Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia catappa)

Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO GVHD: DỤC VÀ ThS ĐÀO Phạm TẠOMinh Nhựt TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100019 : Trần Thị Tuyết Dung Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOMinh Nhựt GVHD: ThS Phạm TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100019 : Trần Thị Tuyết Dung Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm…… Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt LỜI CẢM ƠN Con xin khắc ghi công ơn cha mẹ người thân nuôi dưỡng giáo dục nên người Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh - Khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh - Cơ chủ nhiệm, Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học Đã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài Tôi xin chân thành biết ơn: Ths Phạm Minh Nhựt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian công sức để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Chân thành cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm…… Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bàng 1.1.1 Sơ lược nguồn tài nguyên thực vật nước ta .3 1.1.2 Sơ lược bàng 1.1.3 Công dụng bàng 1.2 Đại cương số hợp chất hữu tự nhiên từ thực vật 1.2.1 Carbohydrate .6 1.2.2 Alkaloid .7 1.2.3 Glycoside 1.3 Tổng quan chế kháng khuẩn hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 18 1.3.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn .18 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 18 1.3.3 Một số hợp chất có khả kháng khuẩn từ thực vật 21 1.3.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam 26 1.3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 29 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt 1.4 Ảnh hưởng dung môi đến khả tách chiết cao từ thực vật 30 1.5 Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 31 1.5.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli .31 1.5.2 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp 32 1.5.3 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 34 1.5.4 Nhóm vi khuẩn Listeria spp .35 1.5.5 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 36 1.5.6 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp 37 1.5.7 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp 38 1.5.8 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus aureus 39 1.6 Sơ lược vi khuẩn V.alginolyticus 40 1.6.1 Phân loại khoa học 40 1.6.2 Đặc điểm hình thái 40 1.6.3 Đặc điểm phân bố 41 1.6.4 Khả gây bệnh 42 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .44 2.1 Địa điểm thời gian thực 44 2.1.1 Địa điểm 44 2.1.2 Thời gian .44 2.2 Vật liệu .44 2.2.1 Vật liệu: ………………………………………………………………………… 44 2.2.2 Vi khuẩn thị .44 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 44 2.3.3 Hóa chất, dung mơi 45 2.4 Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu .46 2.4.2 Phương pháp thu nhận cao thực vật xác định hiệu suất thu hồi 46 2.4.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh 47 2.4.4 Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật thị 48 2.4.5 Phương pháp pha loãng mẫu 48 ii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt 2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 49 2.4.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC .50 2.4.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học cao chiết .51 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu .54 2.5 Bố trí thí nghiệm 54 2.5.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ bàng dung mơi ethanol 70% 56 2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 57 2.5.3 Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) TcEE chủng vi khuẩn gây bệnh .58 2.5.4 Thí nghiệm 4: Định tính số thành phần hóa học TcEE .60 2.5.5 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng cao chiết đến vi khuẩn V alginolyticus theo thời gian 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .65 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi TcEE 65 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE chủng vi khuẩn thị 65 3.2.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE đối nhóm vi khuẩn Escherichia coli .66 3.2.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Listeria spp .67 3.2.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Samonella spp 68 3.2.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Shigella spp 69 3.2.5 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Virio spp 71 3.2.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da 72 3.2.7 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) TcEE 20 vi khuẩn thị 73 3.3 Kết định tính số thành phần hóa học TcEE 77 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng TcEE đến vi khuẩn V alginolyticus .79 iii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 83 4.1 Kết luận .83 4.2 Đề nghị .83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 iv Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth TcEE: Cao chiết Ethanol 70% từ bàng v Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Chức sinh lý số amino acid trình trao đổi chất 17 Bảng 1.2 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 20 Bảng 3.1 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung môi ethanol 70% 20 vi khuẩn thị 74 Bảng 3.2 Kết định tính thành phần hóa học TcEE 77 vi Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 14.667 NĐ 200 mg/ml A 13.000 NĐ 150 mg/ml A 12.767 NĐ 100 mg/ml A 12.500 Ciprofloxacin C.3.4 S Typhimurium HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 68.32250000 22.77416667 12.21 0.0024 Error 14.92666667 1.86583333 Corrected Total 11 83.24916667 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 16.667 NĐ 200 mg/ml A 14.000 NĐ 150 mg/ml B 11.000 Ciprofloxacin B 10.900 NĐ 100 mg/ml B 11 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.4 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung mơi ethanol 70% nhóm vi khuẩn Shigella spp C.4.1 S Boydii HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 43.5088889 21.7544444 2.11 0.2023 Error 61.8600000 10.3100000 Corrected Total 105.3688889 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 14.333 NĐ 200 mg/ml A 13.567 NĐ 100 mg/ml A 9.333 NĐ 150 mg/ml C.4.2 S Flexneri HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 39.70916667 13.23638889 10.57 0.0037 Error 10.02000000 1.25250000 Corrected Total 11 49.72916667 12 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 14.6667 NĐ 200 mg/ml A 14.4333 NĐ 150 mg/ml A 13.1667 Ciprofloxacin B 10.1000 NĐ 50 mg/ml C.4.3 S Sonnei HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1237.970667 309.492667 36.75 F Model 97.2440000 24.3110000 9.85 0.0017 Error 10 24.6933333 2.4693333 Corrected Total 14 121.9373333 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 16.667 NĐ 200 mg/ml A 16.167 NĐ 150 mg/ml B A 15.000 Ciprofloxacin B C 12.100 NĐ 100 mg/ml C 10.000 NĐ 50 mg/ml C.5.2 V Cholerae HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 77.1106667 19.2776667 7.62 0.0044 Error 10 25.2933333 2.5293333 Corrected Total 14 102.4040000 14 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 16.000 NĐ 200 mg/ml B A 13.667 NĐ 150 mg/ml B A C 13.333 Ciprofloxacin C 10.900 NĐ 100 mg/ml C 9.500 NĐ 50 mg/ml B C.5.3 V Harveyi HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 68.76000000 22.92000000 36.48 F Model 16.58916667 5.52972222 7.14 0.0119 Error 6.19333333 0.77416667 Corrected Total 11 22.78250000 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 15.0000 NĐ 200 mg/ml A 14.3333 NĐ 150 mg/ml B 12.6000 NĐ 100 mg/ml B 12.1667 Ciprofloxacin C.6 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung môi ethanol 70% nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da C.6.1 P aeruginosa HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16.58916667 5.52972222 7.14 0.0119 Error 6.19333333 0.77416667 Corrected Total 11 22.78250000 16 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 15.0000 NĐ 200 mg/ml A 14.3333 NĐ 150 mg/ml B 12.6000 NĐ 100 mg/ml B 12.1667 Ciprofloxacin C.6.2 S Aureus HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 47.08333333 15.69444444 7.69 0.0096 Error 16.33333333 2.04166667 Corrected Total 11 63.41666667 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 17.000 NĐ 200 mg/ml B 12.667 NĐ 150 mg/ml B 12.500 NĐ 100 mg/ml B 12.167 Ciprofloxacin 17 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.6.3 E Feacalis HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 41.77066667 10.44266667 11.00 0.0011 Error 10 9.49333333 0.94933333 Corrected Total 14 51.26400000 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Cao A 16.0000 NĐ 200 mg/ml B 12.2667 NĐ 100 mg/ml B 12.0000 Ciprofloxacin B 12.0000 NĐ 50 mg/ml B 11.3333 NĐ 150 mg/ml 18 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt PHỤ LỤC D CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ  Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α – napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml  Thuốc thử Fehling Thuốc tử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O hòa tan hồn tồn nước cất, sau tiếp tục định mức đến 500 ml Thuốc thử Fehling B: hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào nước cất định mưc 500 ml  Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gốm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất Hỗn hợp mang đun khuấy tan hoàn tồn  Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,358g HgCl2 60ml nước cất Tiếp tục cân 5g KI hòa tan 10ml nước cất Sau tiến hành trộn dung dịch lại với định mức nước cất đến 100ml  Thuốc thử Dragendroff: gồm dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan nước cất Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70 ml nước cất  Thuốc thử Hager Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất, sau lọc dung dịch thu dịch lọc 19 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt  Thuốc thử WaGner Hòa tan 2g I2 6g KI vào nước cất định mức đến 100 ml Thuốc thử dung dịch tan hoàn toan, tránh tiếp xúc ánh sáng  Natri nitro prusside Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất 20 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt PHỤ LỤC E HÌNH ẢNH KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG TỪ ETHANOL 70% E.1 Mẫu bàng dung dịch chiết A Hình A Mẫu bàng khơ B C Hình B Mẫu bàng khơ ngâm mơi ethanol 70%; Hình C Dịch chiết lần 21 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt D E Hình D Dịch chiết lần Hình E Dịch chiết lần E.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn F G Hình F Đĩa trang vi khuẩn Hình G Đĩa hút TcEE I H Hình H Vòng kháng khuẩn V alginolyticus 22 Hình I Vòng kháng khuẩn S boydii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt E.3 Kết dương tính với thành phần hóa học - Kết dương tính với carbohydrate J K L Hình J Thử nghiệm Molisch test; Hình K Thử nghiệm Fehling test; Hình L Thử nghiệm Barfoed’s test - Kết dương tính với thử nghiệm xác định saponin M Hình M Thử nghiệm Foam test 23 Đồ án tốt nghiệp - GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Kết dương tính với thử nghiệm xác định Cardiac glycoside N Hình N Thử nghiệm Legal’s test - Kết dương tính với thử nghiệm xác định Phenolic compound O Hình O Thử nghiệm Gelatin test 24 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt E.4 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết bàng từ ethanol 70% đến vi khuẩn V Alginolyticus R S Hình R Khuẩn lạc V.alginolyticus 10-2 Hình S Khuẩn lạc V.alginolyticus 10-4 T U Hình T Khuẩn lạc V.alginolyticus 10-5 Hình R Khuẩn lạc V.alginolyticus 10-6 25 ... đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ bàng - Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn cao chiết bàng theo thời gian Phạm vi nghiên cứu - Chỉ tách chiết cao bàng dung môi ethanol 70% - Đánh giá. .. nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOMinh Nhựt GVHD: ThS Phạm TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa). .. 68 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Shigella spp 70 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Virio spp 71 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn gây bệnh