(TIỂU LUẬN) xây DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN và SAIKOSAPONIN a TRONG bài THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG sắc ký LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRỊNH HƯƠNG GIANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆỆ̣U NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRỊNH HƯƠNG GIANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆỆ̣U NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Chử Văn Mến HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, ban Giám đốc Học viện Quân y, phòng Đào tạo, hệ quản lý học viên Dân sự, trung tâm thử nghiệm lâm sàng tương đương sinh học – Viện nghiên cứu y dược học quân - Học viện Quân y quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để học tập suốt năm qua thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy: PGS.TS Chử Văn Mến Là người thầy tận tình hướng dẫn khoa học, giảng dạy kiến thức kinh nghiệm thực tế quý báu cho em trình học tập, nghiên cứu thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Trịnh Nam Trung – Viện trưởng Viện Đào tạo Dược, DS Nguyễn Thị Thanh Hằng toàn thể thầy giáo, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất môn khác thuộc trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em tiến hành nghiên cứu, học tập để hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người đồng hành, ủng hộ động viên em trình học tập q trình thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trịnh Hương Giang MỤC LỤC DANH MỤỤ̣C CÁÁ́C BẢNG DANH MỤC HÌNH ANH DANH MỤỤ̣C CÁC KÝ HIỆỤ̣U, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 BÀÀ̀I THUỐÁ́C NHẤT GAN LINH 1.2 TỔNG QUAN VỀ BERBERIN VÀÀ̀ SAIKOSAPONIN 1.2.1 Hợp chất Berberin (BER) 1.2.2 Hợp chất Saikosaponin A (SAIKO) 1.3 MỘỤ̣T SỐÁ́ NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN TÍCH SAIKOSAPONIN VÀÀ̀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁÁ́P SẮC KÝ LỎNG HIỆỤ̣U NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1 Một số nghiên cứu phân tích thành phần BER hồng bá HPLC 1.3.2 Một số nghiên cứu phân tích thành phần SAIKO sài hồ HPLC 10 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁÁ́P HPLC 11 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 1.4.2 Các thông số đặc trưng trình sắc ký 11 1.4.3 Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao thường dùng 14 1.4.4 Thẩm định quy trình phân tích 14 CHƯƠNG NGUYÊN VẬỤ̣T LIỆỤ̣U VÀÀ̀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU 19 2.1 NGUYÊN VẬỤ̣T LIỆỤ̣U VÀÀ̀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2 PHƯƠNG PHÁÁ́P NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO 20 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO 21 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀÀ̀ BÀÀ̀N LUẬỤ̣N 24 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀÀ̀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁÁ́P ĐỊNH LƯỢỤ̣NG 24 3.1.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng 24 3.1.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng 27 3.2 BÀÀ̀N LUẬỤ̣N 36 3.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu 36 3.2.2 Về lựa chọn điều kiện sắc ký 37 3.2.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký 38 3.3 VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁÁ́P ĐỊNH LƯỢỤ̣NG .39 KẾT LUẬỤ̣N KIẾN NGHỊ TÀÀ̀I LIỆỤ̣U THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG STT 1.1 Thàn 2.1 Nguy 3.1 Chươ 3.2 Chươ 3.3 Chươ 3.4 Kết q 3.5 3.6 Diện BER Kết q ngày 3.7 Kết q 3.8 Kết q 3.9 Một 3.10 So sá BER DANH MUC HINH ANH STT 1.1 Cơng thức hóa h 1.2 Cơng thức hóa h 3.1 SKĐ với chương 3.2 SKĐ tốc độ d 3.3 3.4 Kết khảo sát (a), SKĐ mẫu th Đường chuẩn thể diện tích pic n DANH MỤC CAC KÝ HIỆỆ̣U, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ACN BER CS DĐVN V DMF DMSO HPLC ICH LLOQ LOD LOQ MeOH NGL RSD SAIKO SKĐ TCCS TFA YHCT Để định lượng xác hàm lượng BER SAIKO thuốc NGL, dung môi phương pháp chiết xuất phải đảm bảo chiết kiệt hoạt chất Để phân tích thành phần BER SAIKO, tác giả sử dụng phương pháp chiết xuất khác (bảng 4.1) Qua bảng 3.9 cho thấy, tác giả Jung Won Choi CS [28] Dược điển Việt Nam V [30] sử dụng phương pháp chiết siêu âm, dung môi Methanol/ Ethanol Bài thuốc NGL bào chế dạng viên nang Do để phục vụ nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý thuốc, việc chiết Methanol hợp lý Đối với nghiên cứu định lượng BER SAIKO, tác giả sử dụng dung môi Methanol/ Ethanol Việc sử dụng dung môi có khả hịa tan tốt hay phương pháp chiết phù hợp, hiệu chiết xuất tăng, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu Do vậy, để định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL, nghiên cứu sử dụng dung môi MeOH, phương pháp siêu âm để chiết xuất phù hợp với nghiên cứu công bố 3.2.2 Về lựa chọn điều kiện sắc ký Nhiều nghiên cứu phân tích thành phần có tác dụng sinh học Hoàng bá, Sài hồ, hay định tính hợp chất thuốc YHCT lựa chọn cột sắc ký loại C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm Kết cho thấy, nghiên cứu In-Seon Park CS [27] định lượng đồng thời chất Sài hồ, Dược điển Việt Nam V [30] định lượng đồng thời chất đại hoàng, điều cho thấy khả phân tách hợp chất cột C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm tốt, pic chất phân tích mẫu chuẩn cân đối, sắc nét, mẫu thử tách hồn tồn khỏi pic tạp Do đó, nghiên cứu lựa chọn loại cột sắc ký C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm Bên cạnh cố định loại cột sắc ký, đề tài cố định số điều kiện khác gồm: loại dung mơi pha động, thể tích tiêm 10μL, nhiệt độ cột 30ºC nhằm giảm thời gian chi phí nghiên cứu 39 3.2.2 Về khảo sáát điều kiện sắc ký Bảng 3.10 So sánh số điều kiện kết phân tích BER, SAIKO HPLC STT Qua bảng so sánh kết nghiên cứu (bảng 3.10) cho thấy: 40 Nghiên cứu định lượng SAIKO Sài hồ, In-Seon Park CS [27] định lượng SAIKO kết thời gian lưu SAIKO 12,20 phút với thời gian phân tích mẫu 40 phút, hay Jung Won Choi CS [28] định lượng SAIKO kết thời gian lưu SAIKO 30,70 phút với thời gian phân tích mẫu 60 phút Nghiên cứu định lượng BER Hoàng bá, J.V.Srinivasan CS [29] định lượng BER kết thời gian lưu BER 8,89 phút, Kalma CS [9] định lượng BER kết thời gian lưu BER 10,08 phút, hay Lin Ma CS [12] định lượng BER kết thời gian lưu BER 8,82 phút Như vậy, nghiên cứu BER hoàng bá SAIKO Sài hồ có kết thời gian lưu lớn, thời gian phân tích mẫu kéo dài, gây tốn thời gian chi phí phân tích Trong đó, phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL nghiên cứu cho thời gian lưu BER SAIKO 8,77 11,49 phút, rút ngắn thời gian phân tích mẫu cịn 15 phút, tiết kiệm thời gian chi phí cho việc phân tích nghiên cứu Ngồi ra, điều kiện khác mà nghiên cứu khảo sát tốc độ dòng pha động Đề tài lựa chọn khảo sát tốc độ dòng nhằm đánh giá ảnh hưởng đến kết phân tích Kết thực tế cho thấy, so với tốc độ dòng 0,3 mL/phút, tốc độ dịng 0,2 mL/phút cho pic có đỉnh nhọn đáy hẹp hơn, pic thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp, pic khơng có tượng dính Do đó, đề tài lựa chọn tốc độ dịng pha động 0,2 mL/phút 3.3 VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁÁ́P ĐỊNH LƯỢỤ̣NG Phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn ICH với tiêu: Tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ xác Phương pháp định lượng có khoảng nồng độ tuyến tính khoảng 5,0 – 50,0 μg/mL, đảm bảo phân tích mẫu với nồng độ chất phân tích khác 41 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, rút kết luận sau: Đã xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL Đã lựa chọn điều kiện sắc ký gồm: Cột: Acquity UPLC BEH C18 1,7micromet; 2,1 × 100mm (Mỹ), detector PDA, bước sóng 210nm, tốc độ pha động: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm mẫu: 10μL, nhiệt độ cột: 30ºC, dung môi pha động 0,01% acid phosphoric/ ACN với chương trình sau: Thời gian (phút) 0,00 → 10,20 → 11,90 → 12,00 → Đã thẩm định quy trình định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL Phương pháp định lượng thẩm định đáp ứng đầy đủ yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ chọn lọc – đặc hiệu, khoảng tuyến tính từ 5,0 – 50,0 μg/mL, giới hạn phát BER SAIKO 0,124 μg/mL 0,625 μg/mL, giới hạn định lượng BER SAIKO 0,377 μg/mL 1,895 μg/mL, độ cao (độ thu hồi từ 98,13% 102,37% BER từ 98,73% - 103,57% SAIKO, độ xác cao (giá trị RSD BER SAIKO < 2%) 42 KIẾN NGHỊ Sau hoàn thành đề tài, kiến nghị số vấn đề sau: - Nghiên cứu khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất từ thuốc NGL Bào chế bán thành phẩm, khảo sát tính an tồn, tác dụng thuốc NGL 43 TÀI LIỆỆ̣U THAM KHẢO Nguyễn Quốc Anh, Ngơ Q Châu (2012), “Xơ gan”, Hướng dẫn chẩn đốn điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr 494-497 Đại học Y Hà NộỆ̣i (2011), “Viêm gan B”, Điều trị học Nội khoa Tập I, nhà xuất Y học, tr 197 -199 BộỆ̣ Y tế (2014), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan vi rút B”, (Ban hành kèm theo Quyết định số 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 Bộ trưởng Bộ Y tế) Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Tráác (2008), Hải Thượng Y tông tâm lĩnh tập 2, NXB Y học Trân Văn Ky (2013), Dươc hoc cổ truyên, Nhà xuất Đa Nẵng Liu C.T., Chuang P.T., Wu C.Y., et al (2006), Antioxidative and in vitro hepatoprotective activity of bupleurum kaoi leaf infusion Phytother Res PTR, tr 1003–1008 Aoxue Liu, Tongtong Xu Wenning Yang (2021), Quantitative Determination of Saikosaponins in Xiaochaihu Granules Using HighPerformance Liquid Chromatography with Charged Aerosol Detection Journal of Analytical Methods in Chemistry, tr 65-69 G.A Akowuah cáác cộỆ̣ng (2014), Evaluation of HPLC and Spectrophotometric Methods for Analysis of Bioactive Constituent Berberine in Stem Extracts of Coscinium fenestratum, Acta Chromatographica 26(2), tr 243–254 Kamal Yt, Mhaveer Singh Ennus Tajuddin Tamboli (2011), Quantitative Analysis of Berberine in Berberis aristata Fruits and in a Traditional Anti-Inflammatory Unani Formulation by Use of a Validated HPLC Method Acta Chromatographica 23(1), tr 157-168 10.L.A Baltina cáác cộỆ̣ng (2015), Glycyrrhizic acid derivatives as influenza A/H1N1 virus inhibitors, Bioorg Med Chem Lett 25, tr 17421746 44 11.Li, X Q cáác cộỆ̣ng (2005), High performance liquid chromatographic assay of saikosaponins from radix Bupleuri in China, Biol Pharm Bull 28(9), tr 1736-1742 12.Lin Ma, Jun-qing Li Yuan-dong Hu (2015), Determination of berberine in Phellodendron amurense from different sites of Changbai Mountain Journal of Forestry Research 26(1), tr 201–207 13.Maria A Neag cáác cộỆ̣ng (2018), Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders, The research topic 9, tr 557 14.Sung Ok Kim, Ji Yeoung Park, Seo Young Jeon, (2015), Saikosaponin a, an active compound of Radix Bupleuri, attenuates inflammation in hypertrophied 3T3-L1 adipocytes via ERK/NF-κB signaling pathway, International Journal of Molecular Medicine, tr 1126-1132 15.U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information (2018), “Berberine” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7843460/, truy cập ngày 15 tháng năm 2018 16.U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information (2018), "Saikosaponin A" https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6126128/, truy cập ngày 23 tháng năm 2018 17.BộỆ̣ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr.135-184 18.Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.10-59 19.Vụ khoa học đào tạo – BộỆ̣ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, tr.68-84 45 20.Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4) 21.Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatographytandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, tr.69-74 22.European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, tr.9-10 23.Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9), tr 654-663 24.Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), tr.1515-1609 25.The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, tr.2056-2057 26.The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), tr.6-13 27.In-Seon Park, Eun Mi Kang, and Namsoo Kim (2010), HighPerformance Liquid Chromatographic Analysis of Saponin Compounds in Bupleurum falcatum Journal of Chromatographic Science, tr 229233 28.Jung Won Choi, Juree Kim, Sam Sik Kang, et al (2021), Simultaneous determination of saikosaponin derivatives in Bupleurum falcatum by HPLC-ELSD analysis using different extraction methods, Bioactive Materials, tr 57-61 46 29 J.V Srinivasan, K P Unnikrishnan, A B Rema Shree, et al (2008), HPLC Estimation of berberin in Bupleurum falcatum, Bioactive Materials tr 96-99 30.BộỆ̣ Y tế (2018), “Hoàng bá”, Dược điển Việt Nam V tập II, nhà xuất Y học, tr 1185 47 ... GIÁO DỤC VÀ ? ?A? ?O TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRỊNH HƯƠNG GIANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU... tiến vào chuyển dạng bào chế thuốc Nhất gan linh, tiến hành đề tài ? ?Xây dựng quy trình định lượng đồng thời berberin saikosaponin A thuốc Nhất gan linh sắc ký lỏng siêu hiệu năng? ?? nhằm hai mục... tiêu sau: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời berberin saikosaponin thuốc NGL UPLC Thẩm định quy trình định lượng đồng thời berberin saikosaponin thuốc NGL UPLC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 BÀÀ̀I