Xây dựng quy trình định lượng đồng thời atorvastatin, ortho hydroxy atorv astatin, para hydroxy atorvastatin và ezetimib toàn phần trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ NGUYỄN TRUNG NGUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN, ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY ATORVASTATIN VÀ EZETIMIB TOÀN PHẦN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ NGUYỄN TRUNG NGUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN, ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY ATORVASTATIN VÀ EZETIMIB TOÀN PHẦN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ NGÀNH: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI GS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤNA PHỤ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Lê Nguyễn Trung Nguyên Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2020 – 2022 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN, ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY ATORVASTATIN VÀ EZETIMIB TOÀN PHẦN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Lê Nguyễn Trung Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Chương Ngọc Nãi, GS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin, ezetimib, ezetimib glucuronid, huyết tương người, LC-MS/MS Mở đầu: Theo yêu cầu FDA EMA, để đánh giá tương đương sinh học in vivo dạng thuốc phối hợp cố định liều chứa atorvastatin ezetimib cần phải định lượng atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin; ezetimib ezetimib toàn phần (ezetimib chất chuyển hóa ezetimib glucuronid) Các nghiên cứu trước cần xử lý mẫu huyết tương trước sau khử liên hợp ezetimib glucuronic -glucuronidase nên hiệu suất chiết khó kiểm sốt, dẫn đến nồng độ ezetimib tồn phần đo khơng phản ánh xác nồng độ ezetimib ezetimib glucuronid thể Mục tiêu: Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin para-hydroxy atorvastatin; ezetimib ezetimib glucuronid huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS với quy trình xử lý mẫu, đáp ứng yêu cầu thẩm định FDA EMA phân tích dịch sinh học Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành mẫu huyết tương người giả lập chứa chất phân tích chuẩn nội Tiến hành khảo sát điều kiện khối phổ, điều kiện sắc ký, chuẩn nội quy trình xử lý mẫu để xác định thông số quy trình Sau thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn FDA EMA hành Kết quả: Nghiên cứu phát triển phương pháp phâp tích đơn giản, có độ nhạy cao để định lượng đồng thời atorvastatin (ATOR), ezetimib (EZM) ba chất chuyển hóa orthohydroxy atorvastatin (o-OH ATOR), para-hydroxy atorvastatin (p-OH ATOR) ezetimibglucuronid (EZM-G) huyết tương người, sử dụng benzylparaben (BP) làm chuẩn nội (IS) Các chất phân tích chuẩn nội ion hóa chế dộ ESI dương (ATOR, o-OH ATOR p-OH ATOR), ESI âm (EZM, EZM-G BP) ghi phổ kỹ thuật MRM Tất chất phân tích chuẩn nội chiết xuất phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi acetonitril phân tách cột sắc ký pha đảo (50 x 4,6 mm; 3,5 µm) với pha động acetonitril – acid acetic 0,5 %, cho hiệu suất chiết cao (> 70%) ảnh hưởng mẫu giảm thiểu Phương pháp phân tích thẩm định đạt yêu cầu có khoảng xác định rộng 0,06 – 15 ng/mL; 0,6 – 150 ng/mL; 0,4 – 100 ng/mL; 0,12 – 30 ng/mL 0,05 – ng/mL EZM, EZM-G, ATOR, o-OH ATOR p-OH ATOR Kết luận: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đơn giản, ứng dụng để đánh giá tương đương sinh học in vivo dạng thuốc phối hợp cố định liều chứa atorvastatin ezetimib Master’s Thesis – Academic course: 2020- 2022 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF ATORVASTATIN, ORTHO-HYDROXY ATORVASTATIN, PARA-HYDROXY ATORVASTATIN AND TOTAL EZETIMIBE IN HUMAN PLASMA BY LC-MS/MS Le Nguyen Trung Nguyen Supervisor: Dr Chuong Ngoc Nai, Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin, ezetimibe, ezetimibe glucuronide, human plasma, LC-MS/MS Introduction: According to US-FDA and EMA, to assess in vivo bioequivalence of fix-dose combination of atorvastatin (ATOR) and ezetimibe (EZM), it is necessary to determine ATOR, ortho-hydroxy atorvastatin (o-OH ATOR), para-hydroxy atorvastatin (p-OH ATOR); EZM and total EZM (EZM and ezetimibe glucuronide metabolite) in human plasma In previous studies, the human plasma samples were processed before and after deconjugation of ezetimibe glucuronide (EZM-G) by -glucuronidase enzyme As the results, the extraction efficiency was difficult to control and the measured total EZM concentration did not reflect accurately the actual concentrations of EZM and EZM-G in human body Objectives: Development of LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of ATOR, o-OH ATOR, p-OH ATOR, EZM, and EZM-G in human plasma with a single step of sample treatment that meet validation requirements of FDA and EMA in body fluid Methods: The study was conducted on simulated human plasma samples containing analytes and internal standard Through the investigation of mass spectrometry and chromatographic conditions, internal standard, and sample treatment, the parameters of the analytical procedure were determined Then the procedure was validated in accordance with applicable FDA and EMA guidelines Results: A simple and sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC– MS/MS) method has been developed for simultaneous determination of ATOR, EZM, and three metabolites including o-OH ATOR, p-OH ATOR, and EZM-G in human plasma using benzylparaben (BP) as an internal standard (IS) The analytes and IS were ionized using positive ion mode ESI (ATOR, o-OH ATOR, and p-OH ATOR), negative ion mode ESI (EZM, EMM-G, and BP) and operated in multiple reaction monitoring (MRM) mode All analytes and IS were extracted by liquid-liquid extraction with acetonitrile, and then analyzed by liquid chromatography on reverse phase chromatographic column (50 x 4.6 mm; 3.5 µm), using a mixture of acetonitrile and 0.5% acetic acid solution as the mobile phase, that showed high extraction efficiency (> 70 %), and minimized matrix effect The method was satisfactorily validated, and showed excellent linearity over the wide concentration range of 0.06 – 15 ng/mL, 0.6 – 150 ng/mL, 0.4 – 100 ng/mL, 0.12 – 30 ng/mL and 0.05 – ng/mL for EZM, EZM-G, ATOR, o-OH ATOR, and p-OH ATOR, respectively Conclusion: A simple analytical procedure has been successfully developed and can be applied for the in vivo bioequivalence assessment of fix-dose combination product containing atorvastatin and ezetimibe i MỤC LỤC Trang 1.1 Hướng dẫn điều trị tăng cholesterol huyết AHA 1.2 Lựa chọn chất phân tích để đánh giá tương đương sinh học 1.3 Tổng quan chất phân tích 1.4 Các thông số dược động học atorvastatin ezetimib toàn phần nghiên cứu tương đương sinh học 16 1.5 Tổng quan sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS/MS) 17 1.6 Chuẩn nội (IS) kỹ thuật LC-MS/MS 20 1.7 Phân tích hợp chất glucuronid 21 1.8 Kỹ thuật chiết xuất SALLE phân tích dịch sinh học 24 1.9 Thẩm định quy trình định lượng thuốc dịch sinh học theo hướng dẫn US-FDA EMA 27 1.10 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng atorvastatin, chất chuyển hóa ezetimib huyết tương kỹ thuật LC-MS/MS 30 1.11 Định hướng nghiên cứu 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.2 Nguyên vật liệu 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 45 3.1 Thiết kế đường tuyến tính 46 3.2 Khảo sát điều kiện ion hóa tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 46 ii 3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 57 3.4 Khảo sát chuẩn nội 64 3.5 Kiểm tra tính đặc hiệu khối phổ 68 3.6 Khảo sát mơ hình tính tốn nồng độ phân tích 71 3.7 Xác định khoảng nồng độ định lượng chất điểm kiểm sốt 74 3.8 Thẩm định quy trình phân tích 75 3.9 Dự thảo quy trình “định lượng đồng thời atorvastatin, ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin ezetimib toàn phần huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” 87 4.1 Lựa chọn kỹ thuật phân tích 92 4.2 Điều kiện ion hóa 92 4.3 Cơ chế phân mảnh 94 4.4 Điều kiện sắc ký 97 4.5 Quy trình xử lý mẫu hiệu suất chiết 98 4.6 Lựa chọn chuẩn nội 100 4.7 Ảnh hưởng mẫu 101 4.8 Độ nhạy phương pháp 102 4.9 Tính đặc hiệu 102 4.10 Tính tốn kết nghiên cứu tương đương sinh học 102 4.11 Độ ổn định chất phân tích 103 5.1 Kết luận 104 5.2 Kiến nghị 104 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACC American College of Cardiology Hội tim mạnh học Hoa Kỳ ACS Acute coronary syndrome Hội chứng động mạch vành cấp AHA American Heart Association Hiệp hội tim mạch Hoa kỳ APCI Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học áp suất khí Ionization Atmospheric Pressure Ion hóa quang áp suất khí Photoionization Atherosclerotic Cardiovascular Bệnh tim mạch xơ vữa động Disease mạch Ký hiệu, chữ viết tắt APPI ASCVD ATOR Atorvastatin ATP Adult Treatment Panel Bảng trị liệu dành cho người trưởng thành AUC Area Under Cover Diện tích bên đường cong AUC0-∞ Area under the curve from time Diện tích đường cong nồng extrapolated to infinite time độ - thời gian từ thời điểm đến vô cực AUC0-t Area under the curve from time Diện tích đường cong nồng to the last measurable độ - thời gian từ thời điểm đến concentration thời điểm t BA Bioavailability Sinh khả dụng BE Bioquivalence Tương đương sinh học CI Confidence Interval Khoảng tin cậy iv Ký hiệu, Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt Cmax Maximum Plasma Concentration Nồng độ đỉnh huyết tương cps Counts per second Số đếm xung giây CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa tia điện EZM Ezetimibe EZM-G Ezetimibe-glucuronide FAB Fast Atom Bombardment chữ viết tắt Ion hóa bắn phá nhanh nguyên tử FDA Food and Drug Administration Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ GM Geometric Mean Trung bình nhân GMR Geometric Mean Ratio Tỷ số trung bình nhân HDL-C High Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao chứa Cholesterol cholesterol Hydrophilic Interaction Liquid Sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC Chromatography HMG-CoA β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA HQC High Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Internal Standard Chuẩn nội IUPAC International Union of Pure and Hiệp hội Quốc tế Hóa học Applied Chemistry túy ứng dụng v Ký hiệu, Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng LDL-C Low Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp chứa Cholesterol cholesterol LLE Liquid - Liquid Extraction Chiết lỏng – lỏng LLOQ Lower Limit of Quantification Giới hạn định lượng chữ viết tắt LogP Logarit thập phân hệ số phân bố hai pha octanol nước LogS Logarit thập phân độ tan (tính theo mol/L) LQC Low Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MoNA MassBank of North America Ngân hàng khối phổ Bắc Mỹ MQC Medium Quality Control Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình MS Mass Spectrometry Khối phổ NSI Nanospray Ionization Ion hóa tia nano o-OH ortho-hydroxy atorvastatin ATOR PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin/ Kexin type p-OH para-hydroxy atorvastatin ATOR PPT Protein Precipitation QQQ Triple Quadrupole Tủa protein Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-41 Sắc ký đồ liệu thẩm định độ ổn định chất phân tích huyết tương sau chu kỳ đơng-rã đơng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-43 Sắc ký đồ liệu thẩm định độ ổn định chất phân tích huyết tương sau 67 ngày bảo quản nhiệt độ -70 oC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-44 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-45 Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-46 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Sắc ký đồ liệu thẩm định lượng mẫu tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-52 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-53 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-54 Sắc ký đồ liệu thẩm định ảnh hưởng pha lỗng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-55 Phụ lục Giấy xác nhận đề tài triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo người tình nguyện Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn