Nguyễn quang tùng xác định atropin và scopolamin trong thực phẩm, thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TÙNG XÁC ĐỊNH ATROPIN VÀ SCOPOLAMIN TRONG THỰC PHẨM, THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TÙNG MÃ SINH VIÊN: 1801745 XÁC ĐỊNH ATROPIN VÀ SCOPOLAMIN TRONG THỰC PHẨM, THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS Đặng Thị Ngọc Lan ThS Bùi Cao Tiến Nơi thực Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Để đề tài khóa luận thực hồn thành, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho phép em thực nghiên cứu Em xin cảm ơn ThS Bùi Cao Tiến trực tiếp hướng dẫn dạy em trình nghiên cứu thực nghiệm Em xin chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Ngọc Lan tận tình hướng dẫn, bảo góp ý giúp em hồn thiện khóa luận tốt Em xin cảm ơn thầy Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị Khoa Độc học Dị nguyên - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ, hướng dẫn dạy em suốt trình học tập thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ em suốt trình học tập nghiên cứu Do chưa có nhiều kinh nghiệm thực tế làm đề tài hạn chế kiến thức, khố luận chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận nhận xét góp ý từ q thầy để khố luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Quang Tùng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN Tổng quan atropin scopolamin 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Định danh tính chất vật lý hóa học 1.1.3 Độc tính 1.1.4 Các quy định hành ngưỡng cho phép TA Các phương pháp phân tích xác định atropin scopolamin 1.2.1 Các nghiên cứu xác định atropin scopolamin giới 1.2.2 Tổng quan phương pháp LC-MS/MS 11 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Đối tượng nghiên cứu 15 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 2.2.1 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 15 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 15 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Các dung dịch chuẩn thử dùng phân tích 16 2.3.2 Khảo sát điều kiện LC – MS/MS 16 2.3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 17 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng 17 2.3.5 Thẩm định phương pháp 18 2.3.6 Áp dụng phương pháp phân tích mẫu thực thị trường 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 Xây dựng quy trình phân tích LC – MS/MS 23 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích 23 3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 27 3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng mẫu 30 Thẩm định phương pháp phân tích 30 3.2.1 Độ chọn lọc 30 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 33 3.2.3 Giới hạn định lượng, giới hạn phát 34 3.2.4 Đường chuẩn khoảng tuyến tính: 35 3.2.5 Độ chụm độ 35 Kết phân tích mẫu thực 37 Bàn luận 38 3.4.1 Về xây dựng quy trình phân tích 38 3.4.2 Về thẩm định phương pháp: 39 3.4.3 Về kết phân tích 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 KẾT LUẬN 40 ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu ESI Tiếng Anh Electrospray Ionization Tiếng Việt Ion hóa phun điện tử Acetonitrile Acetonitrile AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội cộng đồng phân tích APCI Atmospheric Pressure Photonization Chế độ ion hóa học áp suất khí ATRO Atropin Atropin Collision Energy Năng lượng va chạm Collision cell Exit Potential Thế thoát khỏi ô va chạm d- SPE Solid Phase Extraction Kỹ thuật vi chiết pha rắn phân tán EC European Communities Ủy ban Châu Âu European Food Safety Authority Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu EU European Union Liên minh Châu Âu FIA The Flow Injection Analysis Kỹ thuật phân tích dịng chảy GC-MS Gas Chromatography/Mass Spectroscopy Phương pháp sắc ký khí kết hợp với phép đo khối phổ HPLCMS High performance Liquid chromatography - mass spectrometry Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp với phép đo khối phổ High resolution - Mass spectrometry MS phân giải cao Internal Standard Nội chuẩn Liquid chromatography– tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ lần LLE Liquid-Liquid Extraction Chiết lỏng - lỏng LOD Limit Of Detection Giới hạn phát LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng LR - MS Low Resolution - Mass Spectrometry MS phân giải thấp m/z mass to charge ratio Khả phân tích số khối ME Matrix effect Ảnh hưởng mẫu Multiple reaction monitoring Chế độ theo dõi đa phản ứng MS Mass spectrometry Phép đo khối phổ PSA Primary Secondary Amine Amin thứ cấp ACN CE CXP EFSA HR - MS IS LCMS/MS MRM Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe Nhanh chóng, dễ dàng, rẻ tiền, hiệu quả, chắn an toàn Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Rapid Alert System for Food and Feed Hệ thống cảnh báo nhanh thực phẩm thức ăn chăn nuôi SCO Scopolamin Scopolamin SLE solid – liquid extraction Chiết rắn-lỏng SPE Solid Phase Extraction Kỹ thuật vi chiết pha rắn TA Tropane alcaloid Tropane alcaloid QuEChE RS RSD RASFF UHPLC – Ultra-high performance liquid MS/MS chromatography -MS/MS Sắc ký lỏng hiệu cực cao kết hợp khối phổ hai lần USFDA The United States Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ USP The United States Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1 Định danh hóa học atropin scopolamin Bảng Tính chất lý hóa atropin scopolamin Bảng Độc tính atropin theo liều lượng Bảng Sự xuất Tropan alcaloid thực phẩm Bảng Các phương pháp nghiên cứu xác định atropin scopolamin thực phẩm Bảng Quan hệ kỹ thuật khối phổ với số điểm IP đạt 18 Bảng 2 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 19 Bảng Tỷ lệ ion kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 19 Bảng Độ lặp lại độ nồng độ khác 21 Bảng Các điều kiện phân tích atropin scopolamin ESI (+) – MS/MS 23 Bảng Các thông số tối ưu cho thiết bị MS 23 Bảng 3 Chương trình gradient pha động 24 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết 28 Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu 30 Bảng So sánh tỉ số ion atropin scopolamin dung môi, mẫu 32 Bảng Kết thời gian lưu atropin scopolamin, Atropin – D5 33 Bảng Kết diện tích pic tỉ số Spic chất phân tích/Spic Atropin –D5 33 Bảng Kết khảo sát LOD LOQ 34 Bảng 10 Đường chuẩn atropin scopolamin 35 Bảng 11 Kết độ thu hồi độ lặp lại 36 Bảng 12 Độ tái lặp nội atropin scopolamin ngũ cốc 37 Bảng 13 Kết xác định hàm lượng atropin scopolamin mẫu thực phẩm 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học atropin scopolamin Hình Mơ hình hệ thống LC - MS/MS 12 Hình Cấu tạo tứ cực chập ba 13 Hình Cấu trúc hóa học Atropin – D5 16 Hình Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 17 Hình Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động 26 Hình Biểu đồ khảo sát dung môi chiết 28 Hình 3 Biểu đồ khảo sát thời gian chiết rắn - lỏng 28 Hình Biểu đồ khảo sát muối chiết 29 Hình Biểu đồ kết khảo sát muối làm d - SPE 29 Hình Sắc ký đồ atropin mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 31 Hình Sắc ký đồ scopolamin mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 31 Hình Sắc ký đồ Atropin –D5 mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn 32 Hình Sắc kí đồ giá trị LOQ atropin scopolamin 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Atropin scopolamin chất độc tự nhiên có cấu trúc Tropan alcaloid (TA) có thuộc họ Solanaceae số họ khác (như Brassicaceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Convulvulaceae) [7, 10, 35] Thực vật thuộc họ Solanaceae nguồn lây nhiễm TA vào thực phẩm phổ biến với loài Datura, Hyoscyamus Atropa Nguyên nhân chúng phát triển dễ dàng tự nhiên mọc lẫn loại lương thực khác Các alcaloid tìm thấy hạt, lá, rễ, hoa, bị lây nhiễm chéo với loại lương thực thu hoạch máy móc [10, 40] Hạt Datura stramonium (cỏ dại jimson táo gai), loài Datura khác D ferox loại xuất nhiều thực phẩm [7] Chúng phân bố rộng rãi vùng ấm áp giới Những hạt thường xác định tạp chất loại hạt lanh, đậu nành, kê, hướng dương kiều mạch [23] Vào năm 2015, Ủy ban Châu Âu khuyến nghị phải kiểm soát TA (chủ yếu atropin scopolamin) thực phẩm, đặc biệt thực phẩm chế biến từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ [30] Các thực phẩm dễ bị nhiễm TA sản phẩm không chứa gluten, thực phẩm bổ sung, trà thảo dược, họ đậu, hạt chứa dầu, ngũ cốc sản phẩm chế biến từ kiều mạch, lúa miến, kê, ngô… Tại Việt Nam, atropin scopolamin có Cà độc dược - Datura metel L mọc hoang nhiều nơi Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh… Trong vùng trồng lương thực thảo dược, cà độc dược nguồn lây nhiễm atropin scopolamin vào nông sản [3] Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có khuyến cáo phơi nhiễm atropin scopolamin thực phẩm chưa có phương pháp xác định Tropan alcaloid có thực phẩm Vì vậy, nhóm nghiên cứu thực đề tài “Xác định atropin scopolamin thực phẩm, thực phẩm chức kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng atropin scopolamin thực phẩm LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng atropin scopolamin số thực phẩm, thực phẩm chức lưu hành thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất Y học, 107 - 122 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh (2022), Một số phương pháp sắc ký dùng phân tích thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội, 27 - 98 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, 700 – 701 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, - 60 Mai Tất Tố (2007), Dược lý học tập 1, Nhà xuất Y học, 181-183 Tiếng Anh Adamse P., Egmond H., et al (2014), "Tropane alcaloids in food: poisoning incidents", Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, 6(1), pp 15-24 Alexander J., Benford D., Cockburn A., et al (2008), "Tropane alcaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed—Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain.", EFSA, pp 1-55 AOAC Official Method of Analysis (2012), "Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements" Ardrey R.E (2003), Liquid Chromatography - Mass Spectrometry: An Introduction, Wiley 10 European Food Safety Authority (2013), "Scientific Opinion on Tropane alcaloids in food and feed", EFSA Journal, 11(10), pp 1-113 11 Boros B., et al (2010), "LC-MS quantitative determination of atropine and scopolamine in the floral nectar of Datura species", Chromatographia, 71, pp 4349 12 Cirlini M., et al (2018), "Are tropane alcaloids present in organic foods? Detection of scopolamine and atropine in organic buckwheat (Fagopyron esculentum L.) products by UHPLC–MS/MS", Food chemistry, 239, pp 141-147 13 Clissold S P and Heel R C (1985), "Transdermal hyoscine (scopolamine) a preliminary review of its pharmacodynamic properties and therapeutic efficacy", Drugs, 29, pp 189-207 14 European Commission (2016), Commission Regulation (EU) 2016/239 of 19 February 2016 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of tropane alcaloids in certain cereal-based foods for infants and young children 15 European Commission (2021), Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 16 Debnath B., et al (2018), "Role of plant alcaloids on human health: A review of biological activities", Materials Today Chemistry, 9, pp 56-72 17 Dey P., et al (2020), "Analysis of alcaloids (indole alcaloids, isoquinoline alcaloids, tropane alcaloids)", Recent advances in natural products analysis, 2020, pp 505567 18 Dräger B (2002), "Analysis of tropane and related alcaloids", Journal of Chromatography A, 978 (1-2), pp 1-35 19 Hardman J.G., Limbird P.B., Gilman A.G (2001), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed, NY: McGraw-Hill, 162 20 Hebel S K (1998), Drug Facts and Comparison: Pocket Version, Facts and comparison 21 Kowalczyk E and Kwiatek K (2022), "Simultaneous determination of pyrrolizidine and tropane alcaloids in honey by liquid chromatography–mass spectrometry", Journal of Veterinary Research, 66 (2), pp 235-243 22 Lauwers L.F., et al (1983), "Scopolamine intoxications", Intensive care medicine, 9, pp 283-285 23 Martinello M., et al (2017), "Development and validation of a QuEChERS method coupled to liquid chromatography and high resolution mass spectrometry to determine pyrrolizidine and tropane alcaloids in honey", Food chemistry, 234, pp 295-302 24 Moore P W., Rasimas J J., and Donovan J W (2015), "Physostigmine is the Antidote for Anticholinergic Syndrome", Journal of Medical Toxicology, 11 (1), pp 159-160 25 Mulder P J., et al (2016), "Occurrence of tropane alcaloids in food", EFSA Supporting Publications, 13 (12), p 1140E 26 Renner U D , Oertel R., and Kirch W (2005), "Pharmacokinetics and pharmacodynamics in clinical use of scopolamine", Therapeutic drug monitoring, 27 (5), pp 655-665 27 Riad M and Hithe C C (2021), "Scopolamine", StatPearls [Internet], StatPearls Publishing 28 Smith E A , et al (1991), "Scopolamine poisoning from homemade ‘moon flower’wine", Journal of analytical toxicology, 15 (4), pp 216-219 29 Spinks A and Wasiak J (2011), "Scopolamine (hyoscine) for preventing and treating motion sickness", Cochrane database of systematic reviews, (6) 30 European Union (2015), "Commision Recommendation (EU) 2015/976 of 19 June 2015 on the monitoring of the presence of tropane alcaloids in food", Off J Eur Union, 11, pp 97-98 31 European Union (2021), "Commission regulation (EU) 2021/1408 of 27 August 2021 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of tropane alcaloids in certain foodstuffs", Off J Eur Union, 304, pp 1-4 32 Wink M (2016), "Alcaloids: Toxicology and health effects", Encyclopedia of food and health, p 106-114 33 European Food Safety Authority, et al (2018), "Human acute exposure assessment to tropane alcaloids", EFSA J., 16(2), p e05160 34 Abia W A., et al (2021), "Tropane alcaloid contamination of agricultural commodities and food products in relation to consumer health: Learnings from the 2019 Uganda food aid outbreak", Compr Rev Food Sci Food Saf, 20 (1), pp 501525 35 Aehle E and Drager B (2010), "Tropane alcaloid analysis by chromatographic and electrophoretic techniques: an update", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 878 (17-18), pp 1391-406 36 Basle Q., Mujahid C., and Bessaire T (2020), "Application of a streamlined LC MS/MS methodology for the determination of atropine and scopolamine in cereals from Asian and African countries", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 37 (10), pp 1744-1754 37 Castilla-Fernandez D., et al (2021), "Determination of atropine and scopolamine in spinach-based products contaminated with genus Datura by UHPLC-MS/MS", Food Chem, 347, p 129020 38 Goncalves C., Cubero-Leon E., and Stroka J (2020), "Determination of tropane alcaloids in cereals, tea and herbal infusions: Exploiting proficiency testing data as a basis to derive interlaboratory performance characteristics of an improved LC MS/MS method", Food Chem, 331, p 127260 39 Gyermek L (2002), "Structure-activity relationships among derivatives of dicarboxylic acid esters of tropine", Pharmacol Ther, 96 (1), pp 1-21 40 Kohnen-Johannsen K L and Kayser O (2019), "Tropane Alcaloids: Chemistry, Pharmacology, Biosynthesis and Production", Molecules, 24 (4) 41 Robenshtok E., et al (2002), "Adverse reaction to atropine and the treatment of organophosphate intoxication", Isr Med Assoc J, (7), pp 535-9 42 Romera-Torres A., et al (2018), "Simultaneous analysis of tropane alcaloids in teas and herbal teas by liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry (Orbitrap)", J Sep Sci, 41 (9), pp 1938-1946 43 Versilovskis A., et al (2020), "Simultaneous quantification of ergot and tropane alcaloids in bread in the Netherlands by LC-MS/MS", Food Addit Contam Part B Surveill, 13 (3), pp 215-223 44 Romera-Torres A., et al (2018), "Analytical methods, occurrence and trends of tropane alcaloids and calystegines: An update", J Chromatogr A, 1564, pp 1-15 PHỤ LỤC Trang PL Phụ lục Kết khảo sát pha động Phụ lục Kết khảo sát xử lý mẫu Phụ lục 2.1 Khảo sát dung môi chiết Phụ lục 2.2 Khảo sát thời gian chiết Phụ lục 2.3 Khảo sát muối chiết Phụ lục 2.4 Khảo sát muối làm d-SPE Phụ lục Kết thẩm định phương pháp Phụ lục 3.1 Độ ổn định hệ thống Phụ lục 3.2 Độ chọn lọc tỉ số ion Phụ lục 3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính Phụ lục 3.4 Độ thu hồi độ lặp lại Phụ lục 3.5 Độ tái lặp Phụ lục Kết phân tích mẫu thực Phụ lục 4.1 Sắc kí đồ Atropine mẫu dương tính Phụ lục 4.2 Sắc kí đồ Scopolamine mẫu dương tính 10 Phụ lục Kết khảo sát pha động Phụ lục Kết khảo sát xử lý mẫu Phụ lục 2.1 Khảo sát dung môi chiết PL - Phụ lục 2.2 Khảo sát thời gian chiết Phụ lục 2.3 Khảo sát muối chiết Phụ lục 3.4 Khảo sát muối làm d-SPE PL - Phụ lục 2.4 Khảo sát muối làm d-SPE Phụ lục Kết thẩm định phương pháp PL - Phụ lục 3.1 Độ phù hợp hệ thống PL - Phụ lục 3.2 Độ chọn lọc tỉ số ion PL - Phụ lụ 3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính PL - Phụ lục 3.4 Độ thu hồi độ lặp lại PL - Phụ lục 3.5 Độ tái lặp PL - Phụ lục Kết phân tích mẫu thực Phụ lục 4.1 Sắc kí đồ atropin mẫu dương tính PL - Phụ lục 4.2 Sắc kí đồ scopolamin mẫu dương tính PL - 10