HOÀNG THU HUYỀN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYM XYLANASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THU HUYỀN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYM XYLANASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THU HUYỀN MÃ SINH VIÊN: 1401284 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA ENZYM XYLANASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh TS Đỗ Thị Tuyên Nơi thực hiện: Viện Công nghệ sinh học Bộ mơn Hóa Sinh HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian năm năm học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên dạy kiến thức chuyên môn tạo điều kiện tốt giúp em học tập, rèn luyện thực khóa luận suốt q trình thực tập phòng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô người thầy tận tâm giúp em tìm đam mê mình, giúp em định hướng bước đường học tập nghiên cứu khoa học, mà điểm tựa cho em lời khuyên chân thành sống, tiếp thêm động lực cho em suốt thời gian qua Đây hành trang quý giá để em tự tin, vững chãi đường nghiệp sống mai Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè ln bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2019 Sinh Viên Hoàng Thu Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Enzym xylanase 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Phân bố tự nhiên 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Cấu trúc 1.1.5 Gen mã hóa 1.1.6 Đặc điểm xúc tác, chất .7 1.1.7 Tính chất lý hóa 10 1.1.8 Ứng dụng .10 1.2 Chủng Aspergillus oryzae 13 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 13 1.2.2 Hình thái, gen di truyền 13 1.2.3 Điều kiện nuôi cấy 14 1.2.4 Ứng dụng 14 1.3 Xylanase từ chủng Aspergillus oryzae 15 1.3.1 Cấu trúc 15 1.3.2 Đặc điểm lý hóa 17 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất xylanase 17 1.4.1 Trên giới 17 1.4.2 Ở Việt Nam 19 PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 21 2.1.1 Chủng giống 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Môi trường 22 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp 24 2.3.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase 24 2.3.2 Xác định hoạt tính enzym xylanase 24 2.3.3 Xác định hàm lượng protein 26 2.3.4 Tinh xylanase 27 2.3.5 Điện di SDS-PAGE 29 2.3.6 Xác định tính chất lý hóa xylanase 29 2.3.7 Xử lý số liệu 30 PHẦN THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Kết 32 3.1.1 Kết tinh xylanase 32 3.1.2 Kết nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase 38 3.2 Bàn luận 46 3.2.1 Tinh xylanase từ chủng A.oryzae VTCC-F-187 46 3.2.2 Đánh giá tính chất lý hóa xylanase tinh từ chủng A.oryzae VTCCF-187 .49 CHƯƠNG KẾT LUẬN 52 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ 53 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh APS Ammonium persulphat BSA Bovine Serum Albumin cs Tiếng Việt Albumin huyết bò Cộng CBB Coomassie brilliant blue DNS Dinitro salysilic acid DEAE Diethylaminoethyl EC The Enzyme Commission EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid EST Expressed Sequence Tag GH Glycosid hydrolase KP Kali phosphat MW Molecular weight OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfat PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin Tris Tris –(hydroxymethyl)-aminomethan VTCC Vietnam Type Culture Collection Tiểu ban Enzym DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm hóa lý số xylanase ngoại bào A oryzae 17 Bảng 1.2 Đặc điểm, tính chất số xylanase sinh tổng hợp từ vi sinh vật 18 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 21 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 22 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 23 Bảng 2.4 Thành phần gel cô gel tách 29 Bảng 3.1 Kết xác định hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 33 Bảng 3.2 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 .33 Bảng 3.3 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đổi ion DEAESephadex 36 Bảng 3.4 Tóm tắt trình tinh xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 38 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase chủng nấm A oryzae VTCC-F-187 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 41 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 theo thời gian 42 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH tới độ bền xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 theo thời gian 44 Bảng 3.10 Ảnh hưởng chất ức chế lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vị trí xúc tác xylanase enzym khác trình thủy phân xylan Hình 1.2 Các yếu tố tương đồng chuỗi acid số xylanase Hình 1.3 Cấu trúc cuộn thùng xylanase họ 10 (2F8Q) Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian xylanase họ 11 tách chiết từ chủng Bacillus subtilis Hình 1.5 Cấu trúc phần chuỗi nucleotid gen mã hóa xylanase chủng Clostridium acetobutylicum P262 Hình 1.6 Dạng tồn xylan gỗ cứng Hình 1.7 Dạng tồn xylan gỗ mềm Hình 1.8 Mơ hình hoạt động xylanase Hình 1.9 Cấu trúc phân tử số dẫn xuất trung gian để tổng hợp thuốc điều trị ung thư, kháng virus điều chế từ xylose 12 Hình 1.10 Đặc điểm hình thái A oryzae 13 Hình 1.11 Cấu trúc NST A oryzae 14 Hình 1.12 Cấu trúc không gian xylanase từ A oryzae HML366 16 Hình 1.13 Các cấu trúc 3D điểm đầu cuối N AoXyn11A ATX11A41 16 Hình 1.14 Các cấu trúc 3D vùng “cord” AoXyn11A ATX11A41 17 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 24 Hình 2.2 Đường chuẩn xylose 26 Hình 2.3 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 27 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tinh xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 27 Hình 3.1 Hoạt tính xylanase dịch enzym thơ từ chủng A oryzae VTCC-F-187 định tính đĩa thạch 32 Hình 3.2 Ống đối chứng ống thử phản ứng xác định hoạt độ xylanase 33 Hình 3.3 Sắc ký đồ qua cột Sephadex G-75 34 Hình 3.4 Hoạt tính xylanase định tính đĩa thạch số phân đoạn qua cột Sephadex G-75 35 Hình 3.5 Điện di đồ SDS-PAGE qua cột Sephadex G-75 35 Hình 3.6 Sắc ký đồ qua cột DEAE-Sephadex 36 Hình 3.7 Hoạt tính xylanase định tính đĩa thạch số phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex 37 Hình 3.8 Điện di đồ SDS-PAGE qua cột DEAE-Sephadex 37 Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase chủng nấm A oryzae VTCC-F-187 39 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 40 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 41 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F187 theo thời gian 43 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH tới độ bền xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 theo thời gian 44 Hình 3.14 Ảnh hưởng chất ức chế lên hoạt tính xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Xylanase (Endo-1,4--xylanase (EC 3.2.1.8)) nhóm enzym có khả thủy phân polysaccharid mạch thẳng -1,4-xylan, loại hemicellulose phổ biến tự nhiên, thành oligosacharid ngắn (oligoxylose) xylose Trên giới, xylanase nghiên cứu từ lâu [27], [74], [77], phải tới năm gần đây, nhu cầu sử dụng xylanase dần tăng cao Với đặc tính thủy phân mình, xylanase khơng ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp giấy, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất cồn nhiên liệu, mà cơng cụ hiệu tổng hợp xylose, loại đường chức ngày có nhiều ứng dụng quan trọng ngành Dược Trong số ứng dụng quan tâm nhiều xylose ngành Dược, kể đến vai trò thay glucose chế độ ăn cho người bị tiểu đường [22], chất ức chế ngăn chặn gia tăng glucose insulin sau ăn [15] hay sử dụng thử nghiệm đánh giá khả hấp thu chất dinh dưỡng hợp lý đường tiêu hóa [88] Đặc biệt, năm gần nhà Dược học ý tới ứng dụng tiềm khác xylose sử dụng chúng để tổng hợp dẫn xuất trung gian điều chế thuốc điều trị ung thư, kháng virus HIV [12] Nhiều dạng chế phẩm xylanase thương mại hóa bán thị trường giới Theo báo cáo công bố Gen Consulting Company, thị trường xylanase tồn cầu dự đốn tăng trưởng với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm kép 6,6% vào năm 2023 [26] Đây lý thúc nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu nguồn tổng hợp, đặc tính vượt trội, phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh xylanase Không nằm xu hướng chung này, Việt Nam, xylanase bắt đầu quan tâm nghiên cứu sinh tổng hợp tự nhiên sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp [1], [2], [3], [5], [6], [10] Trong nguồn sinh vật sản xuất xylanase, chi nấm Aspergillus sp trong nhân tố có suất sinh tổng hợp xylanase cao Đặc biệt, loài Aspergillus oryzae (A oryzae) đối tượng tiềm nhà khoa học giới quan tâm nghiên [30], [43], [45], [49] Bên cạnh ưu điểm sinh tổng hợp xylanase có hoạt tính cao, xylanase sản xuất từ A oryzae có số đặc tính vượt trội có vùng cấu trúc đặc hiệu dùng kỹ thuật đột biến, protein tái tổ hợp tác động làm tăng đáng kể hiệu xúc tác khả chịu nhiệt [40], [56], [57] chất vật lý hóa học mẫu giữ nguyên Sắc ký có tác dụng loại muối, phân tử chất tạp có kích thước nhỏ, tinh phân tử sinh chất mẫu nhỏ; có tác dụng đặc dung dịch protein enzym [38], [66] Tuy sắc ký lọc gel có ưu điểm phương pháp tồn nhược điểm thấy rõ protein có kích thước loại sắc ký khó tách biệt Chính vậy, việc kết hợp với sắc ký trao đổi ion giúp giải vấn đề Các protein enzym nói chung hấp phụ lực ion thấp với điện tích đối hạt ionit Sự tách rửa protein thực dễ dàng cách thay đổi pH tăng lực ion dung dịch rửa giải Các protein có tích điện khác nhau, lực liên kết ion khác chiết khỏi cột theo phân đoạn chiết khác nhau; từ thu phân đoạn có nồng độ enzym cần tinh cao [28], [51] Trong loại sắc ký phương pháp sắc ký lọc gel, chọn Sephadex Sephadex chế phẩm dextran xử lý hóa học (do tác dụng epichlohidrin) để tạo lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi "sàng phân tử" chất trở thành không tan nước Số liên kết ngang tạo nhiều, kích thước lỗ sàng phân tử nhỏ [38], [66] Chính vậy, ngun liệu thỏa mãn yêu cầu trình bày để đảm bảo cho việc tách protein enzym tốt Không thế, ưu điểm Sephadex vừa có khả phục hồi hoạt động cao, tái sử dụng sau khử trùng bảo quản chất sát khuẩn, vừa có chi phí thấp loại sắc ký lọc gel phù hợp loại xylanase so với Superdex hay Sephacryl [90] Điều mang đến lợi lớn chi phí điều kiện thí nghiệm Việt Nam Sau tinh loại bỏ tạp protein có kích thước nhỏ đặc phân đoạn có hoạt tính xylanase cao, chúng tơi sử dụng cột sắc ký trao đổi ion âm DEAE – Sephadex cho bước tinh Loại sắc ký trao đổi ion yếu có ưu điểm phù hợp với enzym cần tinh Thứ chúng có tính khả thi cao mặt chọn lọc lựa chọn phổ biến cho việc tách protein không bền cần rửa giải điều kiện không khắc nghiệt Thứ hai, chúng có chi phí thấp so với DEAE – Sepharose Thứ ba, chúng có độ bền vật lý hóa học tốt DEAE -Sephacyl [89], [90] Trên giới, đa phần nghiên cứu tinh xylanase sử dụng hai loại cột [58], [64] thu xylanase có độ cao hiệu suất thu hồi thấp Một số nghiên cứu sử dụng cột sắc ký trao đổi ion âm mạnh cột Mono Q 47 [45], Econo Pac High Q [9], hay sử dụng liên tiếp lặp lại hai phương pháp sắc ký với cột khác [9], kết tăng hiệu suất thu hồi độ tinh hoạt tính xylanase giảm đáng kể Trong nghiên cứu trước đây, nhóm chúng tơi sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-100, G-200 sắc ký trao đổi ion DEAE –Sephadex để tinh xylanase từ số chủng Aspergillus A awamori [1], A oryzae DSM1863 [35] thu enzym có độ hiệu suất thu hồi tương đối cao (lên đến 11 lần 28% [35]) Chính vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng phương pháp kết hợp hai sắc ký để tinh xylanase từ chủng A.oryzae VTCC-F-187 Trong chúng tơi sử dụng loại Sephadex G-75 khoảng khối lượng phân tử protein Sephadex G-75 (3-80 kDa) phù hợp với xylanase từ A oryzae hơn, đồng thời chi phí thấp so với Sephadex loại (G-100, G200) [90] Ngoài ra, bước tinh qua sắc ký trao đổi ion, sử dụng đệm mẫu với gradient lực ion (gradient nồng độ NaCl) để làm tăng chất lượng phân tách protein Kết là, thu xylanase với độ tinh tăng 3,91 lần, hiệu suất thu hồi đạt 24,9% hoạt tính enzym tinh 128,6 IU/ml Kết độ (3,91 lần) nói kết khiêm tốn so với số nghiên cứu tương tự nước giới [1], [35], [45], [58], [64] Nguyên nhân do, thứ phương pháp, số nghiên cứu nước ngồi có kết hợp thêm phương pháp tủa muối amonisulfat [58], [64] loại bớt protein tạp; số khác sử dụng loại sắc ký có độ nhạy cao hệ thống sắc ký áp suất BioLogic DuoFlow [45]; có nghiên cứu sử dụng liên tiếp lặp lại xen kẽ hai loại sắc ký trao đổi ion lọc gel [9] Thứ hai chất lượng hệ thống sắc ký, nghiên cứu chủ yếu sử cột sắc ký nhồi sẵn MonoQ [45], với hệ thống máy thu mẫu phân tích chất lượng cao sử dụng với lượng mẫu lớn Tuy nhiên, phương pháp hệ thống tốn kém, chi phí cao gấp nhiều lần so với nghiên cứu chúng tơi Thêm vào đó, xylanase tinh từ nghiên cứu có hoạt tính hiệu suất thu hồi thấp: 28 IU/ml [64], 21 IU/ml [1], 4-10% [64], [45] Kết nghiên cứu tinh xylanase với hiệu suất thu hồi mức cao đặc biệt hoạt tính đạt mức cao đáng kể so với nghiên cứu tương tự, tương ứng 24,9% 128,6 IU/ml; chi phí nguyên liệu cho trình tinh thấp Vì vậy, 48 xem xét cách tổng quát, với nguồn sản xuất xylanase dồi A oryzae VTCC-F-187, kết bước đầu mà thu tương đối khả quan Về khối lượng phân tử xylanase, kết phù hợp với kết nghiên cứu tương tự Khối lượng phân tử xylanase từ Aspergillus sp trải rộng khoảng 20-60 kDa có số báo cáo xylanase có khối lượng phân tử khoảng thấp 20 kDa Tuy nhiên đa số kết tinh xylanase từ chủng Aspergillus sp thu enzym có khối lượng phân tử khoảng 21-39 kDa [1], [2], [9], [30], [35], [43], [45], [58], [64] Kết điện di đồ phân đoạn qua cột Sephadex G-75 xuất băng đậm có kích thước khoảng 55 kDa 32 kDa Nhưng qua bước tinh sắc ký trao đổi ion DEAE điện di đổ phân đoạn có hoạt độ xylanase cao băng đậm vị trí khoảng 32 kDa Như vậy, bước đầu nhận định xylanase tinh nghiên cứu chúng tơi có khối lượng tử khoảng 32 kDa Bước tiếp theo, cần tiếp tục giải trình tự băng protein để hiểu rõ cấu trúc enzym 3.2.2 Đánh giá tính chất lý hóa xylanase tinh từ chủng A.oryzae VTCCF-187 Việc xác định đánh giá tính chất lý hóa enzym quan trọng Lý vì, thứ nhất, yếu tố thời gian phản ứng, nhiệt độ, pH, chất ức chế, chất hoạt hóa, ion kim loại yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu phản ứng mà enzym xúc tác Vì vậy, xác định giá trị tối ưu đánh giá ảnh hưởng yếu tố phản ứng thủy phân chất enzym giúp tìm điều kiện mà hoạt tính enzym thể mạnh nhất; từ phản ứng thủy phân đạt hiệu Thứ hai, trình sản xuất enzym tinh tốn kinh tế lẫn thời gian việc bảo quản cho hoạt tính enzym trì lâu bền vấn đề xem nhẹ Do đó, xác định nhiệt độ, pH mơi trường mà enzym bền mức độ ức chế hoạt tính enzym chất hóa học giúp tìm điều kiện bảo quản tối ưu đưa khuyến cáo tránh yếu tố gây biến tính enzym mạnh (nhiệt độ cao, pH acid, kiềm, ion kim loại, ) cho bên sử dụng enzym Thứ ba, mục đích cuối việc sản xuất loại xylanase thương mại hóa, đặc biệt thị trường Việt Nam, mà nhu cầu xylanase dần tăng lên xong phải nhập từ nước ngồi với tổng chi phí cao chi phí nguyên liệu lẫn chi phí vận chuyển quốc tế Do vậy, khảo sát 49 đặc tính loại xylanase tự nhiên, tìm phát tính chất ưu trội xylanase này, từ đó, giúp cho sản phẩm có ưu thương mại hóa nước xa cạnh tranh với sản phẩm thị trường Chính vậy, chúng tơi tiến hành xác định, đánh giá tính chất lý hóa quan trọng xylanase tinh từ chủng A oryzae VTCC-F-187 Trước tiên, kết khảo sát cho thấy xylanase tinh từ chủng A oryzae VTCCF-187 có đa số tính chất lý hóa tương đồng với xylanase khác nghiên cứu tương tự Thông số thứ nhất, thời gian phản ứng tối ưu phút [1], [62] Enzym bị biến tính điều kiện nhiệt độ phản ứng cao 50-60oC thời gian phản ứng lâu Nhưng thời gian phản ứng q nhanh (2-4 phút) gây sai số nhiều thao tác chuẩn bị mẫu enzym-cơ chất chuyển vào máy ủ nhiệt Thông số thứ hai, pH phản ứng tối ưu 6,0-6,5 nằm khoảng pH phản ứng tối ưu đa số xylanase từ Aspergillus sp 5,0-6,5 [1], [23], [30], [35], [45], [58], [71] Độ bền nhiệt xylanase nghiên cứu khoảng 25-37oC (hoạt tính 75% sau ủ), tương đồng với số nghiên cứu trước chúng tơi [1], [35] Bên cạnh đó, xylanase tinh từ chủng A oryzae VTCC-F-187 nghiên cứu chúng tơi có tính chất khác biệt so với đa số xylanase từ Aspergillus nghiên cứu tương tự Nhiệt độ phản ứng tối ưu 60oC cho thấy xylanase từ A oryzae VTCC-F-187 phản ứng tốt nhiệt độ cao so với xylanase từ Aspergillus sp nhiều nghiên cứu khác [64], [58], [53], [1] với nhiệt độ phản ứng tối ưu khoảng 40-55oC Điều lợi xylanase chủng A oryzae VTCC-F-187 cạnh tranh ngành mà đòi hỏi phản ứng xúc tác nhiệt độ cao Một tính chất cần ý độ bền cao mơi trường pH acid (3-5) Nhìn chung xylanase từ nấm bền dải pH 5,0-10,0 [23], [45], [71] Như vậy, với đa số xylanase từ nấm bền môi trường trung tính hay kiềm, xylanase từ A oryzae VTCC-F-187 bền mơi trường acid Tính chất có khả bền chịu mức pH acid thấp (3,0) ưu quan trọng ứng dụng phản ứng có mặt acid pH thấp Ví dụ công đoạn tẩy trắng bột giấy, xylanase thường thêm vào với acid nước, để đảm bảo cho phân tán đầy đủ enzym vào bột giấy [76] Cuối cùng, dựa nghiên cứu độ ổn định hoạt tính xylanase trước [1], [35], [34], chúng tơi chọn số chất có khả gây ức chế xylanase để thử mức độ ảnh hưởng chúng lên 50 hoạt tính xylanase tinh từ A oryzae VTCC-F-187 Kết cho thấy, xylanase từ chủng nghiên cứu chịu ảnh hưởng đa số chất (hoạt tính lại lên đến 85% sau ủ) Hai chất có tác động ức chế xylanase mạnh EDTA 10mM (còn gần 75% hoạt tính) SDS 2% (v/v) (còn gần 55% hoạt tính) Kết có phần ưu trội số sản phẩm tương tự: xylanase từ A oryzae DSM1863 bị ức chế hoàn toàn SDS 2% (v/v), hoạt tính xylanase từ A niger DSM 1957 36,2% hoạt tính ủ với SDS gần 50% ủ với dimethyl sulfoxid [34] Như vậy, xylanase tinh từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-187 nghiên cứu chúng tơi có số đặc điểm tiềm phản ứng hiệu nhiệt độ cao hơn, có độ bền pH tốt mơi trường acid, chịu ảnh hưởng chất ức chế Những kết cho phép hy vọng vào sản phẩm xylanase với lợi cạnh tranh ưu thị trường 51 CHƯƠNG KẾT LUẬN Sau tiến hành tinh đánh giá tính chất lý hóa enzym xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC F-187, rút kết luận sau: Qua hai bước tinh cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 cột sắc ký trao đổi ion DEAE, bước đầu tinh xylanase có khối lượng phân tử khoảng 32 kDa, hoạt tính 128,6 IU/ml, độ tăng so với enzym thô ban đầu 3,91 lần, với hiệu suất thu hồi 24,9 % Xylanase tinh hoạt động tốt pH 6,5 nhiệt độ 60oC, bền 2537oC dải pH 3-5 Một số chất EDTA 10mM, SDS 2% ức chế hoạt động enzym 52 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ Giải trình tự băng có kích thước khoảng 32 kDa xác định cấu trúc enzym tinh Nghiên cứu quy trình tinh khác để nâng cao độ quy mô tinh xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-187 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đàm Thị Hồng, Đỗ Thị Tuyên (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng nấm Aspergilus awamori sinh tổng hợp xylanase đánh giá tính chất lý hóa xylanase tinh sạch, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Mở Hà Nội Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus niger DSM1957 Aspergillus oryzae DSM 1863 sinh tổng hợp xylanase.", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(3), pp 1-7 Hồng Quốc Khánh, Ngơ Đức Duy (2012), "Thu nhận enzyme cellulase xylanase từ giá thể trồng nấm sau thu hoạch thử nghiệm xử lý rơm rạ.", Tạp chí Sinh học 34(3SE), pp 89-90 Nguyễn Hữu Quân, Quyền Đình Thi (2009), Tuyển chọn, ni cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase xác định tính chất lý hóa nó, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Sư phạm Thái Nguyên Nguyễn Nhật Minh Phương, Evelien De Baker (2009), "Phân lập xác định số đặc điểm sinh học enzym xylanase từ lúa mì nảy mầm.", Tạp chí Khoa học, 11, pp 310-316 Nguyễn Sĩ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis G1 sinh tổng hợp xylanase.", Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, pp 439-442 Nguyễn Thị Thương Thương., Trần Liên Hà (2010), Nghiên cứu đặc tính enzym xylanase nấm mốc Aspergillus niger, tách dòng biểu gen mã hóa xylanase E coli BL21, Khóa luận tốt nghiệp Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Văn Lâm, Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hương Thuỷ (2012), "Khảo sát so sánh hàm lượng petosan số hạt ngũ cốc Việt Nam", Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(5), pp 758-763 Phương Phú Công (2008), Tuyển chọn nghiên cứu ứng dụng số chủng vi sinh vật có khả lên men xylan phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Nông Lâm TP HCM 10 Takanori Furukawa, Dương Thị Lương Liên (2013), "Tách dòng biểu gen XynA mã hóa enzyme xylanase A từ chủng Bacillus subtilis CN2 E.coli BL21.", Tạp chí Khoa học Công nghệ, 51(1), pp 51-62 11 Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà (2013), "Tách dòng biểu gene mã hóa enzyme xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 vào E.coli BL21", Tạp chí Khoa học Công nghệ, 51(1), pp 73-79 12 Trương Thị Minh Hải, Phước Lê Thanh (2008), "Biến đổi vòng đường xylose thành chất trung gian cho trình tổng hợp thuốc ung thư, kháng vi rút HIV", Tạp chí Khoa học 9, pp 220-226 Tiếng Anh 13 Alvarez-Cervantes J., Diaz-Godinez G., et al (2016), "Phylogenetic analysis of beta-xylanase SRXL1 of Sporisorium reilianum and its relationship with families (GH10 and GH11) of Ascomycetes and Basidiomycetes", Sci Rep, 6, pp 24010 14 B Archer David (2000), "Filamentous fungi as microbial cell factories for food use", Current Opinion in Biotechnology, 11(5), pp 478-483 15 Bae Y J., Bak Y K., et al (2011), "Coconut-derived D-xylose affects postprandial glucose and insulin responses in healthy individuals", Nutr Res Pract, 5(6), pp 533-9 16 Banik M., Li C D., et al (1997), "Structure, hormonal regulation, and chromosomal location of genes encoding barley (1 >4)-beta-xylan endohydrolases", Mol Gen Genet, 253(5), pp 599-608 17 Basotra N., Joshi S., et al (2018), "Expression of catalytically efficient xylanases from thermophilic fungus Malbranchea cinnamomea for synergistically enhancing hydrolysis of lignocellulosics", Int J Biol Macromol, 108, pp 185-192 18 Beg Q., Kapoor M., et al (2001), "Microbial xylanases and their industrial applications: a review", Applied Microbiology and Biotechnology, 56(3-4), pp 326– 338 19 Bhardwaj Amit, Mahanta Pranjal, et al (2012), Emerging role of N- and C- terminal interactions in stabilizing (β/α)8 fold with special emphasis on Family 10 xylanases, pp 20 Biely P., Puchart V., et al (2014), "Trichoderma reesei XYN VI a novel appendage-dependent eukaryotic glucuronoxylan hydrolase", FEBS J, 281(17), pp 3894-903 21 Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem, 72, pp 248-54 22 Brown A (2008), Understanding Food: Principles and Preparation, Third Edition, pp 23 Camacho N A., Aguilar O G (2003), "Production, purification, and characterization of a low-molecular-mass xylanase from Aspergillus sp and its application in baking", Appl Biochem Biotechnol, 104(3), pp 159-72 24 Cleemput G., Hessing M., et al (1997), "Purification and Characterization of a [beta]-D-Xylosidase and an Endo-Xylanase from Wheat Flour", Plant Physiol, 113(2), pp 377-386 25 Collins T., Gerday C., et al (2005), "Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases", FEMS Microbiol Rev, 29(1), pp 3-23 26 Consulting Gen (2018), "Global Xylanase Market Outlook 2018-2023", Market Research Store, (MRS - 250763), pp 27 Coughlan M P., Hazlewood G P (1993), "beta-1,4-D-xylan-degrading enzyme systems: biochemistry, molecular biology and applications", Biotechnol Appl Biochem, 17(3), pp 259-89 28 Cummins P M., Rochfort K D., et al (2017), "Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application", Methods Mol Biol, 1485, pp 209-223 29 Chakdar H., Kumar M., et al (2016), "Bacterial xylanases: biology to biotechnology", Biotech, 6(2), pp 150 30 Chipeta Z A., du Preez J C., et al (2005), "Xylanase production by fungal strains on spent sulphite liquor", Appl Microbiol Biotechnol, 69(1), pp 71-8 31 Damaso M C., Almeida M S., et al (2003), "Optimized expression of a thermostable xylanase from Thermomyces lanuginosus in Pichia pastoris", Appl Environ Microbiol, 69(10), pp 6064-72 32 de Vries Ronald P., Riley Robert, et al (2017), "Comparative genomics reveals high biological diversity and specific adaptations in the industrially and medically important fungal genus Aspergillus", Genome Biology, 18(1), pp 28 33 Dhillona A , Guptab IK Jauhari MB., et al (2000), "A cellulase-poor, thermostable, alkalitolerant xylanase produced by Bacillus circulans AB 16 grown on rice straw and its application in biobleaching of eucalyptus pulp", Bioresource Technology, 73(3), pp 273-277 34 Do TT., Quyen DT., et al (2013), "Molecular characterization of a glycosyl hydrolase family 10 xylanase from Aspergillus niger", Protein Expression and Purification 92, pp 196–202 35 Do TT., Quyen DT., et al (2010), "Purification and properties of a thermoactive xylanase from Aspergillus oryzae DSM1863", Middle–East Journal of Scientific Research, 6(4), pp 392-397 36 Do TT., Quyen DT., et al (2009), "Optimiation of some culture conditions for Aspergillus niger VTCC-F-017 and Aspergillus oryzae VTCC-F-187 producing xylanase", The analytica Vietnam conference 2009, pp 294-301 37 Ducros V., Charnock S J., et al (2000), "Substrate specificity in glycoside hydrolase family 10 Structural and kinetic analysis of the Streptomyces lividans xylanase 10A", J Biol Chem, 275(30), pp 23020-6 38 Duong-Ly K C., Gabelli S B (2014), "Gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) of proteins", Methods Enzymol, 541, pp 105-14 39 Elegir G., Szakacs G., et al (1994), "Purification, Characterization, and Substrate Specificities of Multiple Xylanases from Streptomyces sp Strain B-12-2", Appl Environ Microbiol, 60(7), pp 2609-15 40 Gao S., Wang J., et al (2012), "Effect of N-terminal disulfide bridge on thermostability of family 11 xylanases", Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 28(12), pp 1441-9 41 Ghanem Nevine B., Yusef Hoda H., et al (2000), "Production of Aspergillus terreus xylanase in solid-state cultures: application of the Plackett–Burman experimental design to evaluate nutritional requirements", Bioresource Technology, 73(2), pp 113-121 42 Ghosh M., Nanda G (1994), "Purification and some properties of a xylanase from Aspergillus sydowii MG49", Appl Environ Microbiol, 60(12), pp 4620-3 43 Golubev A M., Kilimnik AYu, et al (1993), "Crystals of beta-xylanase from Aspergillus oryzae", J Mol Biol, 230(2), pp 661-3 44 He Fanglian (2011), "Laemmli-SDS-PAGE", Bio-protocol, 1(11), pp e80 45 He H., Qin Y., et al (2015), "Purification and characterization of a thermostable hypothetical xylanase from Aspergillus oryzae HML366", Appl Biochem Biotechnol, 175(6), pp 3148-61 46 Hoda S., Sherief A., et al (2012), "Production of Xylanase by Aspergillus niger and Trichoderma viride using Some Agriculture Residues", International Journal of Agricultural Research, 7(1), pp 46-57 47 Jeffries T W (1996), "Biochemistry and genetics of microbial xylanases", Curr Opin Biotechnol, 7(3), pp 337-42 48 Kimura K., Kitamoto K et al (1994), "Electrophoretic Karyotype and Gene Assignment to Chromosomes of Aspergillus oryzae ", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 58(8), pp 1467-1470 49 Kimura T., Suzuki H., et al (2000), "Molecular cloning, overexpression, and purification of a major xylanase from Aspergillus oryzae", Biosci Biotechnol Biochem, 64(12), pp 2734-8 50 Kitamoto K (2015), "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae", Biosci Biotechnol Biochem, 79(6), pp 863-9 51 Kosanovic M., Milutinovic B., et al (2017), "Ion-exchange chromatography purification of extracellular vesicles", Biotechniques, 63(2), pp 65-71 52 Krengel U., Dijkstra B W (1996), "Three-dimensional structure of Endo-1,4- beta-xylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum", J Mol Biol, 263(1), pp 70-8 53 Krisana A., Rutchadaporn S., et al (2005), "Endo-1,4-beta-xylanase B from Aspergillus cf niger BCC14405 isolated in Thailand: purification, characterization and gene isolation", J Biochem Mol Biol, 38(1), pp 17-23 54 Kulkarni N., Shendye A., et al (1999), "Molecular and biotechnological aspects of xylanases", FEMS Microbiol Rev, 23(4), pp 411-56 55 Leggio L L., Jenkins J., et al (2000), "X-ray crystallographic study of xylopentaose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A", Proteins, 41(3), pp 362-73 56 Li C., Li J., et al (2018), "Substituting Both the N-Terminal and "Cord" Regions of a Xylanase from Aspergillus oryzae to Improve Its Temperature Characteristics", Appl Biochem Biotechnol, 185(4), pp 1044-1059 57 Li X Q., Wu Q., et al (2017), "Improving the temperature characteristics and catalytic efficiency of a mesophilic xylanase from Aspergillus oryzae, AoXyn11A, by iterative mutagenesis based on in silico design", AMB Express, 7(1), pp 97 58 Lu F., Lu M., et al (2008), "Purification and characterization of xylanase from Aspergillus ficuum AF-98", Bioresour Technol, 99(13), pp 5938-41 59 Machida M., Asai K., et al (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438(7071), pp 1157-61 60 Machida M., Yamada O., et al (2008), "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future", DNA Res, 15(4), pp 173-83 61 Maheswari MU , Chandra TS., et al (2000), "Production and potential applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16(3), pp 257–263 62 Mellon J E., Cotty P J., et al (2011), "Identification of a major xylanase from Aspergillus flavus as a 14-kD protein", Mycopathologia, 172(4), pp 299-305 63 Miller G L (1959), "Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar", Analytical Chemistry, 31(3), pp 426-428 64 Nair S G., Sindhu R., et al (2008), "Purification and biochemical characterization of two xylanases from Aspergillus sydowii SBS 45", Appl Biochem Biotechnol, 149(3), pp 229-43 65 Nakamura S., Wakabayashi K., et al (1993), "Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkaliphilic Bacillus sp strain 41M-1", Appl Environ Microbiol, 59(7), pp 2311-6 66 O'Fagain C., Cummins P M., et al (2017), "Gel-Filtration Chromatography", Methods Mol Biol, 1485, pp 15-25 67 Pandey Sujeet, Jadon Rekha, et al (2015), Xylanase: Recent update on commercial production and optimization of factors affecting its yield A review), pp 68 Pariza Michael W., Johnson Eric A (2001), "Evaluating the Safety of Microbial Enzyme Preparations Used in Food Processing: Update for a New Century", Regulatory Toxicology and Pharmacology, 33(2), pp 173-186 69 Park H S., Jun S C., et al (2017), "Diversity, Application, and Synthetic Biology of Industrially Important Aspergillus Fungi", Adv Appl Microbiol, 100, pp 161-202 70 Polizeli M L., Rizzatti A C., et al (2005), "Xylanases from fungi: properties and industrial applications", Appl Microbiol Biotechnol, 67(5), pp 577-91 71 Raj K C., Chandra T S (1996), "Purification and characterization of xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fischeri Fxn1", FEMS Microbiol Lett, 145(3), pp 45761 72 Ratto M., Poutanen Kaisa, et al (1992), "Production of xylanolytic enzymes by an alkalitolernt Bacillus circulans stain", Applied Microbiology and Biotechnology, 37(4), pp 470-473 73 Reddy M B., Armah S M (2018), "Impact of Iron-Enriched Aspergillus oryzae on Iron Bioavailability, Safety, and Gut Microbiota in Rats", J Agric Food Chem, 66(24), pp 6213-6218 74 Robert Y Roger M., Saran N (1988), "Nucleotide sequence of a Bacillus circulans xylanse gene", Nucleic Acids Research, 16(14), pp 7187 75 Ruiz-Roldan M C., Di Pietro A., et al (1999), "Two xylanase genes of the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum are differentially expressed during infection of tomato plants", Mol Gen Genet, 261(3), pp 530-6 76 S Tolan Jeffrey, Popovici Corina (2002), Mill usage and mechanistic studies of xylanase to enhance bleaching, pp 30-35 77 Shareck F., Roy C., et al (1991), "Sequences of three genes specifying xylanases in Streptomyces lividans", Gene, 107(1), pp 75-82 78 Shendye Abhay, Rao Mala, et al (1999), "Molecular and biotechnological aspects of xylanases", FEMS Microbiology Reviews, 23(4), pp 411-456 79 Silva L A O., Terrasan César Rafael Fanchini, et al (2015), "Purification and characterization of xylanases from Trichoderma inhamatum", Electronic Journal of Biotechnology, 18(4), pp 307-313 80 Subramaniyan S., Prema P (2002), "Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application", Crit Rev Biotechnol, 22(1), pp 3364 81 Taylor Matthew J., Richardson Tom (1979), "Applications of Microbial Enzymes in Food Systems and in Biotechnology", Advances in Applied Microbiology, Perlman D., Academic Press, 25, pp 7-35 82 Walia A., Guleria S., et al (2017), "Microbial xylanases and their industrial application in pulp and paper biobleaching: a review", Biotech, 7(1), pp 11 83 Zafar A., Aftab M N., et al (2016), "Cloning, Expression, and Purification of Xylanase Gene from Bacillus licheniformis for Use in Saccharification of Plant Biomass", Appl Biochem Biotechnol, 178(2), pp 294-311 84 Zappe H., Jones W A., et al (1990), "Nucleotide sequence of a Clostridium acetobutylicum P262 xylanase gene (xynB)", Nucleic Acids Res, 18(8), pp 2179 85 Zhu H., Paradis F W., et al (1994), "Enzymatic specificities and modes of action of the two catalytic domains of the XynC xylanase from Fibrobacter succinogenes S85", J Bacteriol, 176(13), pp 3885-94 Website 86 "http://sites.ffclrp.usp.br/pbbg/english/research/xylanase/xylanase_structure.htm", Retrieved 15/03/2019 87."https://biocyc.org/META/NEW-IMAGE?type=EC-NUMBER&object=EC3.2.1.8", Retrieved 12/03/2019 88 "https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/D-xylose#section=Top", Retrieved 25/03/2019 89."https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/biochem/Ion_Exchang e_Chromatography_Handbook.pdf", Retrieved 15/05/2019 90."https://www.sigmaaldrich.com/technical-service-home/product-catalog.html", Retrieved 15/05/2019 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THU HUYỀN MÃ SINH VIÊN: 1401284 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA ENZYM XYLANASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... Tinh đánh giá hoạt tính lý hóa enzym xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-187 với mục tiêu là: Bước đầu tinh xylanase từ chủng A oryzae VTCC-F-187 Đánh giá hoạt tính lý hóa enzym xylanase. .. nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase 38 3.2 Bàn luận 46 3.2.1 Tinh xylanase từ chủng A .oryzae VTCC-F-187 46 3.2.2 Đánh giá tính chất lý hóa xylanase tinh từ chủng A .oryzae VTCCF-187