Đặng thị kim hằng mã sinh viên 1801180 xác định một số hormon sinh dục trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KIM HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1801180 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HORMON SINH DỤC TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHOẺ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KIM HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1801180 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HORMON SINH DỤC TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHOẺ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đặng Thị Ngọc Lan ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiền, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Thị Ngọc Lan ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc – người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc, thầy Ban giám hiệu, phịng Quản lý Đào tạo, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận q trình học tập trường Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn anh Phùng Công Lý cán công tác khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hỗ trợ giúp đỡ em suốt trình thực nghiên cứu khoa Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ để em hồn thành khóa luận cách tốt Trong q trình thực đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót, kính mong thầy đưa góp ý, đánh giá để khóa luận em thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2023 Sinh viên Đặng Thị Kim Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hormon 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Giới thiệu hormon sinh dục 1.1.3 Các quy định hành hormon sinh dục 1.2 Các phương pháp phân tích hormon sinh dục .6 1.2.1 Các nghiên cứu thực xác định số hormon sinh dục 1.2.2 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) .11 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.2.1 Chất chuẩn 14 2.2.2 Dung môi, hóa chất 14 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.3.1 Khảo sát điều kiện LC – MS .14 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 15 2.3.3 Đánh giá ảnh hưởng mẫu lên tín hiệu chất phân tích .16 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.3.5 Áp dụng phương pháp xác định mẫu thực tế thị trường 20 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .21 3.1 Xây dựng quy trình phân tích phương pháp LC – MS/MS 21 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích .21 3.1.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu .23 3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng mẫu lên tín hiệu chất phân tích .26 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 28 3.2.2 Độ chọn lọc 28 3.2.3 Giới hạn định lượng, giới hạn phát 31 3.2.4 Khoảng tuyến tính .31 3.2.5 Độ độ lặp lại 33 3.3 Ứng dụng phương pháp xác định hormon sinh dục mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thị trường 35 3.4 Bàn luận 36 3.4.1 Về xây dựng phương pháp phân tích 36 3.4.2 Về thẩm định phương pháp 37 3.4.3 Về kết phân tích 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 KẾT LUẬN 39 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ACN Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa phân tích thống APCI Atmospheric Chemical Ionization Ion hóa hóa học áp suất khí APPI Atmospheric Pressure Photonization Ion hóa photon áp suất khí EC European Commission Ủy ban Châu Âu E2 17β - Estradiol 17β - Estradiol ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử Ethanol absolute Ethanol tuyệt đối High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Liquid Chromatography– tandem Mass Spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng m/z mass to charge ratio Tỷ số khối lượng/điện tích ME Matrix effect Ảnh hưởng mẫu Methanol absolute Methanol tuyệt đối Multi Reaction Monitoring Theo dõi đa phản ứng MS Mass Spectrometry Khối phổ PG Progesterone Progesteron EtOH abs HPLC LC -MS/MS MeOH abs MRM RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SIM Selected Ion Monitoring Theo dõi chọn lọc ion Testosteron Testosteron TS DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1 Cấu tạo thiết bị khối phổ 11 Hình Cấu tạo tứ cục chập ba 12 Hình Quy trình xử lý mẫu dự kiến 15 Hình Sắc ký đồ khảo sát pha động hệ 22 Hình Biểu đồ khảo sát dung môi chiết 24 Hình 3 Biểu đồ khảo sát thời gian siêu âm .24 Hình Biểu đồ khảo sát nhiệt độ siêu âm 25 Hình Biểu đồ khảo sát chất làm 25 Hình Quy trình xử lý mẫu .26 Hình Biểu đồ đường chuẩn dung môi mẫu trắng PG 26 Hình Biểu đồ đường chuẩn dung môi mẫu trắng TS 27 Hình Biểu đồ đường chuẩn dung môi mẫu trắng E2 27 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn viên cứng, nang mềm, dạng lỏng PG 29 Hình 11 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn viên cứng, nang mềm, dạng lỏng TS 29 Hình 12 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn viên cứng, nang mềm, dạng lỏng E2 30 Hình 13 Biểu đồ đường chuẩn Progesteron mẫu 31 Hình 14 Biểu đồ đường chuẩn Testosteron mẫu .32 Hình 15 Biểu đồ đường chuẩn 17β-Estradiol mẫu 32 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1 Tính chất hormon nghiên cứu Bảng Các nghiên cứu thực để xác định hormon sinh dục Bảng Các hệ pha động khảo sát .15 Bảng 2 Yêu cầu độ lệch tương đối (Rdiff %) 17 Bảng Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) 19 Bảng Quy định độ thu hồi AOAC 20 Bảng Kết điều kiện tối ưu cho mảnh chất phân tích .21 Bảng Các thông số tối ưu cho thiết bị MS/MS 21 Bảng 3 Chương trình dung mơi pha động 23 Bảng Phương trình đường chuẩn PG 26 Bảng Phương trình đường chuẩn TS 27 Bảng Phương trình đường chuẩn E2 .27 Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng 28 Bảng Kết thẩm định độ phù hợp hệ thống 28 Bảng Bảng so sánh tỉ số ion 30 Bảng 10 Kết LOQ, LOD mẫu 31 Bảng 11 Phương trình đường chuẩn PG, TS, E2 mẫu 32 Bảng 12 Kết độ thu hồi độ lặp lại PG mẫu .33 Bảng 13 Kết độ thu hồi độ lặp lại TS mẫu .34 Bảng 14 Kết độ thu hồi độ lặp lại E2 mẫu .35 Bảng 15 Kết phân tích mẫu thực .36 ĐẶT VẤN ĐỀ Kinh tế xã hội ngày phát triển, mức sống người dân nâng cao, kéo theo nhu cầu sức khỏe ngày quan tâm Việc chăm sóc sức khỏe thân người trọng từ việc ăn uống, sử dụng thực phẩm chất lượng, giàu dinh dưỡng có nguồn gốc rõ ràng Gần đây, việc bổ sung vitamin, khoáng chất chất dinh dưỡng thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trở nên phổ biến Thực phẩm bảo vệ sức khỏe sản phẩm dùng để bổ sung vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm trì, tăng cường, cải thiện chức thể người, giảm nguy mắc bệnh (theo Nghị định 15/2018/NĐ-CP) Hiện nay, số TPBVSK có chứa thành phần hormon sinh dục Nhiều nhà sản xuất trộn trái phép hormon sinh dục (testosteron) nhằm nâng cao hiệu sản phẩm thúc đẩy mọc tóc, phát triển ngực, ngăn ngừa lão hóa da, thúc đẩy tăng trưởng… Tuy nhiên, ảnh hưởng tới sức khỏe người Đã có báo cáo dậy sớm, tăng tỷ lệ mắc ung thư vú ung thư tử cung có liên quan chặt chẽ với dư lượng hormon thực phẩm [43] Ở Việt Nam, Bộ Y tế ban hành Thông tư 10/2021/TTBYT quy định danh mục chất cấm sử dụng sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe [2] Theo thông tư này, số hormon bị cấm sử dụng có hormon sinh dục (testosteron) Ngồi 17β-estradiol liệt kê vào danh mục chất gây ung thư theo chương trình chất độc Quốc gia Hoa Kỳ [29] Vì vậy, cần có phương pháp phân tích để phát hormon sinh dục TPBVSK nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, tránh rủi ro cho sức khỏe người dân Đã có nhiều phương pháp phân tích khác nhằm phát hormon xét nghiệm miễn dịch hấp phụ kết hợp với enzym [25], sắc ký điện di micell [23], HPLC [10, 32, 34], UPLC-MS/MS [31], LC-MS/MS [8, 15, 37], GC-MS/MS [16, 26, 40] Hầu hết nghiên cứu trước tập trung vào mẫu sinh học (huyết tương, huyết thanh, nước tiểu), mẫu thực phẩm có nguồn gốc từ động vật (thịt lợn, thịt bò, sữa), mẫu nguồn gốc từ môi trường (nước thải) Trên mẫu thực phẩm chức năng, có nghiên cứu phát hormon sinh dục UPLC-MS/MS [43] HPLC-IT-TOF-MS [41] Hiện LC-MS/MS thường sử dụng phổ biến để phát hormon sinh dục thực phẩm độ nhạy cao đa dạng xử lý mẫu Tuy nhiên Việt Nam chưa có cơng bố xác định hormon sinh dục: progesterone (PG), testosteron (TS), 17β-estradiol (E2) TPBVSK LC-MS/MS Vì thế, đề tài thực nhằm hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định số hormon sinh dục (progesteron, testosteron, 17β-estradiol) thực phẩm bảo vệ sức khỏe phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC –MS/MS) Phụ lục 2.2 6: Kết E2 mảnh định lượng Phụ lục 2.3: Giới hạn định lượng (LOQ) mẫu Phụ lục 2.3 1: LOQ mẫu PG Phụ lục 2.3 2: LOQ mẫu TS Phụ lục 2.3 3: LOQ mẫu E2 Phụ lục 2.4: Kết đường chuẩn độ đúng, độ lặp lại Phụ lục 2.4 1: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại PG viên cứng Phụ lục 2.4 2: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại PG nang mềm Phụ lục 2.4 3: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại PG dạng lỏng Phụ lục 2.4 4: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại TS viên cứng Phụ lục 2.4 5: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại TS nang mềm Phụ lục 2.4 6: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại TS dạng lỏng Phụ lục 2.4 7: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại E2 viên cứng Phụ lục 2.4 8: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại E2 nang mềm Phụ lục 2.4 9: Kết đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại E2 dạng lỏng Phụ lục 3: Kết phân tích 16 mẫu thực Phụ lục 3.1 1: Kết phân tích mẫu thực dương tính với PG – mảnh định lượng Phụ lục 3.1 2: Kết phân tích mẫu thực dương tính với PG – mảnh định tính Phụ lục 3.2 1: Kết phân tích mẫu thực dương tính với TS – mảnh định lượng Phụ lục 3.2 2: Kết phân tích mẫu thực dương tính với TS – mảnh định tính