Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (lactuca indica l )​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HỐ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ CÂY BỒ CƠNG ANH (Lactuca indica L.) Ngành: CÔNG NGHÊ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực MSSV: 1311100787 : ĐỒN LÊ THẢO TRANG Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Sau trình học tập, nghiên cứu khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm Môi trường trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, em tiếp thu nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu nhờ giảng dạy, hướng dẫn tận tình thầy cô môn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người giúp đỡ, định hướng tận tình hướng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn thầy truyền đạt cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu để hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học HUTECH, quý thầy cô giảng dạy làm việc Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường truyền dạy nhiều kiến thức tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè anh chị ln bên cạnh động viên giúp đỡ em vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu bồ công anh (Lactuca indica L) 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật học bồ công anh 1.1.3 Thành phần hóa học bồ công anh 1.1.4 Công dụng 19 1.2 Tổng quan chế kháng khuẩn hợp chất có nguồn gốc thực vật .20 1.2.1 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 20 1.2.2 Những hợp chất kháng khuẩn điển hình thực vật .22 1.3 Đại cương số nhóm vi khuẩn gây bệnh 27 1.3.1 Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 27 1.3.1.1 Các vi khuẩn thuộc nhóm Escherichia Coli 27 1.3.1.2 Các vi khuẩn thuộc nhóm Samonella spp 29 1.3.1.3 Các vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp 30 1.3.1.4 Các vi khuẩn thuộc nhóm Shigella spp 31 1.3.1.5 Các vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp 31 1.3.2 Nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da 32 1.4 Hoạt tính chống oxi hóa 36 1.4.1 Khái niệm gốc tự 36 1.4.2 Lợi ích gốc tự thể 36 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Tác hại gốc tự thể 37 1.4.4 Chất chống oxy hóa thực vật 38 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Địa điểm thời gian 39 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 39 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 39 2.2 Vật liệu 39 2.2.1 Nguồn mẫu 39 2.2.2 Vi khuẩn thị 39 2.2.3 Hóa chất, dung mơi 39 2.2.4 Thiết bị dụng cụ 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 41 2.3.2 Phương pháp tách chiết thu nhận cao thực vật 41 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 41 2.3.4 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật thị 42 2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 43 2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 43 2.3.7 Phương pháp xác định khả kháng oxy hóa dịch chiết 44 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học có cao chiết 46 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 49 2.4 Bố trí thí nghiệm 50 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh 51 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn LiEE 53 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả oxy LiEE 54 2.4.4 Thí nghiệm 4: Định tính số thành phần hóa học LiEE 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 Kết hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% từ Bồ công anh (LiEE) 58 iv Đồ án tốt nghiệp 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn LiEE vi khuẩn thị 59 3.2.1 Kết hoạt tính kháng nhóm E.coli LiEE 59 3.2.2 Kết hoạt tính kháng nhóm Salmonella LiEE 60 3.2.3 Kết hoạt tính kháng nhóm Shigella LiEE 61 3.2.4 Kết hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp LiEE 63 3.2.5 Kết hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác LiEE 64 3.2.6 Tổng hợp kết kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Bồ Công anh vi khuẩn thị 66 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hố cao chiết ethanol từ Bồ Cơng anh 67 3.3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hố dựa loại bỏ gốc tự DPPH vitamin C 67 3.3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá LiEE 69 3.4 Kết xác định sơ thành phần hoá học LiEE 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Thân hoa bồ công anh Hình 1.2: Sơ đồ phân loại carbohydrate theo nhóm .6 Hình 1.3: Một vài disaccharide tiêu biểu Hình 1.4: Các polysaccharide thường gặp thực vật A) amylose, B) amylopectin, C) cellulose, D) chitin Hình 1.5: Cấu trúc hóa học số chất thuộc nhóm alkaloid 13 Hình 1.6: Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013) 15 Hình 1.7: Một số euflavonoid thường gặp 17 Hình 1.8: Một số chất thuộc nhóm steroid thường gặp 18 Hình 1.9: Sơ đồ phân loại tannin 19 Hình 1.10: Vị trí hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên vi khuẩn 22 Hình 1.11: Cấu trúc hóa học phân tử Solamargine 23 Hình 1.12: Cấu trúc hóa học phân tử: quinone (A); anthraquinone (B); hypericin (C) 24 Hình 1.13: Cấu trúc hóa học phân tử capsaicin 26 Hình 1.14: Methol từ bạc hà (Nguyễn Tiến Thắng, 2012) .26 Hình 1.15: E.coli quan sát kính hiển vi với kích thước µm (Bact, 2005) 28 Hình 1.16: Vi khuẩn Salmonella typhi (Nguyễn Thúy Hương, 2011) 29 Hình 1.17: Vi khuẩn V cholerae (Nguyễn Thúy Hương, 2011) 26 Hình 1.18: Hình thái vi khuẩn Shigella spp (Reynolds, 2011) 31 Hình 1.19: Vi khuẩn Listeria spp 32 Hình 1.20: Vi khuẩn Pseudomonas 33 Hình 1.21: Vi khuẩn Enterococcus 34 Hình 1.22: Vi khuẩn Staphylococus aureus 35 Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 44 Hình 2.2: Phản ứng trung hịa gốc DPPH 45 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 50 Hình 2.4: Quy trình tách chiết thu hồi cao từ Lactuca indica L 51 Hình 2.5: Mẫu bồ cơng anh 52 Hình 2.7: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 55 Hình 2.8: Quy trình định tính số thành phần hóa học LiEE 56 Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Công Anh (LiEE) 58 Hình 3.2: Đường kính vịng ức chế LiEE nồng độ khác E.coli 59 Hình 3.3: Đường kính vịng ức chế LiEE nồng độ khác Salmonella 61 Hình 3.4: Đường kính vịng ức chế LiEE nồng độ khác Shigella 62 Hình 3.5: Đường kính vịng ức chế LiEE nồng độ khác Vibrio 63 Hình 3.6: Đường kính vòng ức chế LiEE nồng độ khác chủng vi khuẩn thị khác 65 Hình 3.7: Đường chuẩn khảo sát khả kháng oxy hố vitamin C 68 Hình 3.8: Khả bắt gốc tự DPPH LiEE nồng độ khác 69 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Chức sinh lý số amino acid trình trao đổi chất Bảng 3.1: Kết đường kính vịng ức chế (mm) LiEE từ nồng độ khác 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 66 Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C nồng độ cao chiết khảo sát 67 Bảng 3.3: Hiệu loại bỏ 50% gốc tự LiEE vitamin C 71 Bảng 3.4: Kết định tính số thành phần hóa học LiEE 72 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypticase Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl sulfoxide LiEE: Lactuca indica L ethanolic extract NA: Non Activity DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl RNA: Ribonucleic Acid DNA: Deoxyribonucleic Acid ix Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for KK by LISINNO Means with the same letter are not significantly different LISINNO CIP ND200 ND100 ND50 B.2.2 L Monocytogene Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for LISMONO.KK by LISMONO Means with the same letter are not significantly different LISMONO CIP ND200 ND100 ND50 Đồ án tốt nghiệp B.3 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn LiEE nhóm vi khuẩn Salmonella spp B.3.1 S enteritidis The ANOVA Procedure Table for SENTER.KK by SENTER Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SENTER.KK by SENTER Means with the same letter are not significantly different SENTER CIP ND200 ND100 ND50 B.3.2 S typhii The ANOVA Procedure Table for STYPHI(K).KK by STYPHI Source Model Error Total (Corr.) Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for STYPHI(K).KK by STYPHI Means with the same letter are not significantly different STYPHI ND200 CIP ND100 ND50 B.4 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn LiEE nhóm vi khuẩn Shigella spp B.4.1.S boydii The ANOVA Procedure Table for SHIBOYDII.KK by SHIBOYDII Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHIBOYDII.KK by SHIBOYDII Means with the same letter are not significantly different SHIBOYDII ND100 ND200 ND50 CIP Đồ án tốt nghiệp B.4.2 S flexneri The ANOVA Procedure Table for SHIFLEXNERI.KK by SHIFLEX Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHIFLEXNERI.KK by SHIFLEX Means with the same letter are not significantly different SHIFLEX ND200 CIP ND100 ND50 B.4.3 S sonnei The ANOVA Procedure Table for SHISONNEI.KK by SHISONNEI Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHISONNEI.KK by SHISONNEI Means with the same letter are not significantly different SHISONNEI CIP ND200 ND50 Đồ án tốt nghiệp ND100 B.5 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn LiEE nhóm vi khuẩn Vibrio spp B.5.1 V algino The ANOVA Procedure Table for VALGINO.KK by VALGINO Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VALGINO.KK by VALGINO Means with the same letter are not significantly different VALGINO CIP ND200 ND100 ND50 B.5.2 V Harveyi The ANOVA Procedure Table for VHARVEYI.KK by VHARVEYI Source Model Error Total (Corr.) 10 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VHARVEYI.KK by VHARVEYI Means with the same letter are not significantly different VHARVEYI CIP ND200 ND100 ND50 B.5.3.V.para The ANOVA Procedure Table for VPARA.KK by VPARA Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VPARA.KK by VPARA Means with the same letter are not significantly different VPARA ND200 ND100 CIP ND50 11 Đồ án tốt nghiệp B.6 Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn LiEE nhóm vi khuẩn gây bệnh hội da B.6.1 P aeruginosa The ANOVA Procedure Table for PSEU.KK by PSEU Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for PSEU.KK by PSEU Means with the same letter are not significantly different PSEU CIP ND200 ND100 ND50 B.6.2 S aureus The ANOVA Procedure Table for SAUREUS.KK by SAUREUS Source Model Error Total (Corr.) 12 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SAUREUS.KK by SAUREUS Means with the same letter are not significantly different SAUREUS ND200 CIP ND100 ND50 B.6.3 E.feacalis The ANOVA Procedure Table for EFEACALIS.KK by EFEACALIS Source Model Error Total (Corr.) Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for EFEACALIS.KK by EFEACALIS Means with the same letter are not significantly different EFEACALIS ND200 CIP ND100 ND50 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ C.1 Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml C.2 Thuốc thử Fehling - Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O hòa tan hồn tồn vào nước cất, sau tiếp tục định mức đến 500ml - Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào nước cất định mức 500ml C.3 Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml acid acetic glacial 1000ml nước cất Hỗn hợp mang đun khuấy đến tan hoàn toàn C.4 Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 60ml nước cất Tiếp tục cân 5g KI hòa tan 10ml nước cất Sau tiến hành trộn dung dịch lại với định mức nước cất đến 100 ml C.5 Thuốc thử Dragendorff: Gồm dung dịch: - Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% - Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan nước cất Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nước cất C.6 Thuốc thử Hager Hòa tan g acid picric vào 100ml nước cất, sau tiến hành lọc dung dịch thu dịch lọc C.7 Thuốc thử Wagner Hòa tan 2g I2 6g KI vào nước cất định mức đến 100ml Thuốc thử dung dịch tan hoàn toàn, tránh tiếp xúc ánh sáng C.8 Natri nitro prusside Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D MỘT SỐ HÌNH ẢNH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC D.1 Thử nghiệm xác định carbohydrate: Molisch A D.2 Thử nghiệm xác định alkaloid saponin: Wagner D 15 Đồ án tốt nghiệp D.3 Thử nghiệm xác định flavonoid Xác định flavonoid Alkaline F D.4 Thử nghiệm xác định hợp chất phenolic steroid: H 16 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM KHÁNG KHUẨN E.1 Vòng kháng khuẩn nồng độ 100 mg/ml A C A: Vibiro harveyi B: Listeria innocua C: Escheriachia coli O157:H7 D: Shigella flexneri E.2 Vòng kháng khuẩn nồng độ 200 mg/ml E 17 Đồ án tốt nghiệp G I E: Vibiro alginolyticus F: Listeria monocytogenes G: Escheriachia coli 0208 H: Salmonella enteritidis I: K: Pseudomonas aeruginosa Shigella sonnei 18 ... khả kháng khuẩn cao chiết Lactuca indica L Khảo sát số hoạt tính sinh học từ cao chiết từ ethanol bồ công anh - (Lactuca indica L) - Xác định sơ thành phần hóa học cao chiết ethanol từ bồ công anh. .. hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác LiEE 64 3.2.6 Tổng hợp kết kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Bồ Công anh vi khuẩn thị 66 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hố cao chiết ethanol. .. Tách chiết cao từ bồ công anh ethanol 70% - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết - Xác định sơ thành phần hóa học cao chiết Phạm vi nghiên cứu - Chỉ khảo sát hoạt tính