nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn e coli của lá gai (boehmeria nivea)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG KHUẨN E coli CỦA LÁ GAI (Boehmeria nivea) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: ThS Tạ Đăng Khoa SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi MSSV: 1053010939 Khóa: 2010 – 2014 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa MỤC LỤC Phần I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây gai (Boehmeria nivea) [9, 11] 2.1.1 Đặc điểm thực vật 2.1.2 Thành phần hóa học 2.1.3 Công dụng gai 10 2.2 Quá trình chống oxy hóa [2, 10, 19, 20, 21] 10 2.2.1 Gốc tự 10 2.2.2 Cơ chế chống oxy hóa 14 2.2.3 Các chất chống oxy hóa 15 2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết 22 2.2.4.1 Phương pháp TEAC 22 2.2.4.2 Phương pháp DPPH 22 2.2.4.3 Phương pháp ORAC 23 2.2.4.4 Phương pháp TRAP 23 2.2.4.5 Phương pháp FRAP 24 2.3 Phương pháp trích ly 24 2.3.1 Các phương pháp trích ly [3] 24 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang i Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa 2.3.2 Các dung mơi trích ly [1] 25 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly [1] 26 2.4 Quá trình kháng khuẩn [4] 27 2.4.1 Tính chất 27 2.4.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết 27 2.4.2.1 Phương pháp sử dụng chất bán rắn 28 2.4.2.2 Phương pháp sử dụng chất lỏng- Broth Dilution Methods (Pha loãng canh trường) 31 2.4.2.3 Thin-Layer Chromatography (TLC)–Bioautography (Sắc kí lớp mỏng) 34 2.5 Vi khuẩn 35 2.5.1 Escherichia coli 35 2.5.1.1 Giới thiệu 35 2.5.1.2 Đặc điểm chế gây bệnh 37 2.5.2 Pseudomonas aeruginosa [20, 29, 30] 37 2.5.2.1 Giới thiệu [20] 37 2.5.2.2 Đặc điểm khả gây bệnh 39 2.5.3 Salmonella typhi [21, 24] 39 2.5.3.1 Giới thiệu 39 2.5.3.2 Đặc điểm khả gây bệnh [21] 41 2.5.4 Staphylococcus aureus [7] 41 2.5.4.1 Giới thiệu 41 2.5.4.2 Đặc điểm khả gây bệnh 44 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang ii Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 3.1 Vật liệu nghiên cứu 47 3.1.1 Địa điểm thí nghiệm 47 3.1.2 Đối tượng thí nghiệm 47 3.1.3 Dụng cụ - thiết bị 47 3.1.4 Hóa chất 48 3.1.5 Phương pháp phân tích 48 3.2 Phương pháp nghiên cứu 50 3.2.1 Quy trình sản xuất dự kiến 50 3.2.2 Thuyết minh quy trình 51 3.2.2.1 Xử lý 51 3.2.2.2 Chần 51 3.2.2.3 Xay 51 3.2.2.4 Trích ly 51 3.2.2.5 Lọc 51 3.2.2.6 Cô quay 52 3.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 53 3.2.4 Bố trí thí nghiệm 54 3.2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu ban đầu 54 3.2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung mơi trích ly 54 3.2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 57 3.2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nhiệt độ trích ly 59 3.2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa gai 62 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang iii Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa 3.2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn gai 63 3.2.4.7 Thí nghiệm 7: Thí nghiệm ứng dụng gai vào sản xuất trà túi lọc 64 Phần IV: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 66 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu ban đầu 67 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung mơi trích ly 68 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu – dung mơi 70 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nhiệt độ trích ly 72 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa gai 74 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn gai 77 4.7 Thí nghiệm 7: Thí nghiệm ứng dụng gai vào sản xuất trà túi lọc 79 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 5.1 Kết luận 83 5.2 Kiến nghị 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO I PHỤ LỤC III SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang iv Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cây gai (Boehmeria nivea) Hình 2.2: Một số lồi thuộc chi gai Hình 2.3: Mặt trước mặt sau lồi gai trắng (Boehmeria nivea) Hình 2.4: Thân gai Hình 2.5: Hoa gai, hoa cái, hoa đực Hình 2.6: Quả gai Hình 2.7: Nguyên nhân hình thành gốc tự 11 Hình 2.8: Cơ chế hình thành gốc tự 13 Hình 2.9: Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa 14 Hình 2.10: Sự gắn kết kim loại chất chống oxy hóa 15 Hình 2.11: Sự phát sinh ROS tế bàà hệ thống chống oxy hóa nội sinh trình thiếu máu cục - tái tưới máu 17 Hình 2.12: α – Tocopherol 18 Hình 2.13: Vitamin C 19 Hình 2.14: Phản ứng quecetin với gốc tự superoxid 21 Hình 2.15: Phản ứng trung hịa gốc DPPH 23 Hình 2.16: Phương pháp khuếch tán đĩa 29 Hình 2.17: Kết thử nghiệm Agar Dilution 30 Hình 2.18: Broth Dilution Method 33 Hình 2.19: Micro – broth Methods 34 Hình 2.20: TCL bioautography 35 Hình 2.21: Vi khuẩn E.coli 36 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang v Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Hình 2.22: Khẩn lạc E.coli 36 Hình 2.23: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 38 Hình 2.24: Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa 39 Hình 2.25: Vi khuẩn Salmonella enterica typhi 40 Hình 2.26: Khuẩn lạc Salmonella sp 41 Hình 2.27: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 42 Hình 2.28: Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus 43 Hình 2.29: Hình thái khuẩn lạc S.aureus hai mơi trường ni cấy 44 Hình 3.1: Quy trình trích ly dịch chiết gai 50 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 54 Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung mơi trích ly 56 Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kha sát tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi 58 Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - thời gian trích ly 61 Hình 4.1: Kết xác định hoạt chất sinh học Flavonoid 67 Hình 4.2: Đồ thị thể ảnh hưởng nồng độ dung mơi ethanol đến q trình trích ly 69 Hình 4.3: Đồ thị thị thể ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu – dung mơi đến q trình trích ly 71 Hình 4.4: Đồ thị thể ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến trình trích ly 73 Hình 4.5: Kết chống oxy hóa 75 Hình 4.6: Mối tương quan nồng độ hoạt tính chống oxy hóa cao chiết gai vitamin C 76 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang vi Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Hình 4.7: Khả kháng khuẩn gây bệnh dịch chiết gai 78 Hình 4.8: Màu sắc dịch gai tỉ lệ phối trộn khác 79 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang vii Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng giá trị dinh dưỡng gai Bảng 3.1: Bảng phương pháp phân tích 48 Bảng 3.2: Phương pháp phân tích tiêu nguyên liệu ban đầu 54 Bảng 3.3: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung mơi 55 Bảng 3.4: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 57 Bảng 3.5: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - thời gian trích ly 60 Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa gai 62 Bảng 4.1: Kết khảo sát nguyên liệu ban đầu 67 Bảng 4.2: Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến q trình trích ly 68 Bảng 4.3: Ảnh hưởngcủa tỉ lệ ngun liệu – dung mơi đến q trình trích ly 70 Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ đến qáu trình trích ly 72 Bảng 4.5: Giá trị OD HTCO (%) cao chiết gai vitamin C 75 Bảng 4.6: Khả kháng khuẩn dịch chiết gai ethanol 78 SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang viii Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Phần I: GIỚI THIỆU SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Nghiên Cứu Khoa Học PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU A Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi  Dụng cụ: - Cốc sấy : 12 - Cân phân tích - Tủ sấy  Tiến hành Rửa cốc, sau đem sấy tủ sấy nhiệt độ 1050C đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc mo(g) Bỏ vào cốc khoảng g nguyên liệu, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng m1(g) Sấy cốc có chứa mẫu nhiệt độ 1050C khoảng 30 phút , sau để nguội 15 phút bình hút ẩm Cân cốc mẫu sấy Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 30 phút cân lại lần trọng lượng cốc mẫu lần sấy không thay đổi Ghi nhận khối lượng m2 (g)  Tính kết Kết tính độ ẩm: (W) W= (m 1−m 2) × 100 (m 1−m0) (%) Trong đó: mo (g) : Khối lượng cốc sau sấy đến khối lượng không đổi m1(g) : Khối lượng cốc mẫu trước sấy m2 (g) : Khối lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng khơng đổi B Phương pháp định tính flavonoid [5] SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang III Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa  Phản ứng với amoniac Nhiều flavonoid thay đổi màu gặp NH3 Có thể quan sát biến đổi màu mắt thường ánh sáng tử ngoại  Phản ứng thuốc thử Sibata dung dịch H2SO4 đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau cho thêm 0,1 gam Mg, thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất chuyển sang đỏ cam đỏ tím [2]  Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc xuất màu xanh đen C Phương pháp xác định hàm lượng tro nguyên liệu  Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp cân trọng lượng để xác định Dùng sức nóng từ 550-6000C để nung cháy hoàn toàn chất hữu đem cân phần cịn lại để tính phần trăm tro  Tiến hành: a Dụng cụ, vật liệu thuốc thử: - Chén nung sứ, kim loại (kền bạch kim) - Đèn cồn hay bếp điện - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (đến 550 – 6000C) - Cân phân tích - Bình hút ẩm (phía có chất hút ẩm) - H2O2 hay HNO3 đậm đặc SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang IV GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Nghiên Cứu Khoa Học b Cách tiến hành: Nung chén sứ chén kim loại rửa lò nung tới 550 – 6000C đến trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001 g Cho vào chén khoảng g nguyên liệu Cân lại khối lượng chén mẫu cân phân tích Cho tất vào lị nung tăng nhiệt độ lò nung từ từ đến 550 – 6000C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu thường từ – Trường hợp có tro đen lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hay HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm cân với độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút, để nguội đem cân trọng lượng không đổi Kết lần nung cân liên tiếp không cách 0,0005 g cho gam mẫu thử c.Tính kết quả: Hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính cơng thức: X1 = (G2−G) ×100 (G1−G) Trong đó: G: Trọng lượng chén tính gam G1: Trọng lượng chén trọng lượng mẫu thử tính gam G2: Trọng lượng chén trọng lượng tro trắng sau nung cân tới trọng lượng không đổi tính gam D Phương pháp định lượng polyphenol (phương pháp ISO 14502-1-2005 dùng thuốc thử Folin- Ciocalteu)  Chiết xuất polyphenol SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang V Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa Cân 5g mẫu gai tươi, chần nhiệt độ 1000C thời gian khoảng giây để loại enzyme Chiết mẫu với 100 ml cồn 700 chiết hồi lưu nhiệt độ 70oC thời gian 90 phút, lọc thu dịch trích Pha lỗng: Lấy 1ml dịch chiết pha loãng 1000 lần cồn 990, Dịch pha loãng sử dụng để xác định lượng polyphenol tổng số Xây dựng đường chuẩn acid garlic: Đường chuẩn acid garlic xây dựng khoảng nồng độ: 10, 20, 40, 80, 160, 200, 250, 320µg/ml  Xác định hàm lượng polyphenol Chuẩn bị ống nghiệm bọc kĩ giấy bạc Các ống nghiệm đánh dấu cho ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm, bọc kín màng bao thực phẩm Sau đó, cho thêm ml folin vào, lắc để nhiệt độ phòng phút Tiếp theo cho thêm ml Na2CO3 7,5% vào, lắc đều, để tối nhiệt độ phòng.trong ba mươi phút Sau đó, đem đo OD bước sóng 765 nm  Tính kết Hàm lượng polyphenol tổng (%) có chất khô = 𝑓(𝐴) 𝑥 𝑘 m(100−w)/100 𝑥 100 Với: f(A): Phương trình đường chuẩn k: Hệ số pha lỗng (g) w: Hàm lượng nước (%) E Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn  Nguyên lí: Dịch chiết gai nhỏ vào lỗ thạch môi trường nuôi cấy tác dụng hoạt chất kháng khuẩn ức chế phát triển vi khuẩn có sẵn mơi trường Đo đường kính vịng vơ khuẩn Từ đưa kết luận khả kháng khuẩn gai SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang VI Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa  Phương pháp tiến hành: Hoạt hóa vi khuẩn, chuẩn bị dịch vi khuẩn: Vi khuẩn tồn trữ ống thạch nghiêng bảo quản lạnh Từ ống tổn trữ, cấy ria vi khuẩn ống thạch nghiêng, ni cấy 370C vịng 24 Chuẩn bị ống nghiêm đựng nước muối sinh lí hấp tiệt trùng, tiến hành pha loãng vi khuẩn cách sử dụng ống đục chuẩn Mcfaland 0,5 để số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml Chuẩn bị môi trường: Cân 1.6 g môi trường NB bổ sung 0,4 g agar, pha 200 ml nước Nấu mơi trường cho tan hồn tồn , sau đem môi trường hấp tiệt trùng 1210C 20 phút Để môi trường nguội khoảng 40 – 450C, đỗ 15 – 20 ml môi trường vào đĩa Để môi trường nguội tiến hành dung tăm cấy vi khuẩn lên đĩa thạch Khi bề mặt khô tiến hành đục lỗ với đường kính mm Chuẩn bị dịch chiết: Chọn gai trưởng thành không non khơng già, trích ly gai với cồn 70o với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1/15 thời gian 90 phút Tiến hành: Dùng micropipete 100µl với đầy típ vơ trùng, chuyển 70 µl dịch chiết gai vào lỗ thạch đĩa petri Nhỏ 70 µl methanol 700 vào lỗ thạch đối chứng Sau chuyển đĩa petri vào tủ lạnh (~100C) từ 4-8h để dịch khuếch tán thạch Chuyển sang nuôi cấy tủ ấm 370C/24h  Tính kết quả: Giá trị trung bình đường kính vành kháng khuẩn = D-d + >4mm: hoạt tính mạnh (+++) SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang VII Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa + - mm: hoạt tính trung bình (++) +