Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (terminalia catappa)​

Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁOGVHD:ỤC VÀThSĐÀO.Ph ạTẠmOMinh Nhựt TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100019 : Trần Thị Tuyết Dung Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁOGVHD:ỤCVÀThSĐÀO.PhTẠạmOMinh Nhựt TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1311100019 : Trần Thị Tuyết Dung Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm…… Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt LỜI CẢM ƠN Con xin khắc ghi công ơn cha mẹ người thân nuôi dưỡng giáo dục nên người Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh - Cơ chủ nhiệm, Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học Đã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành đề tài Tơi xin chân thành biết ơn: Ths Phạm Minh Nhựt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian công sức để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo điều kiện tốt cho hồn thành khóa luận Chân thành cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm…… Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bàng 1.1.1 Sơ lược nguồn tài nguyên thực vật nước ta 1.1.2 Sơ lược bàng 1.1.3 Công dụng bàng 1.2 Đại cương số hợp chất hữu tự nhiên từ thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.2 Alkaloid 1.2.3 Glycoside 1.3 Tổng quan chế kháng khuẩn hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 18 1.3.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 18 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 18 1.3.3 Một số hợp chất có khả kháng khuẩn từ thực vật 21 1.3.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam 26 1.3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 29 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt 1.4 Ảnh hưởng dung môi đến khả tách chiết cao từ thực vật 30 1.5 Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 31 1.5.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 31 1.5.2 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp 32 1.5.3 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 34 1.5.4 Nhóm vi khuẩn Listeria spp 35 1.5.5 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 36 1.5.6 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp 37 1.5.7 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Enterococcus spp 38 1.5.8 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Staphylococcus aureus 39 1.6 Sơ lược vi khuẩn V.alginolyticus 40 1.6.1 Phân loại khoa học 40 1.6.2 Đặc điểm hình thái 40 1.6.3 Đặc điểm phân bố 41 1.6.4 Khả gây bệnh 42 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Địa điểm thời gian thực 44 2.1.1 Địa điểm 44 2.1.2 Thời gian 44 2.2 Vật liệu 44 2.2.1 Vật liệu: ………………………………………………………………………… 44 2.2.2 Vi khuẩn thị 44 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 44 2.3.3 Hóa chất, dung mơi 45 2.4 Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 46 2.4.2 Phương pháp thu nhận cao thực vật xác định hiệu suất thu hồi 46 2.4.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh 47 2.4.4 Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật thị 48 2.4.5 Phương pháp pha loãng mẫu 48 ii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt 2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 49 2.4.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 50 2.4.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học cao chiết 51 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 54 2.5 Bố trí thí nghiệm 54 2.5.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ bàng dung môi ethanol 70% 56 2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 57 2.5.3 Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) TcEE chủng vi khuẩn gây bệnh 58 2.5.4 Thí nghiệm 4: Định tính số thành phần hóa học TcEE 60 2.5.5 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng cao chiết đến vi khuẩn V alginolyticus theo thời gian 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi TcEE 65 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE chủng vi khuẩn thị 65 3.2.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE đối nhóm vi khuẩn Escherichia coli 66 3.2.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Listeria spp 67 3.2.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Samonella spp 68 3.2.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Shigella spp 69 3.2.5 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Virio spp 71 3.2.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da 72 3.2.7 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) TcEE 20 vi khuẩn thị 73 3.3 Kết định tính số thành phần hóa học TcEE 77 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng TcEE đến vi khuẩn V alginolyticus .79 iii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 83 4.1 Kết luận 83 4.2 Đề nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 iv Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth TcEE: Cao chiết Ethanol 70% từ bàng v Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Chức sinh lý số amino acid trình trao đổi chất 17 Bảng 1.2 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 20 Bảng 3.1 Tổng hợp kết hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung môi ethanol 70% 20 vi khuẩn thị 74 Bảng 3.2 Kết định tính thành phần hóa học TcEE 77 vi Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.4 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung mơi ethanol 70% nhóm vi khuẩn Shigella spp C.4.1 S Boydii HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A C.4.2 S Flexneri HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total 12 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A B C.4.3 S Sonnei HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B B 13 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.5 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung mơi ethanol 70% nhóm vi khuẩn Virio spp C.5.1 V Alginolyticus HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total C.5.2 V Cholerae Source Model Error Corrected Total 14 Đồ án tốt nghiệp t B B B C.5.3 V Harveyi HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B C C 15 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.5.4 V Parahaemolyticus HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A B B C.6 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết bàng từ dung mơi ethanol 70% nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da C.6.1 P aeruginosa HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total 16 Đồ án tốt nghiệp t A A B B C.6.2 S Aureus HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B 17 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt C.6.3 E Feacalis HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN The ANOVA Procedure Source Model Error Corrected Total Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B B 18 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt PHỤ LỤC D CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ  Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α – napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml  Thuốc thử Fehling Thuốc tử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O hịa tan hồn tồn nước cất, sau tiếp tục định mức đến 500 ml Thuốc thử Fehling B: hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H 2O vào nước cất định mưc 500 ml  Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gốm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất Hỗn hợp mang đun khuấy tan hồn tồn  Thuốc thử Mayer Hịa tan 1,358g HgCl2 60ml nước cất Tiếp tục cân 5g KI hịa tan 10ml nước cất Sau tiến hành trộn dung dịch lại với định mức nước cất đến 100ml  Thuốc thử Dragendroff: gồm dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan nước cất Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70 ml nước cất  Thuốc thử Hager Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất, sau lọc dung dịch thu dịch lọc 19 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt  Thuốc thử WaGner Hòa tan 2g I2 6g KI vào nước cất định mức đến 100 ml Thuốc thử dung dịch tan hoàn toan, tránh tiếp xúc ánh sáng  Natri nitro prusside Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất 20 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt PHỤ LỤC E HÌNH ẢNH KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG TỪ ETHANOL 70% E.1 Mẫu bàng dung dịch chiết A Hình A Mẫu bàng khơ B Hình B Mẫu bàng khơ ngâm mơi ethanol 70%; Hình C Dịch chiết lần 21 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt D Hình D Dịch chiết lần E.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn F Hình F Đĩa trang vi khuẩn H Hình H Vịng kháng khuẩn V alginolyticus 22 Hình I Vịng kháng khuẩn S boydii Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt E.3 Kết dương tính với thành phần hóa học - Kết dương tính với carbohydrate J Hình J Thử nghiệm Molisch test; Hình K Thử nghiệm Fehling test; Hình L Thử nghiệm Barfoed’s test - Kết dương tính với thử nghiệm xác định saponin M Hình M Thử nghiệm Foam test 23 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt - Kết dương tính với thử nghiệm xác định Cardiac glycoside N Hình N Thử nghiệm Legal’s test - Kết dương tính với thử nghiệm xác định Phenolic compound O Hình O Thử nghiệm Gelatin test 24 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt E.4 Kết khảo sát ảnh hưởng cao chiết bàng từ ethanol 70% đến vi khuẩn V Alginolyticus R -2 -4 -5 -6 Hình R Khuẩn lạc V.alginolyticus 10 Hình S Khuẩn lạc V.alginolyticus 10 T Hình T Khuẩn lạc V.alginolyticus 10 Hình R Khuẩn lạc V.alginolyticus 10 25 ... đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ bàng - Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn cao chiết bàng theo thời gian Phạm vi nghiên cứu - Chỉ tách chiết cao bàng dung môi ethanol 70% - Đánh giá. .. nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ loại dịch chiết ethanol, methanol phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol methanol từ Nhàu kết cho thấy loại dung mơi cho hoạt tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn khảo... Hình 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Escherichia coli 66 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Listeria spp .67 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn TcEE nhóm vi khuẩn Samonella