Xây dựng quy trình định lượng ezetimib và chất chuyển hóa ezetimib glucuronid trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HỒNG TRANG XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZETIMIB VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA EZETIMIB GLUCURONID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HỒNG TRANG XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZETIMIB VÀ CHẤT CHUYỂN HĨA EZETIMIB GLUCURONID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Nguyễn Thị Hoàng Trang ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình, sơ đồ, đồ thị ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB .3 1.2 TỔNG QUAN VỀ EZETIMIB PHENOXY Β-D-GLUCURONID 1.3 MỘT SỐ CHUẨN NỘI SỬ DỤNG 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) .12 1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU HUYẾT TƯƠNG .17 1.6 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC THEO HƯỚNG DẪN US-FDA VÀ EMA 20 1.7 TỔNG QUAN CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG EZETIMIB TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ 37 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 40 iii 3.3 KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 43 3.4 KHẢO SÁT CHẤT CHUẨN NỘI .47 3.5 XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ ĐỊNH LƯỢNG 49 3.6 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG EZM, .49 EZM-G TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG LC-MS/MS 49 3.7 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EZETIMIB VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA EZETIMIB GLUCURONID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS .58 CHƯƠNG BÀN LUẬN 62 4.1 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ÁP DỤNG CHO QUY TRÌNH 62 4.2 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EZM, EZM-G TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.3 KẾT LUẬN 69 4.4 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên aP2 Fatty acid-binding protein APCI Atmospheric pressure chemical ionization ApoB Apolipoprotein B Ý nghĩa Protein vận chuyển axit béo Ion hóa hóa học áp suất khí Protein vận chuyển cholesterol từ máu đến mô Area under the concentration – Diện tích đường cong nồng độtime curve thời gian Area under the concentration- Diện tích đường cong nồng độ time curve from time to thời gian từ thời điểm đến vô infinite time Area under the concentration - Diện tích đường cong nồng độ time curve from time to the last thời gian từ thời điểm đến thời điểm t measurable concentration Blank Mẫu trắng Bộ Y Tế Maximum concentration observed Nồng độ đỉnh huyết tương Calibration curve Đường chuẩn Coefficient of variation Hệ số phân tán Ethyl acetate Ethyl acetat European Medicines Agency Cơ quan Dược phẩm châu Âu Electrospray ionization Ion hóa phun điện Ezetimibe Ezetimib Ezetimibe glucuronide Ezetimib glucuronid Gas chromatography Sắc ký khí High density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography High quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ cao Internal standard Chuẩn nội Khối lượng phân tử Liquid chromatography Sắc ký lỏng Liquid Chromatography Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần Tandem Mass Spectrometry Low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp Liquid-liquid extraction Chiết lỏng-lỏng AUC AUC0-∞ AUC0-t BLK BYT Cmax CC CV EA EMA ESI EZM EZM-G GC HDL HPLC HQC IS KLPT LC LC-MS/MS LDL LLE v LLOQ LogP Lower limit of quantitation (=lgKow) - Octanol/water partition coefficient Low quality control The matrix factor Medium quality control Multiple Reaction Monitoring Tert-butyl methyl ether (= -lgKa)- acid dissociation constant Protein precipitation Reversed-phase Relative standard deviation LQC MF MQC MRM MTBE pKa PPE RP RSD S SALLE Salting-out assisted liquid liquid extraction Solid phase extraction SPE TB Tmax Giới hạn định lượng Hệ số phân tán octanol/nước Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp Hệ số ảnh hưởng mẫu Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình Kiểu đo mảnh phổ khối hai lần Tert-butyl methyl ether Hằng số phân ly axít Tủa protein Pha đảo Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích pic Chiết lỏng - lỏng hỗ trợ tách muối Chiết pha rắn Trung bình Time at which the maximum Thời gian đạt nồng độ đỉnh concentration (Cmax) is observed Retention time Thời gian lưu Upper Limit of Quantitation Giới hạn định lượng United States – The Food and Cơ quan Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ Drug Administration tR ULOQ US-FDA vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thông số dược động học tham khảo Bảng 1.2 So sánh hướng dẫn US-FDA EMA .20 Bảng 1.3 Tóm tắt quy trình định lượng EZM EZM-G huyết tương người 22 Bảng 1.4 Nồng độ tối đa (Cmax) EZM, EZM-G huyết tương người theo tài liệu tham khảo 23 Bảng 2.1 Chất đối chiếu chuẩn nội dự kiến sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.2 Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.3 Các lô huyết tương trắng sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.4 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 28 Bảng 2.6 Cách pha hỗn hợp chuẩn 28 Bảng 2.7 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương người 33 Bảng 3.1 Phổ khối EZM, EZM-G chuẩn nội 37 Bảng 3.2 Kết khảo sát cột sắc ký 41 Bảng 3.3 Kết khảo sát tỷ lệ pha động 42 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết với dung môi tủa protein (n=5) 43 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết (n=5) 44 Bảng 3.6 Kết khảo sát loại acid thêm vào (n=5) .45 Bảng 3.7 Kết khảo sát thể tích acid 45 Bảng 3.8 Kết khảo sát thể tích acetonitril (n=5) .46 Bảng 3.9 Kết khảo sát chuẩn nội (n=6) .48 Bảng 3.10 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương .49 Bảng 3.11 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) 50 Bảng 3.12 Identification point chất phân tích 50 Bảng 3.13 Kết xác định tính đặc hiệu .51 Bảng 3.14 Mối tương quan giá trị nồng độ tỷ số diện tích pic (S/S IS) 52 Bảng 3.15 Kết khảo sát tính tương thích phương trình hồi quy ý nghĩa thống kê .53 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ độ xác ngày ngày (n=6) 54 Bảng 3.17 Tỷ lệ phục hồi chất phân tích huyết tương người (n = 6).54 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ ổn định chất phân tích huyết tương người (n = 6) 55 Bảng 3.19 Kết khảo sát độ ổn định dung dịch gốc chất phân tích .56 Bảng 3.20 Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu 56 Bảng 3.21 Kết khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (n=6) .57 Bảng 3.22 Hệ số pha loãng (n=6) 57 Bảng 3.23 Chất chuẩn đối chiếu nội chuẩn sử dụng quy trình 58 Bảng 3.24 Dung mơi hóa chất sử dụng quy trình 58 Bảng 3.25.Trang thiết bị sử dụng quy trình 58 vii Bảng 3.26 Cách pha dung dịch chuẩn gốc .59 Bảng 3.27 Nồng độ giai mẫu chuẩn 59 Bảng 3.28 Nồng độ lý thuyết giai mẫu chuẩn mẫu kiểm chứng 60 Bảng 3.29 Bảng khối phổ EZM, EZM-G chuẩn nội 61 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo ezetimib Hình 1.2 Cơ chế tác dụng ezetimib (Nguồn: NCBI [28]) Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo ezetimib phenoxy β-D-glucuronid Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo methyl paraben Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo propyl paraben Hình 1.6 Công thức cấu tạo butyl paraben .10 Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo benzyl paraben 11 Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo phenyl paraben 11 Hình 1.9 Độ nhạy khoảng khối lượng giới hạn cho kiểu ion hóa LCMS/MS [13] 13 Hình 1.10 Cấu tạo phân tích khối hai tứ cực [17] 15 Hình 3.1 Phổ khối mảnh mẹ (A), mảnh (B) EZM nồng độ ng/mL mảnh mẹ (C), mảnh (D) EZM-G nồng độ 50 ng/mL (B) 38 Hình 3.2 Phổ khối mảnh mẹ mảnh methyl paraben (A), propyl paraben (B), butyl paraben (C), benzyl paraben (D), phenyl paraben (E) nồng độ µg/mL 39 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động acetonitril - acid acetic 0,5% sử dụng cột khác nhau: .40 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát với hệ pha động acetonitril - acid acetic 0,5% với tỷ lệ 55:45 (A), 45:55 (B), 50:50 (C) cột sắc ký Nucleodur 100-5 C8ec (1504,6 mm; 5µm) 42 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát tủa acetonitril (A) 43 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát thể tích acetonitril chiết mẫu 46 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội: methyl paraben (A), propyl paraben (B), butyl paraben (C), benzyl paraben (D), phenyl paraben (E) .47 Hình 3.8 Sắc ký đồ huyết tương trắng (A), nồng độ MQC chất phân tích (B) theo quy trình chiết đề xuất .49 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A), mẫu chuẩn mức nồng độ LLOQ (B) 51 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ chất phân tích huyết tương tỷ số diện tích pic EZM(A), EZM-G(B) 52 ix Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-37 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-38 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-39 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-40 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-41 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-42 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-43 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 11:Chứng nhận phân tích chất chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-44 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-45 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-46 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-47 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-48 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-49 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-50 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 12: Giấy xác nhận đề tài triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo người tình nguyện Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện PL-51 tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn