1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Mai thị thu thủy biểu hiện, tinh sạch và xác định cơ chất chuyển hóa của enzym cyp154c từ streptomyces cavourensis ybq59 khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

59 0 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 59
Dung lượng 1,66 MB

Nội dung

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THU THỦY BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CƠ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA ENZYM CYP154C TỪ STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THU THỦY MÃ SINH VIÊN: 1801687 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CƠ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA ENZYM CYP154C TỪ STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lý Thị Bích Thủy TS Đào Thị Mai Anh Nơi thực hiện: Viện Cơng nghệ sinh học Bộ mơn Hóa Sinh HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội Trong năm học tập rèn luyện trường, thầy cô dạy dỗ truyền đạt cho em không nguồn tri thức quý báu, mà nhân cách đạo đức người dược sỹ niềm say mê với nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn thầy cán phịng Sinh hóa Thực vật – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn hỗ trợ em trình thực tập, nghiên cứu Em xin gửi lòng biết ơn tới TS Lý Thị Bích Thủy, người ln bên cạnh em, giúp em định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn em từ thí nghiệm từ ngày đầu em đến với cô dạy kiến thức chuyên môn giúp em hồn thành tốt khóa luận Cảm ơn giúp em dần hình thành nên suy nghĩ, tác phong nhạy bén người nghiên cứu Đó điều may mắn mà em nhận chọn theo đường nghiên cứu khoa học Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đào Thị Mai Anh Cảm ơn chọn đặt niềm tin vào em, niềm tin động lực, khích lệ để em cố gắng hoàn thiện thân kiên định với đường chọn Cách nhìn nhận giải vấn đề nghiên cứu sống cô “tài liệu tham khảo” quý giá mà em có năm rèn luyện trường đại học Dược Hà Nội Dưới bảo tận tình cơ, em dần nhận khả vượt qua tường giới hạn mà em tự vẽ Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Vũ Mạnh Cường, chị Trần Thị Thanh Diệp, bạn Khổng Văn Mạnh, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Kim Anh giúp đỡ em nhiều trình em thực tập nghiên cứu lab Cảm ơn bạn Hoàng Hà Phương, Lê Thị Hà, Bùi Thị Nhung, Nguyễn Thị Hương bên cạnh, động viên chỗ dựa tinh thần tớ suốt thời gian qua Cảm ơn bạn Trần Thị Thu Thảo, Mai Thị Bích Phượng, Nguyễn Thị Lý, Trịnh Thu Nga, Phạm Quỳnh Mai, Nguyễn Thị Thu Ngân bạn tổ 10 lớp N1K73 khiến năm tháng học tập, rèn luyện HUP tớ trở nên ý nghĩa đáng nhớ Cuối xin cảm ơn bà, bác Thoa, bố mẹ, gia đình Bắp, em Tồn ln bên cạnh con, u thương vơ điều kiện Gia đình ln điểm tựa vững nhất, động lực để cố gắng phấn đấu đường học tập nghiên cứu phía trước Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Mai Thị Thu Thủy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cytochrom P450 (EC 1.14.-.-.) 1.1.1 Định nghĩa danh pháp 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc .5 1.1.4 Chu trình xúc tác hệ thống P450 1.2 Sàng lọc chất enzym P450 1.2.1 Vai trò việc tìm chất đặc hiệu P450 1.2.2 Các phương pháp sàng lọc chất tiềm P450 .9 1.3 CYP154C 11 1.3.1 Nguồn gốc 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu CYP154C giới 11 1.3.3 Tình hình nghiên cứu CYP154C Việt Nam 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Biểu CYP154C tái tổ hợp tế bào E coli 18 2.3.2 Tinh enzym CYP154C tái tổ hợp 20 2.3.3 Sàng lọc chất tiềm CYP154C .21 2.3.4 Đánh giá khả chuyển hóa chất tiềm in vitro CYP154C 23 2.3.5 Điện di protein 25 2.3.6 Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết .27 3.1.1 Kết biểu CYP154C-sca8 tái tổ hợp E coli .27 3.1.2 Kết tinh CYP154C-sca8 tái tổ hợp .27 3.1.3 Kết sàng lọc chất tiềm CYP154C-sca8 30 3.1.4 Kết đánh giá khả chuyển hóa chất tiềm in vitro CYP154C-sca8 .33 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Về kết biểu CYP154C-sca8 tái tổ hợp E coli 36 3.2.2 Về kết tinh enzym CYP154C-sca8 tái tổ hợp 38 3.2.3 Về kết xác định chất đặc hiệu enzym CYP154C-sca8 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN .42 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tiếng Anh chữ viết tắt Tiếng Việt APS Ammonium persulfate Amoni persulfat AQ Amodiaquine Amodiaquin bp Base pair Cặp base BLAST The Basic Local Alignment Search Tool CPR Cytochrome P450 reductase Cytochrom P450 reductase DHEA Dehydroepiandrosterone Dehydroepiandrosteron DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPT 5,6-diphenyl-3-(2-pyridyl)-1,2,4triazine 5,6-diphenyl-3-(2-pyridyl)1,2,4-triazin FAD Flavin adenine dinucleotide Flavin adenin dinucleotid FMN Flavin mononucleotide Flavin mononucleotid GDH Glucose dehydrogenase HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HS High spin Spin cao IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside Isopropyl β-D-1thiogalactopyranosid Kd Dissociation constant Hằng số phân ly chất enzym KPP Kali phosphate Kali phosphat LB Lysogeny broth LS Low spin NA Nutrient agar NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat phosphate Spin thấp NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công Information nghệ sinh học Quốc gia NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ OD Optical density Mật độ quang PDB Protein data bank Ngân hàng liệu protein P450 Cytochrome P450 Cytochrom P450 RIT Ritonavir Ritonavir Rt Retention time Thời gian lưu SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Điện di gel polyacrylamid polyacrylamide gel electrophoresis TB Terrific broth TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamin TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TTN Total turnover number UV-VIS Ultraviolet-visible Quang phổ tử ngoại khả kiến δ-ALA δ-Aminolevulinic acid Acid δ-Aminolevulinic DANH MỤC CÁC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân loại P450 nhóm phụ dựa chuỗi truyền điện tử Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Công thức pha dung dịch 15 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy E coli 16 Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng 16 Bảng 2.5 Thành phần gel cô gel tách 25 Bảng 3.1 Phổ hấp thụ CYP154C-sca8 có mặt Nooakaton Testosteron 31 Bảng 3.2 Giá trị chênh lệch độ hấp thụ cực đại cực tiểu CYP154C-sca8 phụ thuộc vào nồng độ chất 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Thứ tự Tên hình Trang Hình 1.1 P450 nhóm I II Hình 1.2 Cấu trúc P450 Hình 1.3 Vùng chứa phối tử Cys/ P450cam Hình 1.4 Nhóm ngoại Hem (Fe3+- protoporphyrin IX) Hình 1.5 Cơ chế xúc tác P450 Hình 1.6 Phổ hấp thụ P450 trạng thái không gắn chất trạng thái gắn chất 10 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 17 Hình 3.1 Điện di đồ SDS – PAGE tế bào E coli 27 Hình 3.2 Qui trình tách chiết, tinh CYP154C-sca8 tái tổ hợp từ E coli 28 Hình 3.3 Điện di đồ SDS – PAGE CYP154C-sca8 sau tinh 29 Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV-VIS CYP154C-sca8 tinh trạng thái khử gắn CO 29 Hình 3.5 Phổ UV-VIS CYP154C-sca8 có mặt hợp chất khảo sát 30 Hình 3.6 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại cực tiểu CYP154C-sca8 với nồng độ chất 32 Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC phân tích kết chuyển hóa Nootkaton Testosteron 34 Hình 3.8a Sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa Nootkaton 35 Hình 3.8b Sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa Testosteron 35 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự CYP154C-sca8 với protein có độ tương đồng cao ngân hàng NCBI 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ tử vong bệnh lý tim mạch, ung thư nhiễm khuẩn kháng kháng sinh ngày gia tăng, trở thành gánh nặng y tế toàn cầu động lực thúc đẩy nhà khoa học không ngừng tìm kiếm loại thuốc [43] Trong cơng nghiệp hóa dược truyền thống, phản ứng oxy hóa, đặc biệt oxy hóa liên kết C-H khơng hoạt hóa địi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, dẫn đến chi phí cao có tác động xấu đến mơi trường Chính năm gần đây, xuất xu hướng sử dụng chất xúc tác sinh học enzym để giúp phản ứng diễn điều kiện bình thường, từ tiết kiệm chi phí sản xuất giảm thiểu tác động đến môi trường Một enzym nghiên cứu sâu có ứng dụng ngành công nghiệp Dược phẩm enzym P450 Đây họ enzym đa chức với khả xúc tác 20 phản ứng oxy hóa hợp chất có cấu trúc đa dạng, với đặc tính xúc tác chọn lọc vùng (regioselective), chọn lọc lập thể (stereoselective) cao [7] Vì vậy, P450 coi chất xúc tác sinh học có tiềm ứng dụng lớn lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc Trong số nhà máy tự nhiên sản xuất P450, chi Streptomyces ứng cử viên sáng giá Kết giải trình tự gen tiết lộ Streptomyces chứa lượng gen mã hóa P450 lớn so với vi sinh vật khác, chẳng hạn S coelicolor A3(2) mang 18 gen; S avermitilis mang 33 gen S scabies mang 25 gen [52] Bên cạnh đó, nghiên cứu P450 Streptomyces thường tham gia vào giai đoạn cuối đường sinh tổng hợp, từ làm tăng hoạt tính sinh học sản phẩm chuyển hóa thứ cấp [44], [48], [61] Tuy nhiên, tổng số 7.500 P450 Streptomyces, có khoảng 2,4% P450 xác định chức 0,4% P450 xác định cấu trúc [30] Vì vậy, nghiên cứu P450 Streptomyces hướng đầy tiềm ngành ứng dụng cơng nghệ enzym nói chung cơng nghiệp dược phẩm nói riêng S cavourensis YBQ59 chủng xạ khuẩn phân lập từ Quế (Cinnamomum cassia) Yên Bái - Việt Nam Kết đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất chuyển hóa thứ cấp phân lập từ môi trường nuôi cấy S cavourensis YBQ59 thể hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống nấm, tiêu diệt tế bào ung thư [50] Ở nghiên cứu “Biểu hiện, tinh xác định tính chất enzym P450 từ vi khuẩn Streptomyces YBQ59 tái tổ hợp E coli” trước đó, chúng tơi tiến hành biểu tinh CYP154C từ Streptomyces cavourensis YBQ59 [5] Tuy nhiên mức độ biểu enzym thấp dẫn tới thực nghiên cứu sinh hóa sâu CYP154C nhằm tiến tới xác định chức enzym Vì với mong muốn nghiên cứu sâu cơng cụ xanh tiềm CYP154C từ S bệnh lý ung thư [19], CYP171A1 (AveE) từ S avermitilis tham gia vào đường sinh tổng hợp Avermectin – hoạt chất kháng ký sinh trùng thông qua phản ứng xúc tác hydroxyl hóa để tạo vịng tetrahydrofuran vị trí C-6 C-8a [29] Thứ hai, P450 Streptomyces ứng dụng phân tích dược lý độc tính thuốc tiềm chuyển hóa qua P450 người, vai trò thu hút nhiều ý P450 ngành công nghiệp Dược phẩm [61] Streptomyces cavourensis YBQ59 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ rễ Quế Dịch chiết từ môi trường nuôi cấy S cavourensis YBQ59 phân lập chất chuyển hóa thứ cấp tinh khiết, có hợp chất thể hoạt tính mạnh tụ cầu S aureus kháng Methicillin (MRSA), S cholermidis kháng Methicillin (MRSE) tế bào A549 kháng EGFR-TKI ung thư biểu mô tuyến phổi người [50] Kết giải trình tự gen cho thấy S cavourensis YBQ59 có 20 gen mã hóa P450 Vai trị P450 Streptomyces gợi ý P450 từ S cavourensis YBQ59 có khả tham gia vào đường sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp CYP154C-sca8 20 enzym P450 từ S cavourensis YBQ59 tách dòng thành công Đề tài hướng tới biểu hiện, tinh bước đầu xác định chất đặc hiệu CYP154C-sca8, từ góp phần làm rõ chức enzym Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi thu số kết đáng lưu ý có số vấn đề cần bàn luận 3.2.1 Về kết biểu CYP154C-sca8 tái tổ hợp E coli Ở nghiên cứu trước đó, gen mã hóa CYP154C-sca8 đưa vào tế vào E coli C43(DE3) thông qua vector pET17b, nuôi cấy biểu gen nhiệt độ 30℃, tốc độ lắc 200 vòng/phút, nhiên mức độ biểu CYP154C-sca8 thấp (lượng enzym thu sau tinh khoảng 300 nmol/L môi trường nuôi cấy), enzym nhanh hoạt tính gây khó khăn cho q trình sàng lọc chất nghiên cứu sinh hóa sâu [5].Vì vậy, chúng tơi đặt câu hỏi làm để cải thiện mức độ biểu CYP154C-sca Theo Francis Page, khả biểu protein hệ biểu phụ thuộc chủ yếu vào yếu tố: (1) protein cần biểu hiện, (2) vector biểu hiện, (3) dòng tế bào biểu (4) điều kiện ni cấy, biểu enzym Vì vậy, yếu tố cần tối ưu hóa để tăng mức độ biểu enzym [23] Trong nghiên cứu lần này, thay đổi vector biểu hiện, chuyển từ pET17b sang pET32b chứa gen mã hóa protein Thioredoxin Khi đưa gen mã hóa CYP154C-sca8 vào vector, gen phiên mã, dịch mã đồng thời biểu thành protein dung hợp (fusion protein) tế bào E coli C43(DE3) Mặc dù biểu protein từ sinh vật nhân sơ tái tổ hợp E coli có ưu điểm đơn giản nuôi cấy dễ thao tác, điều khiển trình biểu gen, chi phí thấp suất biểu protein cao (sau 24 ni cấy thu 36 lượng protein lên tới 50% tổng protein tế bào), hệ biểu có bất lợi định, đặc biệt vấn đề liên quan đến biểu enzym dạng hoạt tính, khơng hịa tan [23] Ngun nhân dẫn đến tượng biểu protein tái tổ hợp nhanh, protein kết tập kết tủa dạng chưa gấp cuộn hoàn chỉnh gọi “thể vùi” khơng hịa tan Xu hướng hình thành thể vùi thường xảy protein tái tổ hợp đa miền, protein chứa nhóm ngoại protein cần biến đổi đặc biệt sau dịch mã [62] Người ta chứng minh rằng, Thioredoxin gắn protein tái tổ hợp làm tăng đáng kể mức độ hòa tan protein tế bào chất E coli Thioredoxin protein nhỏ gọn (11,67 kDa) có khả hịa tan cao, biểu protein lên tới 40% tổng protein tế bào chủ có đặc tính cuộn gấp mạnh mẽ [31], [62] Vì vậy, Thioredoxin hỗ trợ protein tái tổ hợp gấp cuộn tương tự chaperon, đồng thời ngăn cản protein hình thành kết tập, qua tạo điều kiện cho protein có thời gian gấp cuộn xác dạng hịa tan làm tăng mức độ biểu enzym[23] Theo tính tốn khối lượng phân tử CYP154C-sca8 dựa trình tự protein suy diễn, enzym có kích thước khoảng 45 kDa Tuy nhiên kết điện di cho thấy khối lượng phân tử CYP154C-sca8 đưa vào pET32 có kích thước khoảng 63 kDa (mục 3.1.1) Kết tương tự với nghiên cứu biểu CYP154C2, CYP154C3 CYP154C8 sử dụng vector pET32 Kích thước phân tử tính tốn dựa trình tự acid amin suy diễn enzym khoảng 45 kDa, nhiên kích thước phân tử sau biểu 65 kDa, 65 kDa 70 kDa Điều giải thích trình tự gen Trx-His-S gắn CYP154C-sca8 đưa vào vector pET32, từ đồng phiên mã dịch mã tạo Thioredoxin (11,8 kDa), His (840,9 Da), S tag (1,7 kDa) gắn đoạn trình tự acid amin nhận biết enterokinase (606,5 Da) CYP154C-sca8 dẫn đến tăng kích thước enzym [16], [17], [68] Ở nghiên cứu trước đó, kích thước protein CYP154Csca8 biểu sử dụng vector pET17b kích thước mà chúng tơi tính tốn theo lý thuyết Kích thước tăng thêm CYP154C-sca8 nghiên cứu vào khoảng 15-18 kDa kích thước protein Thioredoxin - 6His - S tag - trình tự nhận biết enterokinase Kết cho thấy, nuôi cấy biểu CYP154C-sca8 điều kiện, E coli tái tổ hợp plasmid pET32b mang gen mã hóa Thioredoxin cho mức độ biểu enzym cao hàng chục lần, lượng enzym thu sau tinh đạt tới 3000 nM/L mơi trường ni cấy Kết xác định đặc tính phổ UV dạng khử gắn CO CYP154C-sca8 cho cực đại hấp thụ bước sóng khoảng 450 nm, chứng tỏ CYP154Csca8 biểu dạng cịn hoạt tính bền trình chiết tách, tinh enzym 37 3.2.2 Về kết tinh enzym CYP154C-sca8 tái tổ hợp Mục tiêu đề tài hướng tới xác định chất chuyển hóa enzym CYP154C-sca8, mong muốn thu lượng enzym tối đa sau tinh với độ tinh phù hợp Quá trình tinh CYP154C-sca8 cột His-Pur Ni-NTA cho kết độ tinh cao (>90%), lượng enzym sau tinh đủ dùng cho nghiên cứu xác định chất đặc hiệu enzym Vì thí nghiệm tinh enzym dừng lại bước tinh sắc ký cột lực ion kim loại Kết điện di SDS-PAGE mẫu enzym sau tinh cho thấy, bên cạnh băng protein đậm, rõ nét CYP154C-sca8, xuất băng protein nhỏ, mờ tương ứng với vạch protein mẫu tế bào biểu CYP154C-sca8 (hình 3.3) Điều chứng tỏ lượng nhỏ protein tạp liên kết với cột rửa giải CYP154C-sca8 Protein biểu E coli đồng rửa giải với P450 quan tâm chia thành nhóm: (1) protein chứa mơ típ (motif) bề mặt có khả tương tác kim loại, lực với cột yếu nhiều so với protein His-tag; (2) protein chứa cụm Histidin trình tự acid amin liên tiếp có khả tạo liên kết chelat với Ni2+ bề mặt Glycin, Cystein, Glutamat, Aspartat ; (3) protein dung hợp với protein His-tag, ví dụ chaperon; (4) protein có tương tác với hạt agarose – cấu trúc giá đỡ Ni2+-NTA [10] Tuy nhiên khơng dễ để dự đốn loại protein tương tác với cột đồng rửa giải protein His-tag Để đạt độ tinh enzym cao hơn, cần thiết phải áp dụng phương pháp tinh phù hợp khác 3.2.3 Về kết xác định chất đặc hiệu enzym CYP154C-sca8 Sử dụng công cụ BLAST liệu protein ngân hàng (Protein Data Bank) cho thấy CYP154C-sca8 có trình tự tương đồng cao (92,86%) với enzym CYP154C4 từ Streptomyces sp W2061, tiếp đến CYP154C2 từ Streptomyces avermitilis (74,38%), CYP154C1 từ Streptomyces coelicolor (73,7%) CYP154C5 từ Nocardia farcinica (52,62%) (Hình 3.9) CYP154C4 xác định enzym steroid hydroxylase, chuyển hóa Testosteron thành 2′-Hydroxytestosteron [17] Từ đó, chúng tơi dự đốn CYP154Csca8 có khả chuyển hóa Testosteron Vì vậy, Testosteron đưa vào danh sách sàng lọc chất tiềm cho enzym Do khơng có thư viện hợp chất tự nhiên để sàng lọc, thu thập số hợp chất từ nhóm nghiên cứu khác Các chất thu thập gồm 10 hợp chất thuộc nhóm chất khác bao gồm: Nootkaton, Humulen, Longipinen, Huperzin A (nhóm sesquiterpen); Astilbin, Naringenin (nhóm flavanon); Testosteron (nhóm steroid); Honokiol (nhóm lignan); αMangnostin (nhóm xanthon) DPPT (hợp chất đa dị vịng thơm) 38 Hình 3.9: Kết so sánh trình tự CYP154C-sca8 với protein có độ tương đồng cao ngân hàng NCBI Thông thường hợp chất có chung nhóm cấu trúc có kiểu tương tác với trung tâm hoạt động enzym [70] Vì với nhóm hợp chất, chọn vài đại diện để khảo sát nhóm hợp chất có khả trở thành chất tiềm P450, thông qua phương pháp sàng lọc chất dựa thay đổi phổ typ I Sau đó, có kết hợp chất gây thay đổi phổ typ I, tiến hành xác định Kd Nootkaton với CYP154C-sca8 hợp chất gây thay đổi quang phổ UV typ I rõ rệt Kết cho thấy Nootkaton gắn CYP154C-sca8 mức chấp nhận (Kd = 19,39 ± 3,37 (μM)) Để chuyển hóa, hợp chất phải có khả gắn vào trung tâm hoạt động enzym, nhiên khơng phải yếu tố định hợp chất chất enzym hay không Hằng số phân ly Kd Cortison với CYP154C3-1 từ Streptomyces sp W2061 50,730 ± 6,140 (μM), nhiên kết chuyển hóa Cortison CYP154C3-1 cho tỷ lệ chuyển hóa cao (74,53%) [64] Kết thực nghiệm chuyển hóa Nootkaton CYP154C-sca8 chứng minh điều đó: Nootkaton chuyển hóa 100% sau phản ứng, tạo thành sản phẩm (Hình 3.8a) Nootkaton sesquiterpen có hương thơm đặc trưng, sử dụng ngành công nghiệp nước hoa hương liệu, có khả diệt trùng, mang nhiều hoạt tính dược lý quan trọng chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ tế bào thần kinh, kháng khuẩn kháng ung thư [15], [21], [22], [28], [38] Oxy hóa Nootkaton hệ xúc tác vi sinh P450 khảo sát Theo đó, số dẫn xuất Nootkaton tìm thấy bao gồm: 7α-hydroxynootkaton; (∝, β) - hydroxynootkaton; 13 hydroxynootkaton; 11,12-dihydroxynootkaton; 7,11,12-trihydroxynootkaton; 11,1239 epoxynootkaton; 11,12-epoxy-9α-hydroxynootkaton [25], [54], [55], [60] Trong số hợp chất trên, 13-hydroxynootkaton cho thấy có hoạt tính chống tăng sinh dịng tế bào A549 (ung thư phổi), 9∝-hydroxynootkaton; 13-hydroxynootkaton; 11,12epoxynootkaton; 7,11,12-trihydroxynootkaton cho thấy hoạt tính ức chế mạnh tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu tiền tủy bào) [55] CYP154C-sca8 chuyển hóa Nootkaton với tỷ lệ xúc tác cao (chuyển hóa 100% sau h phản ứng) mức độ xúc tác chọn lọc 100% thành sản phẩm Kết gợi ý cho nghiên cứu enzym CYP154C-sca8 việc chuyển hóa Nootkaton để xác định cấu trúc sản phẩm, hứa hẹn có kết thú vị Testosteron hormon sinh dục nam, thuốc thuộc nhóm steroid định liệu pháp thay Testosteron nam giới thiểu tuyến sinh dục nguyên phát hay thứ phát, bẩm sinh hay mắc phải [3] Chuyển đổi cấu trúc cách hydroxyl hóa ảnh hướng mạnh mẽ tới hoạt tính sinh học, độ phân cực độc tính steroid, đặc biệt có mặt nhóm hydroxyl keton C-3,11,17,21 ảnh hưởng lớn tới hoạt tính steroid [17] Hiện tại, có số phân họ P450 vi khuẩn hydroxyl hóa steroid báo cáo, bao gồm: CYP106 (A1, A2, A6); CYP154C (C2;C3;C4;C5;C8); CYP260 (A1; B1); CYP109 (B1;E1) [46], [59] Trong phân họ CYP154C, CYP154C5 CYP154C3 chuyển hóa Testosteron với độ chọn lọc cao, tạo sản phẩm hydroxyl hóa vị trí C-16α [26]; CYP154C8 hydroxyl hóa Testosteron vị trí 16∝ 6β [16]; CYP154C4 có độ tương đồng 92% với CYP154C-sca8 nghiên cứu, chuyển hóa Testosteron tạo sản phẩm 2α- 2β - hydroxyl [17]; CYP154C2 hydroxyl hóa Testosteron vị trí 2α với độ chọn lọc vùng lập thể cao [46] Như vậy, CYP154C-sca8 từ Streptomyces cavourensis YBQ59 enzym có khả chuyển hóa steroid phân họ CYP154C Các nghiên cứu chuyển hóa steroid hệ xúc tác vi sinh vật hướng tới tìm kiếm chất xúc tác có khả oxy hóa vị trí 7α, 9α, 11α, 11β, 16α 17α [49] Trong số vị trí hydroxyl hóa mà P450 vi khuẩn xúc tác, vị trí 16α thu hút ý dẫn xuất trung gian quan trọng trình tổng hợp nên Glucocorticoid hoạt tính dược lý mạnh Vì vậy, việc tìm kiếm hệ xúc tác sinh học hydroxyl hóa steroid vị trí 16α có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp dược phẩm [6] Mặc dù CYP154C-sca8 có khả chuyển hóa Testosteron, hiệu suất chuyển hóa thấp (7% sau 3h phản ứng) (hình 3.8b) nên việc sử dụng enzym để chuyển hóa Testosteron chưa khả thi Để hợp chất trở thành chất chất enzym, chất phải có khả tiếp cận hình thành liên kết (ví dụ: liên kết hydro, tĩnh điện, sơ nước Van der Waals) với acid amin vùng trung tâm enzym [8] Khi quan sát cấu trúc phân tử Nootkaton Testosteron, nhận thấy hợp chất có vịng steran 40 chứa cấu trúc 3-oxo-4-en, Nootkaton có kích thước phân tử cấu trúc nhỏ gọn Kết phân tích cho thấy tỷ lệ chuyển hóa Nootkaton cao gấp khoảng 14 lần Testosteron, điều vùng khơng gian gắn chất CYP154C-sca8 khơng đủ lớn để chứa tồn phân tử Testosteron, dẫn tới Testosteron chuyển hóa phần 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Sau tiến hành biểu hiện, tinh xác định chất chuyển hóa CYP154C-sca8 từ Streptomyces cavourensis YBQ59 tái tổ hợp E coli, rút số kết luận sau: Đã biểu gen vị trí Orf_5310 mã hóa cho CYP154C-sca8 từ vi khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 E coli với mức biểu 3000 nM/L môi trường nuôi cấy Đã tinh CYP154C-sca8 tái tổ hợp cột His-Pur Ni-NTA, enzym tái tổ hợp thu có kích thước khoảng 63kDa điện di đồ SDS-PAGE Đã xác định chất CYP154C-sca8 Testosteron Nootkaton Tỉ lệ chuyển hóa chất CYP154C-sca8 Nootkaton 100% sau chuyển hóa và tạo sản phẩm nhất, với Testosteron 7% sau chuyển hóa tạo sản phẩm CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ Mở rộng thư viện hợp chất để sàng lọc hoạt tính cho CYP154C-sca8, đặc biệt ý tới chất tách chiết từ môi trường nuôi cấy Streptomyces cavourensis YBQ59 nhằm xác định rõ chức nội sinh CYP154C-sca8 Tinh xác định cấu trúc sản phẩm chuyển hóa Nootkaton Xác định số hoạt tính chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào số dịng tế bào ung thư, hoạt tính diệt trùng… sản phẩm chuyển hóa Nootkaton 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Ngọc Dao (2011), Cytochrome-P450, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội pp 13-41 Đái Duy Ban, Nguyễn Thị Ngọc Dao (1985), Tách chiết làm phần cytochrome P450, Trung tâm Sinh lý Hóa sinh Người Động vật - Viện Khoa học Việt Nam 1975 - 1985, Hà Nội pp 370 - 374 Bộ Y tế (2022), Dược thư Quốc gia Việt Nam tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội pp 1548 Nguyễn Thị Ngọc Dao, Hồng Cơng Minh, Đỗ Thị Tuyên (2003), "Nghiên cứu biến đổi hệ thống cytochrome gan chuột nhiễm độc yperit, nhiên liệu lỏng tên lửa, carbon tetrachloride tác dụng bảo vệ thuốc phịng", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, pp.169-175 Đinh Thùy Dương (2022), Biểu hiện, tinh xác định tính chất enzyme P450 từ vi khuẩn Streptomyces YBQ59 tái tổ hợp E coli, Luận văn tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Agematu Hitosi, Matsumoto Naoki, et al (2006), "Hydroxylation of Testosterone by Bacterial Cytochromes P450 Using the Escherichia coli Expression System", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 70(1), pp 307-311 Bernhardt R (2006), "Cytochromes P450 as versatile biocatalysts", J Biotechnol, 124(1), pp 128-45 Blanco Antonio, Blanco Gustavo (2017), "Chapter - enzymes", Medical Biochemistry, pp 153-175 Bleif Sabrina, Hannemann Frank, et al (2011), "Identification of CYP106A2 as a Regioselective Allylic Bacterial Diterpene Hydroxylase", ChemBioChem, 12(4), pp 576-582 10 Block, Helena (2009), "Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review", Methods in enzymology, 463, pp 439-473 11 Bracco P., & Schallmey, A (2014), "Exploring CYP154C5’s specificity by substrate and protein engineering", Selective steroid hydroxylation by bacterial cytochrome P450 monooxygenases, pp 95-132 12 Bracco P., Janssen D B., et al (2013), "Selective steroid oxyfunctionalisation by CYP154C5, a bacterial cytochrome P450", Microbial cell factories, 12, pp 1-11 13 Chang Angela Y "Preparation of calcium competent Escherichia coli and heatshock transformation”, JEMI methods, 1, pp 22-5 14 Cheng Qian, Lamb David C., et al (2010), "Cyclization of a Cellular Dipentaenone by Streptomyces coelicolor Cytochrome P450 154A1 without Oxidation/Reduction", Journal of the American Chemical Society, 132(43), pp 15173-5 15 Choi Hyeon-Jae, Lee Jin-Hwee, et al (2014), "(+)-Nootkatone inhibits tumor necrosis factor α/interferon γ-induced production of chemokines in HaCaT cells", Biochemical and Biophysical Research Communications, 447(2), pp 278-284 16 Dangi Bikash Kim Ki-Hwa (2018), "Tracking Down a New Steroid‐ Hydroxylating Promiscuous Cytochrome P450: CYP154C8 from Streptomyces sp W2233‐SM", ChemBioChem, 19, pp 1066-1077 17 Dangi Bikash, Lee Chang Woo, et al (2019), "Characterization of two steroid hydroxylases from different Streptomyces spp and their ligand-bound and unbound crystal structures", The FEBS Journal, 286(9), pp 1683-1699 18 Di Nardo Giovanna, Gilardi Gianfranco (2020), "Natural Compounds as Pharmaceuticals: The Key Role of Cytochromes P450 Reactivity", Trends in Biochemical Sciences, 45(6), pp 511-525 19 Dickens M L, Priestley N D, et al (1997), "In vivo and in vitro bioconversion of epsilon-rhodomycinone glycoside to doxorubicin: functions of DauP, DauK, and DoxA", Journal of Bacteriology, 179(8), pp 2641-50 20 Falke J J., Corbin J A (2013), "Methods | Affinity Tags for Protein Purification", Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition), pp 701-5 21 Fan Jiangping, Liu Zhiyan, et al (2022), "Non-food bioactive product (+)nootkatone: Chemistry and biological activities", Industrial Crops and Products, 177, pp 114490 22 Farha Arakkaveettil Kabeer, Yang Qiong-Qiong, et al (2020), "Inhibition of multidrug-resistant foodborne Staphylococcus aureus biofilms by a natural terpenoid (+)-nootkatone and related molecular mechanism", Food Control, 112, pp 107154 23 Francis Dana M., Page Rebecca (2010), "Strategies to Optimize Protein Expression in E coli", Current Protocols in Protein Science, 61(1), pp 5.24.15.24.29 24 Girhard Marco, Klaus Tobias, et al (2010), "Characterization of the versatile monooxygenase CYP109B1 from Bacillus subtilis", Applied Microbiology and Biotechnology, 87(2), pp 595-607 25 Hegazy Mohamed-Elamir F., Kuwata Chika, et al (2006), "Biotransformation of sesquiterpenoids having α,β-unsaturated carbonyl groups with cultured plant cells of Marchantia polymorpha", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 39(1), pp 13-17 26 Herzog K., Bracco P (2014), "Enzyme-substrate complex structures of CYP154C5 shed light on its mode of highly selective steroid hydroxylation", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 70(Pt 11), pp 2875-89 27 Hilberath Thomas (2019), "Two-step Screening for Identification of Drugmetabolizing Bacterial Cytochromes P450 with Diversified Selectivity", ChemCatChem, 2020, 12.6: 1710-9 28 Hung Le Van Manh, Moon Jeong Yong, et al (2019), "Nootkatone, an AMPK activator derived from grapefruit, inhibits KRAS downstream pathway and sensitizes non-small-cell lung cancer A549 cells to adriamycin", Phytomedicine, 63, pp 153000 29 Ikeda Haruo, Nonomiya Tomoko, et al (1999), "Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomyces avermitilis", Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(17), pp 9509-14 30 Kanoh Naoki, Kawamata-Asano Ayano, et al (2019), "An integrated screening system for the selection of exemplary substrates for natural and engineered cytochrome P450s", Scientific Reports, 9(1), pp 18023 31 Lavallie Edward, DiBlasio Elizabeth, et al (1993), "A Thioredoxin Gene Fusion Expression System That Circumvents Inclusion Body Formation in the E coli Cytoplasm", Biotechnology (Nature Publishing Company), 11, pp 187-93 32 Liu Ying, Liu Xin, et al (2022), "Ultrasound for microalgal cell disruption and product extraction: A review", Ultrasonics Sonochemistry, 87, pp 106054 33 Ly Thuy T B., Khatri Yogan, et al (2012), "CYP264B1 from Sorangium cellulosum So ce56: a fascinating norisoprenoid and sesquiterpene hydroxylase", Applied Microbiology and Biotechnology, 95(1), pp 123-133 34 Ly Thuy T B., Schifrin Alexander, et al (2017), "Improvement of a P450Based Recombinant Escherichia coli Whole-Cell System for the Production of Oxygenated Sesquiterpene Derivatives", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(19), pp 3891-3899 35 Nair Pramod, McKinnon Ross, et al (2016), "Cytochrome P450 structure– function: insights from molecular dynamics simulations", Drug Metabolism Reviews, 48, pp 1-19 36 Nguyen Kim-Thoa, Nguyen Ngoc-Lan, et al (2021), "Characterization of a thermophilic cytochrome P450 of the CYP203A subfamily from Binh Chau hot spring in Vietnam", FEBS Open Bio, 11(1), pp 124-132 37 Omura T Sato R (1964), "The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes I Evidence for its hemoprotein nature", J Biol Chem, 239, pp 2370-8 38 Park Jung-Eun, Park Jin-Sun, et al (2021), "NQO1 mediates the antiinflammatory effects of nootkatone in lipopolysaccharide-induced neuroinflammation by modulating the AMPK signaling pathway", Free Radical Biology and Medicine, 164, pp 354-368 39 Pearson William R (2013), "An Introduction to Sequence Similarity (“Homology”) Searching", Current Protocols in Bioinformatics, 42(1), pp 3.1.1-3.1.8 40 Podust Larissa M., Kim Youngchang, et al (2003), " The 1.92-Å Structure of Streptomyces coelicolor A3(2) CYP154C1: A new monooxygenase that functionalizes macrolide ring systems", Journal of Biological Chemistry, 278(14), pp 12214-12221 41 Poulos Thomas L., Johnson Eric F (2015), "Structures of Cytochrome P450 Enzymes", Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry, pp 332 42 Rajput Y S., Rajan Sharma (2011), "SDS-PAGE–Principle and Applications", Chemical Analysis of Value Added Dairy Products and Their Quality Assurance, pp 81-4 43 Roser M., Ritchie, H., & Spooner, F (2021), "Burden of disease", Our world in data, pp 44 Rudolf Jeffrey D., Chang Chin-Yuan, et al (2017), "Cytochromes P450 for natural product biosynthesis in Streptomyces: sequence, structure, and function", Natural Product Reports, 34(9), pp 1141-1172 45 Syed Mahin Basha (2018), "Bioconversion of mevastatin to pravastatin by various microorganisms and its applications – A review", Biocatalysis and agricultural biotechnology, 13, pp 62-74 46 Wang Qianwen, Ma Bingbing, et al (2020), "Regio- and stereoselective hydroxylation of testosterone by a novel cytochrome P450 154C2 from Streptomyces avermitilis", Biochemical and Biophysical Research Communications, 522(2), pp 355-361 47 Wisecaver Jennifer H (2017), "A Global Coexpression Network Approach for Connecting Genes to Specialized Metabolic Pathways in Plants", The Plant Cell, 29(5), pp 944-959 48 Worsch Anne, Eggimann Fabian Kurt, et al (2018), "A novel cytochrome P450 mono-oxygenase from Streptomyces platensis resembles activities of human drug metabolizing P450s", Biotechnology and Bioengineering, 115(9), pp 2156-2166 49 Zhu Jinqian, Shen Chen, et al (2021), "Regio- and stereoselective hydroxylation of testosterone by cytochrome P450 from Streptomyces griseus ATCC 13273", Biocatalysis and Biotransformation, 39(2), pp 130-137 50 Vu Hanh-Nguyen Thi, Nguyen Dat Tien, et al (2018), "Antimicrobial and Cytotoxic Properties of Bioactive Metabolites Produced by Streptomyces cavourensis YBQ59 Isolated from Cinnamomum cassia Prels in Yen Bai Province of Vietnam", Current Microbiology, 75(10), pp 1247-1255 51 Bui V N., Nguyen T T., et al (2016), "Procarcinogens - Determination and Evaluation by Yeast-Based Biosensor Transformed with Plasmids Incorporating RAD54 Reporter Construct and Cytochrome P450 Genes", PLoS One, 11(12), pp e0168721 52 Cho M A., Han S., et al (2019), "Streptomyces Cytochrome P450 Enzymes and Their Roles in the Biosynthesis of Macrolide Therapeutic Agents", Biomol Ther (Seoul), 27(2), pp 127-133 53 TT Dao TMA, Nguyen TND (2004), "Effect of silymarin on the activity of rabbit liver microsomal cytochrome P450", Vietn J Biotechnol, pp.57-64 54 Furusawa M., Hashimoto T., et al (2005), "Biotransformation of citrus aromatics nootkatone and valencene by microorganisms", Chem Pharm Bull (Tokyo), 53(11), pp 1423-9 55 Gliszczyńska A., Łysek A., et al (2011), "Microbial transformation of (+)nootkatone and the antiproliferative activity of its metabolites", Bioorg Med Chem, 19(7), pp 2464-9 56 Hannemann Frank, Bichet Andreas, et al (2007), "Cytochrome P450 systems— biological variations of electron transport chains", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1770(3), pp 330-344 57 Isin E M., Guengerich F P (2008), "Substrate binding to cytochromes P450", Anal Bioanal Chem, 392(6), pp 1019-30 58 Jefcoate C R (1978), "Measurement of substrate and inhibitor binding to microsomal cytochrome P450 by optical-difference spectroscopy", Methods Enzymol, 52, pp 258-79 59 Kim K H., Do H., et al (2023), "Crystal Structure and Biochemical Analysis of a Cytochrome P450 Steroid Hydroxylase (BaCYP106A6) from Bacillus Species", J Microbiol Biotechnol, 33(3), pp 387-397 60 J N., Zaengle J M., et al (2014), "Enhancing the efficiency and regioselectivity of P450 oxidation catalysts by unnatural amino acid mutagenesis", Chembiochem, 15(7), pp 1001-10 61 Lamb D C., Guengerich F P., et al (2006), "Exploiting Streptomyces coelicolor A3(2) P450s as a model for application in drug discovery", Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2(1), pp 27-40 62 LaVallie E R., Lu Z., et al (2000), " heThioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escrichia coli", Methods Enzymol, 326, pp 322-40 63 Z., Jiang Y., et al (2020), "Engineering cytochrome P450 enzyme systems for biomedical and biotechnological applications", J Biol Chem, 295(3), pp 833849 64 Makino T., Katsuyama Y., et al (2014), "Regio- and stereospecific hydroxylation of various steroids at the 16α position of the D ring by the Streptomyces griseus cytochrome P450 CYP154C3", Appl Environ Microbiol, 80(4), pp 1371-9 65 Manikandan P., Nagini S (2018), "Cytochrome P450 Structure, Function and Clinical Significance: A Review", Curr Drug Targets, 19(1), pp 38-54 66 Nguyen HH Nguyen TH, Vu CD, Nguyen KT, Le BV, Nguyen TL, Nong VH (2012), "Novel homozygous p.Y395X mutation in the CYP11B1 gene found in a Vietnamese patient with 11β-hydroxylase deficiency", Gene, pp.295-7 67 Quaderer R., Omura S., et al (2006), "Pentalenolactone biosynthesis Molecular cloning and assignment of biochemical function to PtlI, a cytochrome P450 of Streptomyces avermitilis", J Am Chem Soc, 128(40), pp 13036-7 68 Subedi Pradeep, Kim Ki-Hwa, et al (2021), "Enzymatic Characterization and Comparison of Two Steroid Hydroxylases CYP154C3-1 and CYP154C3-2 from Streptomyces Species", Journal of Microbiology and Biotechnology, 31(3), pp 464-474 69 Szaleniec M., Wojtkiewicz A M., et al (2018), "Bacterial steroid hydroxylases: enzyme classes, their functions and comparison of their catalytic mechanisms", Appl Microbiol Biotechnol, 102(19), pp 8153-8171 70 von Bühler C., Le-Huu P., et al (2013), "Cluster screening: an effective approach for probing the substrate space of uncharacterized cytochrome P450s", Chembiochem, 14(16), pp 2189-98 71 Zhao B., Lin X., et al (2008), "Biosynthesis of the sesquiterpene antibiotic albaflavenone in Streptomyces coelicolor A3(2)", J Biol Chem, 283(13), pp 8183-9 PHỤ LỤC Danh sách 10 hợp chất đưa vào sàng lọc chất cho CYP154C-sca8 Khối lượng phân tử (g/mol) Phân loại theo cấu trúc hóa học Huperzin A 242,3 Sesquiterpen Longipinen 206,4 Sesquiterpen Humulen 204,4 Sesquiterpen Nootkaton 218,33 Sesquiterpen Testosteron 288,42 Steroid Honokiol 266,3 Lignan α-Mangnostin 410,5 Xanthon Astilbin 450,4 Flavanon Naringenin 272,3 Flavanon DPPT 310,2 Hợp chất đa dị vòng thơm Tên hợp chất Cấu trúc hóa học

Ngày đăng: 15/08/2023, 22:39

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN