Xây dựng quy trình định lượng đồng thời rutin và luteolin có trong trà hòa tan và viên nang bằng phương pháp hplc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN NGỌC TRÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI RUTIN VÀ LUTEOLIN CĨ TRONG TRÀ HỊA TAN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC/PDA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Cần Thơ - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN NGỌC TRÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI RUTIN VÀ LUTEOLIN CĨ TRONG TRÀ HỊA TAN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC/PDA Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân Cần Thơ – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu chúng tơi Những kết luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2022 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Trân ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân người tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất trường đại học Y Dược Cần Thơ, gửi lời yêu thương đến bạn thành viên lớp chuyên khoa I cao học kiểm nghiệm thuốc & độc chất khóa 2019 – 2021 người bạn đồng hành, tiếp thêm cho nhiều động lực để vượt qua khó khăn thử thách Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo anh, chị, em Trung Tâm kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm Cần Thơ tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ nhiều thời gian thực luận văn Cuối vô biết ơn gia đình, ban lãnh đạo đồng nghiệp cơng ty cổ phần Dược Minh Hải động viên, giúp đỡ cộng việc để tơi hồn thành khóa học iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan rutin 1.2 Tổng quan luteolin 1.4 Một số phương pháp xử lý mẫu chứa rutin, luteolin 14 1.4 Một số nghiên cứu liên quan nước 14 1.5 Tổng quan thực phẩm chức 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3 Đạo đức nghiên cứu 35 Chương KẾT QUẢ 37 3.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu chứa rutin luteolin trà hòa tan viên nang 37 3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời rutin luteolin có trà hịa tan viên nang 46 Chương BÀN LUẬN 64 4.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu chứa rutin luteolin trà hòa tan viên nang 64 iv 4.2 Thẩm định định lượng đồng thời rutin luteolin có trà hịa tan viên nang 70 KẾT LUẬN 80 KIẾN NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh AOAC Association of Official Analytical Community DNA Deoxyribonucleic acid DPPH HPLC H2O2 HPTLC ICH IFIC ISO LOD LOQ MS PDA RSD SD SOP THA TPCN UFLC UV-Vis WHO High Performance Liquid Chromatography High Performance Thin Layer Chromatography International Conference on Harmonization International Food Information Council Investment Funds Institute of Canada International Organization for Standarlization Limit of Detection Limit of Quantification Mass Spectometry Photodiode Array Relative Standard Deviation Standard Deviation Standard operating procedure Utrafast Liquid Chromatography Ultraviolet-Visible World Health Organization Tiếng Việt Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế Phân tử mang thông tin di truyền 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Sắc ký lỏng hiệu cao Hydrogen peroxide Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Hội đồng thông tin lương thực quốc tế Viện quỹ đầu tư Canada Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối phổ Đầu dò dãy diod quang Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Quy trình thao tác chuẩn Tăng huyết áp Thực phẩm chức Sắc ký lỏng siêu nhanh Tử ngoại - Khả kiến Tổ chức Y tế Thế giới vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các phương pháp định lượng rutin Bảng 1.2 Các phương pháp định lượng luteolin 12 Bảng 1.3 Một số phương pháp chiết dung môi chiết xuất rutin, luteolin 14 Bảng 2.1 Các dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.3 Các điều kiện sắc ký khảo sát chế độ rửa giải đẳng dòng 24 Bảng 2.4 Các điều kiện sắc ký khảo sát chế độ rửa giải gradient 25 Bảng 2.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết 27 Bảng 2.6 Mơ tả thí nghiệm khảo sát quy trình chiết 28 Bảng 2.7 Thông tin mẫu TPCN chứa rutin, luteolin thu thập 33 Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký chế độ rửa giải đẳng dòng 37 Bảng 3.2 Kết khảo sát điều kiện sắc ký chế độ rửa giải gradient 38 Bảng 3.3 Chương trình gradient nghiên cứu 40 Bảng 3.4 Kết hiệu suất chiết mẫu trà hòa tan viên nang 44 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ ổn định mẫu chuẩn 44 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ ổn định mẫu thử 45 Bảng 3.7 Kết tính tương thích hệ thống 46 Bảng 3.8 Độ tinh khiết pic rutin luteolin mẫu thử trà hòa tan 48 Bảng 3.9 Kết thẩm định LOD LOQ 51 Bảng 3.10 Kết độ xác ngày 52 Bảng 3.11 Kết độ xác liên ngày trà hòa tan (n = 18) 52 Bảng 3.12 Kết thẩm định độ trà hòa tan 53 Bảng 3.13 Độ tinh khiết pic rutin luteolin mẫu thử thêm chuẩn 54 vii Bảng 3.14 Kết độ xác ngày viên nang 57 Bảng 3.15 Kết độ xác liên ngày viên nang (n = 18) 58 Bảng 3.16 Kết thẩm định độ 58 Bảng 3.17 Bảng so sánh kết phịng thí nghiệm cho tiêu độ tái lập 59 Bảng 3.18 Kết phân tích rutin luteolin số mẫu thực phẩm chức 60 Bảng 4.1 Phân tích tuyến tính rutin (trà hịa tan) 72 Bảng 4.2 Phân tích tuyến tính luteolin (trà hòa tan) 72 Bảng 4.3 Phân tích tuyến tính rutin (viên nang) 76 Bảng 4.4 Phân tích tuyến tính luteolin (viên nang) 76 viii DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo rutin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo luteolin Hình 3.1 Sắc ký đồ điều kiện sắc ký mẫu chuẩn 38 Hình 3.2 Sắc ký đồ điều kiện sắc ký mẫu thử 39 Hình 3.3 Chồng phổ sắc ký đồ bước sóng phân tích khảo sát 39 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát dung môi chiết 41 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát khối lượng mẫu tỉ lệ dung môi 41 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát thời gian siêu âm 42 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát số lần chiết 43 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 43 Hình 3.9 Chồng phổ sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn sau lần tiêm liên tiếp 47 Hình 3.10 Chồng phổ sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu trà 47 Hình 3.11 Phổ UV rutin mẫu chuẩn mẫu thử trà hịa tan 48 Hình 3.12 Phổ UV luteolin mẫu chuẩn mẫu thử trà hòa tan 48 Hình 3.13 Độ tinh khiết pic rutin mẫu thử trà hòa tan 49 Hình 3.14 Độ tinh khiết pic luteolin mẫu thử trà hịa tan 49 Hình 3.15 Đồ thị khảo sát tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic rutin 50 Hình 3.16 Đồ thị khảo sát tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic luteolin 50 Hình 3.17 Chồng sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu 53 Hình 3.18 Phổ UV rutin mẫu chuẩn mẫu thử viên nang 54 Hình 3.19 Phổ UV luteolin mẫu chuẩn mẫu thử viên nang 54 Hình 3.20 Độ tinh khiết pic rutin mẫu thử viên nang 54 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 nước sản xuất lưu hành nhiều sản phẩm thực phẩm chức từ cao hoa hịe, cao hoa cúc chứa rutin luteolin có tác dụng bảo vệ thành mạch máu, tăng sức bền mao mạch, chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư… bán rộng rãi nhà thuốc, siêu thị [1] Trong điều 10 thông tư 43/2014/BYT ngày 24/11/2014 yêu cầu phải công bố nội dung hàm lượng, thành phần tạo nên cơng dụng sản phẩm phải liệt kê trước cùng tên đầy đủ hàm lượng Nhằm đảm bảo chất lượng, tính an tồn hiệu việc sử dụng thực phẩm chức năng, công tác tiêu chuẩn hóa chất lượng cần quan tâm khảo sát mức Đã có số nghiên cứu ngồi nước cơng bố cho việc xác định hàm lượng rutin phương pháp đo quang phổ, sắc ký điện di [5], phương pháp HPLC-UV [1], xác định hàm lượng luteolin phương pháp HPLC [2], xác định đồng thời rutin, luteolin, quercerin betulinic acid phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) [7] Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phổ biến có độ nhạy, độ xác cao, phù hợp với điều kiện nhiều phịng thí nghiệm.Vì nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời rutin luteolin có thực phẩm chức trà hòa tan phương pháp HPLC-PDA” II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu - Chất chuẩn Rutin (Viện KN thuốc TPHCM): Lot: QT152060420; độ tinh khiết 88,5 % (HPLC) - Chất chuẩn Luteolin (TRC): Lot: 2-NQH-43-1; độ tinh khiết 95,58 % (HPLC) - Methanol, acid formic, nước cất lần, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích HPLC 2.2 Thiết bị: Đã hiệu chuẩn theo quy định ISO/IEC 17025 (2017) - Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu - LC – 20AD (Nhật) với detector PDA - Cân phân tích Sartorius CP224S, độ xác d=0,1 mg - Máy lắc siêu âm Elmasonic S-120H (Đức) - Dụng cụ thủy tinh xác (Duran-Đức) 2.3 Đối tượng nghiên cứu Mẫu thử: Trà hòa tan chứa cao hoa hòe 6% cao hoa cúc 4% (Ngày sản xuất: 01/08/2020; Hạn dùng: 01/08/2022) Mẫu trắng: Dung môi pha động 2.4 Phương pháp nghiên cứu - Khảo sát điều kiện sắc ký: Các điều kiện sắc ký cố định cột sắc ký Water C18 (4,6mm x 250mm; 5µm), thể tích tiêm 20µL tốc độ dịng 1mL/phút Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký bao gồm chương trình rửa giải, bước sóng phát hiện, thành phần tỷ lệ pha động để lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu - Mẫu thử: Cân xác khoảng 2,5g mẫu nghiền mịn cho vào bình định mức 10mL, thêm 10ppm chất chuẩn luteolin vào, điền đầy đến vạch methanol 70%, lắc siêu âm phút, để nguội Gạn lấy lớp dịch chiết vào bình định mức 20mL, tiến hành chiết lặp lần gộp dịch chiết, bổ sung vừa đủ methanol 70% đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45µm, sau tiêm vào hệ thống sắc ký - Mẫu chuẩn: Chuẩn bị hỗn hợp mẫu chuẩn rutin 100µg/mL luteoin có nồng độ 10µg/mL 2.5 Thẩm định quy trình phân tích: Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn 141 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 AOAC bao gồm tiêu: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ), độ xác độ [3] III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Điều kiện sắc ký Bảng Điều kiện sắc ký Cột sắc ký Pha động B Pha động C Chương trình gradient Tốc độ dịng Thể tích tiêm Nhiệt độ cột Bước sóng phát Đầu dị Water C18 (4,6mm x 250mm; 5µm) Methanol Acid formic 0,1% Thời gian (phút) Pha động B (%) 0,01 45 9,0 40 11,0 70 20,0 70 21,0 45 28,0 45 1mL/phút 20µL 30oC 350nm PDA Pha động C (%) 55 60 30 30 55 55 Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn rutin luteolin điều kiện sắc ký lựa chọn 3.2 Tính tương thích hệ thống Tiến hành tiêm lặp lại lần mẫu hỗn hợp chuẩn rutin luteolin nồng độ 10µg/mL với điều kiện sắc ký chọn Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn (n = 6) Chất phân tích Rutin Luteolin Giá trị thống kê Trung bình RSD % Trung bình RSD % tR(phút) 9,622 0,276 18,416 0,036 S (mV x giây) 309,647 0,133 777,451 0,073 As 1,125 0,064 1,200 0,126 Rs 18,305 0,818 N 18315 0,689 704819 1,070 (tR: thời gian lưu; S: diện tích đỉnh; As: hệ số đối xứng; Rs: độ phân giải; N: số đĩa lý thuyết) Kết cho thấy RSD thông số sắc ký chất phân tích mẫu chuẩn 0,995 3.5 Giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng dần dung dịch chuẩn rutin luteolin mục 2.4.3 đến nồng độ thấp cho tiêm vào hệ thống sắc ký, tín hiệu thu cao gấp 10 lần so với nhiễu đường có độ đúng, độ lặp lại đạt yêu cầu để định lượng Giới hạn định lượng rutin luteolin 0,33µg/mL 3.6 Độ độ xác Thêm vào mẫu thử lượng xác định hỗn hợp chuẩn rutin luteolin tương ứng với ba mức nồng độ 50%, 100%, 150% Độ xác định dựa % lượng chất thu hồi so với lượng chuẩn thêm vào Ở nồng độ phân tích lặp lại lần ngày, ngày liên tiếp Bảng Kết thẩm định độ độ xác Độ thu hồi (%) Chất phân tích Rutin Luteolin 50 % 100 % 150 % 99,68 91,63 93,43 94,50 92,44 94,91 144 Độ xác (n = 18) Trong ngày Liên ngày RSD % RSD % 1,24 2,58 3,77 3,44 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 43/2021 IV BÀN LUẬN Thực phẩm chức chứa cao hoa hòe cao hoa cúc sản xuất lưu hành thị trường với nhiều dạng bào chế khác Trong nghiên cứu việc ứng dụng phương pháp HPLC/PDA, sử dụng cột C18, hệ pha động gradient với methanol - dung dịch acid formic 0,1% (45: 55, v/v), thời gian phân tích hợp lý để xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hoạt chất rutin luteolin thực phẩm chức trà hòa tan đem lại kết tin cậy Quy trình xử lý mẫu thử với dung môi chiết methanol 70%, số lần chiết kiệt hoạt chất khảo sát lần, hỗ trợ lắc siêu âm phút, dịch chiết ổn định sau 96 so với nghiên cứu Khuluk cộng (2021) 48 [4] Kiểm tra tính tương thích hệ thống quy trình, kết cho thấy thông số sắc ký đạt yêu cầu như: độ phân giải (Rs ≥ 1,5), hệ số bất đối (0,8 ≤ As ≤ 1,5), số đĩa lý thuyết (N > 2000) Bên cạnh đó, RSD% thơng số thời gian lưu diện tích đỉnh sau lần tiêm liên tiếp nằm giới hạn cho phép (< 2%) Phương pháp đạt tính đặc hiệu, đảm bảo độ chọn lọc cao, không bị ảnh hưởng thành phần khác mẫu Khoảng tuyến tính rộng, rutin từ 0,44µg/mL-442,5µg/mL; luteolin từ 0,48µg/mL-191,16µg/mL, phương trình hồi quy hai chất phân tích có tính tương thích có hệ số tương quan nồng độ diện tích đỉnh R2 > 0,995 nên áp dụng phương trình hồi quy vào định lượng Kết xử lý phân tích mẫu thử thêm chuẩn khác điều kiện phịng thí nghiệm, trang thiết bị, kiểm nghiệm viên điều kiện thực ngày liên tiếp cho kết độ xác trung gian có giá trị RSD% rutin 2,58% luteolin 3,44% đạt yêu cầu theo hướng dẫn AOAC (