1.21 Hình ảnh Listeria monocytogenes 32 Hình 1.22 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 33 Hình 1.24 Hình ảnh Enterococcus feacalis 35 Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 38 Hình 3.1 Hiệu xuất tách chiết ethanol 70% với mẫu thuốc 52 Hình 3.2 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Escherichia coli 53 Hình 3.3 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Listeria 55 Hình 3.4 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Salmonella 56 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Shigella 57 Hình 3.6 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Vibrio 58 Hình 3.7 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm vi sinh gây bệnh 59 Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO : Dung môi dimethysufoside TSA : môi trường Tryptone casein soy agar TSB : môi trường Trypticase Soy Broth b S.enteritidis ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 67 tw 9.6 Wi 0.6 14 thi 66 Tot 68 20 al 0.3 Me F- Pan Ra Val 11 23 0.0 3.2 78 00 0.0 47 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 12 X di 16 Ci 13 X pro flo c S.typhi ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df Me F- Purc m an Ra Val Be 59 tw 5.0 Wi 1.0 14 thi Tot 59 20 al 6.0 99 13 0.0 17 88 00 0.0 71 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 11 X di Ci 12 X pro d S.typhimurium ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 41 tw 8.9 Wi 51 14 thi 66 Tot 47 20 al 0.5 Me F- Pan Ra Val 69 18 0.0 81 92 00 3.6 90 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Str 0.0 X ept Ca la La nta Xi di Eu odi Ci pro 5.8 33 9.6 66 9.8 33 10 16 11 X X X X X C.4 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Shigella a S.boydii ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 28 tw 3.5 Wi 0.5 14 thi Tot 28 20 al 4.0 Me F- Pan Ra Val 47 13 0.0 25 23 00 0.0 35 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ci 0.0 X pro flo Eu 0.0 X odi Ca 0.0 X la La 0.0 X nta Str 0.0 X ept Xi 10 X di b S.flexneri ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 70 tw 0.8 Wi 1.3 14 thi 33 Tot 70 20 al 2.1 Me F- Pan Ra Val 11 12 0.0 6.8 26 00 0.0 95 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo ge La 0.0 ne X nta Ca 0.0 X la Str 0.0 X ept Ac 0.0 X oru Eu 9.5 X odi Xi 11 X di 83 Ci 13 X pro 16 c S.sonnei ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 28 tw 15 Wi 1.0 14 thi Tot 28 20 al 16 Me F- Pan Ra Val 46 65 0.0 9.1 68 00 0.0 71 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 11 X di Ci 33 X pro flo C.5 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Vibrio a V.alginolyticus ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 82 tw 9.4 Wi 1.8 14 thi 33 Tot 83 20 al 1.2 Me F- Pan Ra Val 13 10 0.0 8.2 55 00 0.1 30 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La nta Xi di Ci pro flo 9.6 X 66 10 X 16 X 16 67 b V.Cholerae ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 65 tw 3.7 Wi 0.5 14 thi Tot 65 20 al 4.2 Me F- Pan Ra Val 10 30 0.0 8.9 51 00 0.0 35 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ca 0.0 X la Ac 0.0 X oru Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 9.5 X nta Ci 12 X pr Xi 12 X di c V.harveyi ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 93 tw 0.8 Wi 1.3 14 thi 33 Me F- Pan Ra Val 15 16 0.0 5.1 28 00 0.0 95 Tot 93 20 al 2.1 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Str 0.0 X ept Ac 0.0 X oru Eu 0.0 X odi Xi 10 X di La 10 X nta 83 X Ca 11 X la 33 Ci 18 X pro flo d V.parahaemolyticus ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 50 tw 4.4 Wi 3.3 14 thi 33 Tot 50 20 al 7.8 Me F- Pan Ra Val 84 35 0.0 07 3.1 00 0.2 38 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La nta Xi di Ci pro 0.0 X 10 X 33 11 X 33 C.6 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn khác a P aeruginosa ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 59 tw 2.7 Wi 1.8 14 thi 33 Tot 59 20 al 4.5 Me F- Pan Ra Val 98 75 0.0 78 4.3 00 0.1 30 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo ge Ac 0.0 ne X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 11 X di 33 Ci 12 X pro 16 b S.aureus ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 60 tw 0.2 Wi 1.1 14 thi 66 Tot 60 20 al 1.4 Me F- Pan Ra Val 10 12 0.0 0.0 00 00 0.0 83 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 11 X di 66 Ci 12 X pro c E.feacalis ANOVA Table for GIA TRI by CAY So Su Df urc m Be 56 tw 7.4 Wi 0.3 14 thi 33 Tot 56 20 al 7.7 Me F- Pan Ra Val 94 39 0.0 57 72 00 0.0 23 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CA Co Me Ho Y unt an mo Ac 0.0 X oru Ca 0.0 X la Eu 0.0 X odi Str 0.0 X ept La 0.0 X nta Xi 11 X di 16 Ci 11 X pr 83 PHỤ LỤC C: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG Q TRÌNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC C.1 Thử nghiệm định tính Carbohydrate  Molisch: Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml  Feling: Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất  Barfoed: Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất, cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate, dun khuấy đến tan hoàn toàn C.2 Thử nghiệm định tính Alkaloid  Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 60ml nước, sau đổ vào dung dịch g KI pha 10ml nước Sau định mức lên 100 ml  Dragendroff gồm dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha nước Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nước  Hager:Thuốc thử Hager: Hòa tan g acid picric vào 100ml nước cất  Wagner:Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine 6g KI vào 100ml nước cất C.3 Thử nghiệm định tính Cardiac glycosides  Legal: Thuốc thử Na nitro prusside: g Na nitroferricyanide bổ sung 10 ml nước cất ... tài: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn số loại cao chiết ethanol 70% từ môt sô loai thực vật vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số loại. .. hiệu suất thu hồi từ thuốc dân gian - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% thuốc dân gian - Xác định thành phần hoá học cao chiết ethanol 70% số loại thuốc dân gian 10 Đồ án tốt... loại thuốc dân gian với dung môi ethanol 70% - Xác định thành phần hố học có số loại cao chết ethanol 70% từ thuốc dân gian Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng dung môi ethanol 70% đến hiệu