Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại vườn quốc gia bidoup núi bà, tỉnh lâm đồng​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực : Trịnh Tuấn Anh MSSV: 1211100332 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan tất nội dung đồ án trực tiếp thực hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực vào chưa công bố hình thức Mọi tài liệu tham khảo dùng đồ án trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm công bố Những số liệu bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá thu thập từ nhiều nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo thích nguồn gốc Tất nội dung, chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trịnh Tuấn Anh năm 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, thầy giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm Môi trường quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em trình học tập trường Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt tận tâm hướng dẫn chúng em qua buổi học lớp buổi nói chuyện, thảo luận lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học Môi trường Thực phẩm trường Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em Điều không giúp em thực đồ án tốt mà cịn tảng kiến thức cho công việc sau Em cảm ơn bạn, anh, chị hỗ trợ giúp đỡ em thời gian thực đề tài phịng thí nghiệm Cuối cùng, em xin cảm ơn thầy cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Do kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên đồ án tốt nghiệp em cịn nhiều thiếu sót, mong thầy dạy đề em hoàn thiện đồ án tốt thu nhận thêm kiến thức Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đế thầy cô Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên Trịnh Tuấn Anh năm 2016 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Nội dung Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu 1.1.1 Vai trò thuốc đời sống 1.1.2 Lợi ích sử dụng thuốc 1.1.3 Tình hình sử dụng thuốc 1.2 Thành phần hóa học thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.2 Amino acid 1.2.3 Alkaloid 1.2.4 Glycosides Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Steroids 1.2.6 Tannin 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 1.3 Tổng quan hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.3.3 Phenol đơn acid phenolic 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thời gian 2.1.1 Địa diểm 2.1.2 Thời gian 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 2.2.2 Vi sinh vật thị 2.2.3 Hóa chất, mơi trường 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật thị 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào VSV đo mật độ quang 2.3.4 Phương pháp bảo quản giữ giống 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh 2.3.7 Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method) 40 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.10 Amino acid 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 45 2.4 Bố trí thí nghiệm 46 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% mẫu thuốc 47 2.4.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 49 2.4.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học 50 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi 52 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% từ mẫu khảo sát 53 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 53 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria 54 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella 55 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella 57 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 59 3.3 Kết xác định thành phần hoá học 63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 Kết luận 65 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Đồ án tốt nghiệp DANH MUCC̣ HÌNH ẢNH Hình 1.2 Cấu trúc phân tử loại Carbonhydrate Hình 1.3.Alanine Hình 1.4 Epherdin Hyoscyamin Hình 1.5 Cardenolic Bufadiennolid Hình 1.6 Steroid Hình 1.7 Tannin Hình 1.8 Limonene Ocimene Hình 1.9 Một số chế kháng sinh Hình 1.10 Solamargine Hình 1.11 Berberine Hình 1.12.Một số Terpenenes Terpenoid Hình 1.13.Một số Quinones thơng thường Hình 1.14 Gallotannin Hình 1.15 Một số Flavonoid Hình 1.16 Saponin Hình 1.17 Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 kính hiển vi Hình 1.18 Ảnh chụp Shigella sp mẫu phân Hình 1.19 Hình ảnh S typhii S typhimurium Hình 1.20 Hình ảnh Vibrio cholerae Vibrio harvey Hình 1.21 Hình ảnh Listeria monocytogenes Hình 1.22 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa Hình 1.24 Hình ảnh Enterococcus feacalis Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu Hình 3.1 Hiệu xuất tách chiết ethanol 70% với mẫu thuốc Hình 3.2 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Escherichia coli Hình 3.3 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Listeria Hình 3.4 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Salmonella Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Shigella 57 Hình 3.6 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm Vibrio 58 Hình 3.7 Kết đối kháng cao chiết ethanol 70% mẫu khác nhóm vi sinh gây bệnh 59 Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO : Dung môi dimethysufoside TSA : môi trường Tryptone casein soy agar TSB : môi trường Trypticase Soy Broth Đồ án tốt nghiệp b S.flexneri Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Lantana sp Calamus Streptocaulon sp Acorus sp Euodia s Xidi Klung Ciprofloxacin c S.sonnei Source Between groups Within groups Total (Corr.) 11 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp Lantana sp Xidi Klung Ciprofloxacin C.5 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn Vibrio a V.alginolyticus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp 12 Đồ án tốt nghiệp Lantana sp Xidi Klung Ciprofloxacin b V.Cholerae Source Between groups Within groups Total (Corr.) CAY Calamus sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon sp Lantana sp Ciprofloxacin Xidi Klung c V.harveyi Source Between groups Within groups Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) CAY Streptocaulon sp Acorus sp Euodia sp Xidi Klung Lantana Calamus sp Ciprofloxacin d V.parahaemolyticus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp 14 Đồ án tốt nghiệp Lantana sp Xidi Klung Ciprofloxacin C.6 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn loại cao chiết nhóm vi khuẩn khác a P aeruginosa Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp Lantana sp Xidi Klung Ciprofloxacin 15 Đồ án tốt nghiệp b S.aureus Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp Lantana s Xidi Klung Ciprofloxacin c E.feacalis Source Between groups Within groups Total (Corr.) 16 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Acorus sp Calamus sp Euodia sp Streptocaulon sp Lantana s Xidi Klung Ciprofloxacin 17 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG QUÁ TRÌNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC C.1 Thử nghiệm định tính Carbohydrate  Molisch: Thuốc thử Molisch: Hịa tan 5g α napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml  Feling: Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất  Barfoed: Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất, cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate, dun khuấy đến tan hồn tồn C.2 Thử nghiệm định tính Alkaloid  Mayer: Hịa tan 1,358g HgCl2 60ml nước, sau đổ vào dung dịch g KI pha 10ml nước Sau định mức lên 100 ml  Dragendroff gồm dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha nước Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nước  Hager:Thuốc thử Hager: Hòa tan g acid picric vào 100ml nước cất  Wagner:Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine 6g KI vào 100ml nước cất C.3 Thử nghiệm định tính Cardiac glycosides  Legal: Thuốc thử Na nitro prusside: g Na nitroferricyanide bổ sung 10 ml nước cất 18 ... tài: ? ?Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn số loại cao chiết ethanol 70% từ môṭsốloa? ?thực vật vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số loại thuốc... suất thu hồi từ thuốc dân gian Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% thuốc dân gian Xác định thành phần hoá học cao chiết ethanol 70% số loại thuốc dân gian 10 Đồ án tốt nghiệp... Tổng quan hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.3.3