Nguyễn thị vân xây dựng quy trình định lượng đồng thời một số methoxyflavon trong ngải đen (kaempferia parviflora wall ex baker) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ METHOXYFLAVON TRONG NGẢI ĐEN (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ METHOXYFLAVON TRONG NGẢI ĐEN (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quang Thảo PGS.TS Lê Đình Chi HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Quang Thảo – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS.TS Lê Đình Chi – Viện Cơng nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội, hai người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phịng Quản lý đào tạo, Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trường trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Đỗ Thị Hà – Viện Dược liệu, NCS.Nguyễn Văn Bình – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương người giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc đồng nghiệp Khoa Nghiên cứu Phát triển – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người ln cạnh ủng hộ động viên suốt trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày 10 tháng 03 năm 2023 Học viên Nguyễn Thị Vân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng: 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng sinh học 1.2 Tổng quan nhóm chất methoxyflavon bốn chất nghiên cứu 1.3 Một số phương pháp định lượng PMF từ Ngải đen phương pháp HPLC .11 1.4 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 14 1.4.1 Khái niệm 14 1.4.2 Nguyên tắc .14 1.4.3 Ứng dụng kiểm nghiệm 15 1.5 Tổng quan thẩm định phương pháp phân tích 15 1.5.1 Độ đặc hiệu 16 1.5.2 Khoảng tuyến tính 16 1.5.3 Độ 16 1.5.4 Khoảng xác định 18 1.5.5 Độ xác 18 1.5.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 19 1.5.7 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống 19 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị nghiên cứu 21 2.1.1 Chất chuẩn, dung mơi, hóa chất .21 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 21 2.2 Đối tượng nghiên cứu .22 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời bốn hoạt chất DMF; 3,5,7-TMF; 5,7,4’-TMF TTMF Ngải đen phương pháp HPLC .22 2.3.2 Thẩm định quy trình phân tích 24 2.3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng đồng thời bốn hoạt chất DMF; 3,5,7-TMF; 5,7,4’-TMF TTMF Ngải đen 26 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu đánh giá kết .26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .27 3.1 Xây dựng quy trình phân tích 27 3.1.1 Xây dựng điều kiện sắc ký .27 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30 3.1.3 Quy trình định lượng đồng thời DMF; 5,7,4’-TMF; 3,5,7-TMF TTMF Ngải đen phương pháp HPLC 38 3.2 Thẩm định quy trình phân tích .39 3.2.1 Độ đặc hiệu 39 3.2.2 Độ thích hợp hệ thống 41 3.2.4 Độ xác 45 3.2.5 Độ 48 3.2.6 Khoảng xác định 50 3.2.7 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 50 3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng đồng thời bốn hoạt chất DMF; 3,5,7-TMF; 5,7,4’-TMF TTMF Ngải đen 52 CHƯƠNG BÀN LUẬN 55 4.1 Về quy trình phân tích 55 4.2 Về ứng dụng phân tích mẫu Ngải đen 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Giải thích CAN Acetonitril AOAC (Association of Official Analytical Hiệp hội quốc tế nhà hóa học Chemists) International phân tích thức DMF Dimethoxyflavon EtOH Ethanol GC-MS (gas chromatography – mass spectroscopy) HPLC (high performance liquid chromatography) Sắc ký khí khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao ICH (International Council for Hội đồng quốc tế hài hòa yêu Harmonisation of Technical Requirements cầu kỹ thuật cho dược phẩm dùng for Pharmaceuticals for Human Use) người IC50 (half maximal inhibitory concentration) Nồng độ ức chế 50% LOD (limit of detection) Giới hạn phát LOQ (limit of quantitation) Giới hạn định lượng MeOH Methanol MIC (minimum inhibitory concentration) Nồng độ ức chế tối thiểu PMF Polymethoxyflavon RSD (relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối UV-VIS (ultraviolet – visible) Tử ngoại- khả kiến TMF Trimethoxyflavon TTMF 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng quan hợp chất DMF; 5,7,4’-TMF; 3,5,7-TMF TTMF 10 Bảng 1.2 Một số phương pháp HPLC định tính, định lượng methoxyflavon Ngải đen 12 Bảng 1.3 Độ thu hồi tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC [47] ……………………………………………………………………………………… 17 Bảng 1.4 Độ lặp lại độ tái lặp tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC [47] ………………………………………………………………………… …….…19 Bảng 3.1 Kết khảo sát lựa chọn tốc độ dịng …………………………………… 30 Bảng 3.2 Chương trình gradient dung mơi ………………………………………… 30 Bảng 3.3 Hàm lượng chất chiết theo dung môi chiết …………………… 31 Bảng 3.4 Hàm lượng chất chiết theo phương pháp chiết nhiệt độ chiết 33 Bảng 3.5 Hàm lượng chất chiết theo thời gian chiết 35 Bảng 3.6 Hàm lượng chất chiết theo số lần chiết 37 Bảng 3.7 Thời gian lưu (phút) phân tích 39 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 42 Bảng 3.9 Quan hệ tuyến tính nồng độ chất phân tích diện tích pic 44 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 46 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ xác trung gian phương pháp 47 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ phương pháp 49 Bảng 3.13 Khoảng xác định phương pháp 50 Bảng 3.14 Kết phân tích dung dịch thử pha lỗng 20 lần 51 Bảng 3.15 LOQ LOD phương pháp 52 Bảng 3.16 Kết xác định hàm lượng DMF; 5,7,4′-TMF; 3,5,7-TMF TTMF số mẫu Ngải đen ………………………………………………………………… 53 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Ngải đen thân rễ Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) [21]…………………………………………………………………………….…… Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số dẫn xuất 7-methoxyflavon Ngải đen [22] ………………………………………………………………………………… Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số flavonoid dạng glycosid phân lập từ thân rễ Ngải đen ……………………………………………………………………… ………5 Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn DMF (A); 5,7,4’-TMF (B); 3,5,7TMF (C) TTMF (D) ……………………………………………………………… 27 Hình 3.2 Kết khảo sát lựa chọn pha động mẫu chuẩn …………………… 28 Hình 3.3 Kết khảo sát lựa chọn pha động mẫu thử ……………………… 29 Hình 3.4 Kết khảo sát lựa chọn tốc độ dịng ………………………………… 29 Hình 3.5 Kết khảo sát chiết soxhlet với hai dung môi methanol ethanol …… 31 Hình 3.6 Kết khảo sát phương pháp chiết nhiệt độ chiết …………………… 34 Hình 3.7 Kết khảo sát thời gian chiết 36 Hình 3.8 Kết khảo sát số lần chiết ……………………………………………… 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ (A) Dung dịch chuẩn hỗn hợp; (B) Dung dịch thử; (C) Mẫu trắng ………………………………………………………………………………… 40 Hình 3.10 Kết chồng phổ định tính chất DMF (A); 5,7,4’-TMF (B); 3,5,7-TMF (C) TTMF (D) dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử ……… ……… 40 Hình 3.11 Đường chuẩn DMF; 5,7,4’-TMF; 3,5,7-TMF TTMF …………… 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngải đen có tên khoa học Kaempferia parviflora Wall Ex Baker, họ Gừng (Zingiberaceae), loài lâu năm Cây phân bố chủ yếu Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan Lào [1] Ở Việt Nam loài phát tỉnh ĐăkLăk, Gia Lai Thanh Hóa [2] Trong dân gian, Ngải đen sử dụng với nhiều tác dụng tăng cường sức khỏe, chống viêm, điều trị rối loạn tiêu hóa, ruột tá tràng[2] Theo y học cổ truyền Thái Lan, thân rễ Ngải đen có tác dụng tăng cường sinh lý, điều trị hen suyễn, dị ứng, đau bụng, đầy hơi, rối loạn tiêu hóa [3], rối loạn colic, loét dày, tá tràng [4], điều trị gút, áp xe [5] Trên giới có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý Các nghiên cứu thành phần hóa học từ lồi Kaempferia parvifloria cho biết nhóm chất chủ yếu gồm flavonoid [3], [6], glycosid [6], [7], steroid [2]; nhóm hoạt chất quan trọng tạo nên tác dụng sinh học flavonoid với thành phần dẫn xuất 7-methoxyflavon Các nghiên cứu hoạt tính sinh học cho thấy lồi Kaempferia parviflora có nhiều tác dụng tăng cường sinh lý [8], [9]; chống viêm [10], [11], [12]; kháng khuẩn [3]; kháng nấm [4], [13]; kháng virus [14]; chống dị ứng [15], chống ung thư [16], [17], bảo vệ tế bào dày [18], bảo vệ tim mạch [19], [20],… Với tác dụng sinh học quan trọng kể trên, Ngải đen có tiềm sử dụng rộng rãi làm thuốc đông dược thực phẩm bảo vệ sức khỏe giúp chăm sóc sức khỏe người dân Do việc kiểm sốt chất lượng Ngải đen đóng vai trị quan trọng Tuy nhiên Dược Điển Việt Nam V dược điển tham chiếu chưa có chuyên luận riêng Ngải đen Hiện Việt Nam có nghiên cứu Ngải đen, chủ yếu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học mà chưa có nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất Ngải đen Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời số methoxyflavon Ngải đen (Kaempferia parviflora Wall Ex Baker) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” thực với mục tiêu sau: 1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời bốn methoxyflavon (bao gồm 5,7-dimethoxyflavon; 3,5,7-trimethoxyflavon; 5,7,4’-trimethoxyflavon 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon) Ngải đen phương pháp HPLC Áp dụng quy trình định lượng xây dựng để kiểm tra hàm lượng bốn methoxyflavon kể số mẫu Ngải đen thu hái Việt Nam TDDL PMF_DTT SAMPLE Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: 10/31/2022 8:39:17 PM ICT 11/7/2022 3:37:18 PM ICT 0.020 0.018 0.016 0.012 3,5,7-TMF - 41.656 Absorbance (AU) 0.014 0.010 0.008 0.006 0.004 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.062 Date Acquired: Date Processed: 5,7,4'-TMF - 39.344 DTT-C1 Standard 1:A,4 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.718 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: I NFO RM ATI O N 0.002 0.000 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.718 775259 5,7,4'-TMF 39.344 578393 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 17197 No 6.05 1.01 16887 No 41.656 176529 1.90 0.99 17247 No 3,5,7,4'-TTMF 48.062 292542 4.71 1.00 16180 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 1.01 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DTT SAMPLE Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: 10/31/2022 9:49:58 PM ICT 11/7/2022 3:37:30 PM ICT 0.10 0.06 3,5,7-TMF - 41.684 Absorbance (AU) 0.08 0.04 0.02 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.077 Date Acquired: Date Processed: 5,7,4'-TMF - 39.381 DTT-C2 Standard 1:A,5 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.720 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: I NFO RM ATI O N 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.720 3897960 5,7,4'-TMF 39.381 2889826 3,5,7-TMF 41.684 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 17222 No 6.05 0.99 16761 No 892727 1.89 1.01 17190 No 3,5,7,4'-TTMF 48.077 1413861 4.72 1.02 16683 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 1.01 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DTT SAMPLE Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: 10/31/2022 11:00:39 PM ICT 11/7/2022 3:37:39 PM ICT 0.18 0.16 0.14 3,5,7-TMF - 41.505 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.017 Date Acquired: Date Processed: 5,7,4'-TMF - 39.234 DTT-C3 Standard 1:A,6 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.646 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: 0.20 Absorbance (AU) I NFO RM ATI O N 0.02 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.646 7800099 5,7,4'-TMF 39.234 5771784 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 17126 No 6.06 0.98 16801 No 41.505 1792041 1.87 1.03 17358 No 3,5,7,4'-TTMF 48.017 2823553 4.73 1.01 16627 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 1.00 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DTT SAMPLE Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: 11/1/2022 12:11:26 AM ICT 11/7/2022 3:37:48 PM ICT 0.40 0.35 0.25 3,5,7-TMF - 41.600 Absorbance (AU) 0.30 0.20 0.15 0.10 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.137 Date Acquired: Date Processed: 5,7,4'-TMF - 39.386 DTT-C4 Standard 1:A,7 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.668 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: I NFO RM ATI O N 0.05 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.668 15551415 5,7,4'-TMF 39.386 11517621 3,5,7-TMF 41.600 3,5,7,4'-TTMF 48.137 Reported by User: System Page: of 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 70.00 Purity1 Flag 0.98 17238 No 6.03 0.94 16647 No 3569576 1.88 1.02 17334 No 5632676 4.73 1.00 16573 No Project Name: 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DTT SAMPLE Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: 11/1/2022 1:22:15 AM ICT 11/7/2022 3:37:58 PM ICT 0.50 0.30 3,5,7-TMF - 41.630 Absorbance (AU) 0.40 0.20 0.10 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.026 Date Acquired: Date Processed: 5,7,4'-TMF - 39.316 DTT-C5 Standard 1:A,8 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.741 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: I NFO RM ATI O N 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.741 19339198 5,7,4'-TMF 39.316 14330449 3,5,7-TMF 41.630 3,5,7,4'-TTMF 48.026 Reported by User: System Page: of 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 70.00 Purity1 Flag 0.97 16898 No 6.03 0.93 16170 No 4440080 1.89 1.02 17548 No 7014089 4.74 0.99 16719 No Project Name: 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DD SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: DD-C1.1 Standard 1:B,7 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/1/2022 9:38:53 AM ICT 11/7/2022 4:26:34 PM ICT I NFO RM ATI O N Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.10 0.05 3,5,7,4'-TTMF - 48.132 0.15 3,5,7-TMF - 41.796 Absorbance (AU) 0.20 5,7,4'-TMF - 39.417 5,7-DMF - 32.799 0.25 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.799 4242033 5,7,4'-TMF 39.417 3213229 3,5,7-TMF 41.796 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 17274 No 6.07 1.00 16824 No 784280 1.86 1.02 17528 No 3,5,7,4'-TTMF 48.132 1487533 4.79 1.02 16710 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 1.01 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DD Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: Date Acquired: Date Processed: 11/1/2022 1:10:56 PM ICT 11/7/2022 4:27:20 PM ICT 0.30 0.20 3,5,7-TMF - 41.799 Absorbance (AU) 0.25 5,7,4'-TMF - 39.417 DD-C2.1 Standard 1:C,2 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 32.819 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: I NFO RM ATI O N 0.15 0.10 0.05 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.145 SAMPLE 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.819 11288107 5,7,4'-TMF 39.417 8392822 3,5,7-TMF 41.799 3,5,7,4'-TTMF 48.145 Reported by User: System Page: of 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 70.00 Purity1 Flag 1.01 17625 No 6.09 1.00 16584 No 2366473 1.86 1.02 17052 No 4007934 4.77 1.02 16710 No Project Name: 60.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_DD I NFO RM ATI O N DD-C3.1 Standard 1:C,5 10.00 ul 70.0 Minutes Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: Date Acquired: Date Processed: 11/1/2022 4:42:59 PM ICT 11/7/2022 4:27:45 PM ICT 5,7-DMF - 32.736 0.50 0.30 3,5,7-TMF - 41.706 Absorbance (AU) 0.40 5,7,4'-TMF - 39.374 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: 0.20 0.10 System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 3,5,7,4'-TTMF - 48.120 SAMPLE 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.736 17464260 5,7,4'-TMF 39.374 13011544 3,5,7-TMF 41.706 3,5,7,4'-TTMF 48.120 Reported by User: System Page: of 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count 60.00 Purity1 Flag 1.00 17332 No 6.02 0.97 16652 No 3743273 1.85 1.03 16866 No 6205421 4.71 1.01 16006 No Project Name: 70.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_LOQ SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: LOQ(T/20) Standard 1:C,8 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/1/2022 8:15:02 PM ICT 11/7/2022 4:30:05 PM ICT I NFO RM ATI O N Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF Ngay1 TDDL PMF TDDL PMF_process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.030 0.010 0.005 3,5,7,4'-TTMF - 48.258 0.015 3,5,7-TMF - 41.813 5,7-DMF - 32.864 Absorbance (AU) 0.020 5,7,4'-TMF - 39.463 0.025 0.000 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 32.864 341036 5,7,4'-TMF 39.463 254446 3,5,7-TMF 41.813 30.00 40.00 Retention time (Minutes) 50.00 Resolution Sym Factor USP Plate Count Purity1 Flag 60.00 s/n 0.99 17410 No 80.73 6.06 1.01 16811 No 49.90 65176 1.87 1.08 15054 No 11.15 3,5,7,4'-TTMF 48.258 114631 4.59 1.00 16358 No 20.36 Reported by User: System Page: of Project Name: 70.00 NghienCuu\2022\08_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: Date Acquired: Date Processed: 11/10/2022 10:43:34 AM ICT 12/3/2022 1:45:31 PM ICT 0.18 0.16 0.14 System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 5,7,4'-TMF - 40.307 THHT-Chuan hh Standard 1:A,2 10.00 ul 70.0 Minutes 5,7-DMF - 33.487 Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: 0.20 0.12 3,5,7-TMF - 42.485 Absorbance (AU) I NFO RM ATI O N 3,5,7,4'-TTMF - 49.149 SAMPLE 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 33.487 8078127 5,7,4'-TMF 40.307 5981393 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 16784 No 6.07 0.97 16590 No 42.485 1816963 1.74 1.03 17167 No 3,5,7,4'-TTMF 49.149 2936010 4.78 1.01 16378 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 0.99 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 SAMPLE I NFO RM ATI O N Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: DCXTG_Thu1 Standard 1:A,8 10.00 ul 70.0 Minutes Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: Date Acquired: Date Processed: 11/10/2022 11:41:12 PM ICT 12/3/2022 1:54:45 PM ICT System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.50 0.10 3,5,7,4'-TTMF - 49.142 0.20 3,5,7-TMF - 42.477 0.30 5,7,4'-TMF - 40.288 5,7-DMF - 33.476 Absorbance (AU) 0.40 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 33.476 7029829 5,7,4'-TMF 40.288 5324059 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 16884 No 6.07 0.96 16557 No 42.477 1194473 1.74 1.01 17019 No 3,5,7,4'-TTMF 49.142 2421909 4.79 1.00 16481 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 0.98 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: ND02_Thu1 Standard 1:C,7 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/11/2022 5:34:48 PM ICT 12/3/2022 2:00:05 PM ICT INFO RM ATI O N Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.40 0.35 0.20 0.15 0.10 0.05 3,5,7,4'-TTMF - 49.128 0.25 5,7,4'-TMF - 40.280 3,5,7-TMF - 42.450 5,7-DMF - 33.469 Absorbance (AU) 0.30 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 33.469 4510972 5,7,4'-TMF 40.280 4231459 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 15082 No 6.07 0.99 15126 No 42.450 1620060 1.75 1.01 16230 No 3,5,7,4'-TTMF 49.128 2638627 4.82 1.02 16140 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 0.99 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: ND03_Thu1 Standard 1:B,6 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/11/2022 6:45:42 AM ICT 12/3/2022 1:48:25 PM ICT INFO RM ATI O N Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) Absorbance (AU) 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 3,5,7,4'-TTMF - 49.119 5,7-DMF - 33.523 0.35 5,7,4'-TMF - 40.267 3,5,7-TMF - 42.450 0.40 0.00 0.00 Peak Name 10.00 20.00 RT Area 5,7-DMF 33.523 7166821 5,7,4'-TMF 40.267 5721355 3,5,7-TMF 42.450 3,5,7,4'-TTMF 49.119 Reported by User: System Page: of 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 70.00 Purity1 Flag 0.93 16556 No 5.97 1.00 16570 No 1043528 1.73 0.99 16929 No 2357432 4.78 1.01 16415 No Project Name: 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 SAMPLE I NFO RM ATI O N Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: ND04_Thu1 Standard 1:C,1 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/11/2022 10:17:57 AM ICT 12/3/2022 1:55:33 PM ICT Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.30 0.20 0.10 3,5,7,4'-TTMF - 49.127 5,7-DMF - 33.466 Absorbance (AU) 0.40 5,7,4'-TMF - 40.274 3,5,7-TMF - 42.448 0.50 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 33.466 7352945 5,7,4'-TMF 40.274 4676647 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 16915 No 6.07 0.97 16525 No 42.448 1236140 1.74 1.03 17228 No 3,5,7,4'-TTMF 49.127 2111171 4.81 1.02 16451 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 0.98 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van TDDL PMF_Ngay2 SAMPLE Sample Name: Sample Type: Vial: Injection #: Injection Volume: Run Time: ND05_Thu1 Standard 1:C,4 10.00 ul 70.0 Minutes Date Acquired: Date Processed: 11/11/2022 2:02:32 PM ICT 12/3/2022 1:59:03 PM ICT INFO RM ATI O N Acquired By: Sample Set Name: Acq Method Set: Processing Method: Channel Name: Proc Chnl Descr.: System TDDL PMF_Ngay TDDL PMF TDDL PMF_Process 264.0nm 2998 PDA 264.0 nm (2998 (200-400)nm) 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 3,5,7,4'-TTMF - 49.132 Absorbance (AU) 0.30 3,5,7-TMF - 42.452 5,7-DMF - 33.485 0.35 5,7,4'-TMF - 40.249 0.40 0.00 0.00 Peak Name 10.00 RT 20.00 Area 5,7-DMF 33.485 7305202 5,7,4'-TMF 40.249 5279734 3,5,7-TMF 30.00 40.00 Retention time (Minutes) Resolution Sym Factor Plate Count 50.00 16793 No 6.02 1.02 16597 No 42.452 1382809 1.75 0.99 16939 No 3,5,7,4'-TTMF 49.132 1924700 4.77 1.01 16401 No Page: of Project Name: 70.00 Purity1 Flag 0.97 Reported by User: System 60.00 NghienCuu\2022\11_Ngai den_Van