NGÔ THỊ BÍCH PHƯƠNG MSV 1201461 góp PHẦN NGHIÊN cứu lên MEN TỔNG hợp KHÁNG SINH từ STREPTOMYCES 183 221 KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  NGƠ THỊ BÍCH PHƯƠNG MSV: 1201461 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGƠ THỊ BÍCH PHƯƠNG MSV: 1201461 GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu - người trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu luôn tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khóa luận Trong q trình nghiên cứu, nhận nhiều giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác môn Vi sinh – Sinh học, môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Tôi xin cảm ơn đến ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Do thời gian thực có hạn, điều kiện nghiên cứu trình độ thân cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi sai sót khóa luận Vì vậy, tơi mong nhận đóng góp ý kiến, bảo thầy để khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Ngơ Thị Bích Phương MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG PHẦN PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn .3 1.1.3 Đặc điểm sinh lý 1.1.4 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 1.2 Đại cương kháng sinh 1.2.1 Định nghĩa kháng sinh 1.2.2 Phân loại kháng sinh 1.2.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh .5 1.3 Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 1.3.1 Các phương pháp cải tạo giống 1.3.2 Bảo quản giống vi sinh vật 1.4 Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men .6 1.4.2 Các phương pháp lên men 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men .7 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1 Phương pháp chiết xuất .8 1.5.2 Phương pháp tinh chế 1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 1.6.1 Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS) .9 1.6.2 Phổ hồng ngoại (IR) 1.6.3 Phổ khối lượng (MS) .10 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 10 1.7 Một số nghiên cứu gần liên quan đến Streptomyces sp 10 1.7.1 Nghiên cứu Androprostamin A B chất chống ung thư tuyến tiền liệt được sản xuất từ Steptomyces sp MK932-CF8 10 1.7.2 Nghiên cứu Langkocycline, kháng sinh angucyclin từ Streptomyces sp Acta 3034 * 11 1.7.3 Sản xuất axit clavulanic từ Streptomyces clavuligerus: sinh tổng hợp, điều khiển cải tạo giống 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng .13 2.1.1 Giống xạ khuẩn 13 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định .13 2.1.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 13 2.1.4 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 14 2.1.5 Dung mơi, hóa chất 14 2.1.6 Máy móc, thiết bị 16 2.2 Phương pháp thực nghiệm 16 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 16 2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 17 2.2.3 Phương pháp cải tạo chọn giống 17 2.2.4 Phương pháp lên men chìm tởng hợp kháng sinh 20 2.2.5 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 20 2.2.6 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 22 2.2.7 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được .22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 23 3.2 Kết đột biến UV cải tạo giống lần 23 3.3 Kết đột biến UV cải tạo giống lần .25 3.4 Kết đột biến hóa học 26 3.5 Kết chọn mơi trường lên men chìm tốt 27 3.6 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt 27 3.7 Kết lên men chìm thu dịch lên men 28 3.8 Kết tách kháng sinh sắc ký lớp mỏng 29 3.8.1 Chạy sắc ký cột lần 29 3.8.2 Chạy sắc kí lần 30 3.8.3 Chạy sắc kí cợt lần 32 3.8.4 3.8.5 Chạy sắc kí cợt lần 32 Hiệu suất trình tách tinh chế kháng sinh 33 3.9 Kết sơ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 33 3.9.1 KS3 (chất phụ) 33 3.9.2 KS1 (chất phụ) 34 3.9.3 KS2 (chất chính) 35 3.10 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2'- deoxyribonucleic B subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu Đường kính vịng vơ khuẩn ĐBUV1 Đột biến UV lần ĐBUV2 Đột biến UV lần ĐBHH Đột biến hóa học Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Ifrared (Hồng ngoại) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MS Mass Spectrometry (Phổ khối) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) P mirabilis Proteus mirabilis s Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet (tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Bảng 1.2 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 13 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 13 Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14 Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng 15 Bảng 2.5 Các hóa chất sử dụng 15 Bảng 3.1 Kết thử HTKS sau SLNN 23 Bảng 3.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần 24 Bảng 3.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần 25 Bảng 3.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH 26 Bảng 3.5 Kết chọn môi trường lên men 27 Bảng 3.6 Kết lên men chìm dạng biến chủng MT2dt 28 Bảng 3.7 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 29 Bảng 3.8 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 30 Bảng 3.9 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 31 Bảng 3.10 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 31 Bảng 3.11 Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn sau chạy cột lần 32 Bảng 3.12 Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn sau chạy cột lần 33 Bảng 3.13 Khối lượng kháng sinh tinh khiết hiệu suất tinh chế 33 Bảng 3.14 Phiên giải phổ IR KS3 34 Bảng 3.15 Phiên giải phổ IR KS1 35 Bảng 3.16 Phiên giải phổ IR KS2 36 Bảng 3.17 So sánh tín hiệu nhân phenoxazon phổ 13C-NMR KS2 với actinomycin D actinomycin X2 37 DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG PHẦN PHỤ LỤC Hình PH.1 Một số dạng khuẩn ty cuống bào tử xạ khuẩn Hình PH.2 Đĩa cấy zigzac chủng Streptomyces 183.221 sau ngày/28oC Hình PH.3 Khuẩn lạc sau ĐBUV1 Hình PH.4 Kết thử HTKS sau ĐBUV1 Hình PH.5 Kết thử HTKS sau chạy sắc ký cột lần Hình PH.6 Kết hình P mirabilis Hình PH.7 Kết chấm sắc ký lớp mỏng Hình PH.8 Chạy sắc ký cột Hình PH.9 Cấu trúc hóa học nhân phenoxazon actinomycin X2 Hình PH.10 KS2 tinh khiết Hình PH.11 KS1 tinh khiết Hình PH.12 Phổ UV-VIS KS1 Hình PH.13 Phổ UV-VIS KS2 Hình PH.14 Phổ UV-VIS KS3 Hình PH.15 Phổ IR KS1 Hình PH.16 Phổ IR KS2 Hình PH.17 Phổ IR KS3 Hình PH.18 Phổ MS KS1 Hình PH.19 Phổ MS KS2 Hình PH.20 Phổ 1H NMR KS2 Hình PH.21 Phổ 13C NMR KS2 Hình PH.22 Phổ 13C-DEPT NMR KS2 Bảng PB.1 Kết thử HTKS sau SLNN Bảng PB.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV1 Bảng BP.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV2 Bảng PB.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh truyền nhiễm nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong tồn giới Khơng thế, tình trạng lạm dụng kháng sinh nguyên nhân làm gia tăng xuất vi khuẩn đề kháng kháng sinh bối cảnh thiếu hụt kháng sinh khiến người phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” Chính nhiệm vụ đặt cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: mặt cải biến chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu tìm chất kháng sinh [21], [22] Trong số vi sinh vật có khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng hàng đầu, khoảng 60% kháng sinh có có nguồn gốc từ xạ khuẩn, đặc biệt loài thuộc chi Streptomyces [7] Đây chi xạ khuẩn lớn, chúng sản xuất loạt “chất chuyển hóa thứ cấp", có tác dụng kháng khuẩn cao Sau nắm bắt rõ thực trạng này, định tiến hành đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 183.221” với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 183.221 - Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế KS Streptomyces 183.221 tổng hợp - Sơ xác định cấu trúc kháng sinh Hình PH.21: Phổ 13C NMR KS2 Hình PH.22: Phổ 13C-DEPT NMR KS2 Bảng PB.1 Kết thử HTKS sau SLNN Kết Dạng chủng B subtilis ̅ 𝐷 (mm) 21,77 Kết P mirabilis 0,85 ̅ 𝐷 (mm) 21,99 0,81 22,01 0,03 22,63 21,74 0,77 21,97 Dạng chủng B subtilis P mirabilis 18 ̅ s 𝐷 (mm) 21,73 1,40 ̅ 𝐷 (mm) 22,22 0,59 0,97 19 20,12 0,75 22,22 1,78 22,05 0,63 20 21,95 0,48 22,68 0,35 0,27 22,61 0,70 21 22,01 1,56 22,65 0,38 20,79 0,69 22,67 0,50 22 21,53 0,78 22,53 1,31 21,81 1,10 22,95 0,54 23 19,33 0,07 20,22 1,06 23,04 1,05 24,06 0,57 24 19,51 0,41 20,62 1,46 22,54 0,59 24,29 0,48 25 20,37 0,70 22,78 0,20 23,50 0,83 22,97 0,85 26 22,07 1,15 23,01 0,65 10 22,61 0,99 23,39 0,53 27 19,37 1,10 21,75 0,90 11 23,50 0,48 24,59 0,59 28 18,32 0,28 19,22 0,94 12 23,19 0,53 24,19 0,63 29 21,35 0,85 21,63 0,40 13 21,18 0,68 22,72 0,79 30 18,56 0,61 20,05 0,85 14 22,91 0,54 23,85 0,56 31 22,41 0,41 23,86 0,98 15 22,35 0,57 23,06 0,54 32 20,51 1,03 22,18 0,74 16 21,95 0,68 21,89 1,01 33 20,81 0,22 22,63 0,52 17 19,87 0,78 22,08 0,50 s s s Bảng PB.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV1 Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B subtilis P mirabilis Biến chủng D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 24,61 0,72 110,86 25,35 1,06 108,75 22,54 0,84 101,53 24,47 1,64 104,98 24,35 0,74 109,68 25,73 0,74 110,38 23,74 0,73 106,94 25,03 0,41 107,38 23,87 0,55 107,52 25,25 0,30 108,32 24,11 0,94 108,60 25,22 0,78 108,19 24,68 0,47 111,17 26,42 0,61 113,34 23,22 1,46 104,59 23,46 0,35 100,64 22,27 0,93 100,32 22,82 0,61 97,90 10 24,42 0,99 110,00 25,19 0,35 108,07 11 22,94 0,35 103,33 24,54 0,54 105,28 12 24,65 0,77 111,04 26,17 1,04 112,27 13 23,79 0,54 107,16 24,69 0,61 105,92 14 23,14 1,52 104,23 25,14 0,17 107,85 15 23,75 0,79 106,98 24,37 1,20 104,55 16 21,87 0,84 98,51 23,06 1,04 98,93 17 23,40 0,68 105,41 24,70 1,76 105,96 18 22,79 0,97 102,66 24,57 1,62 105,41 19 24,45 0,74 110,14 25,25 1,15 108,32 20 24,46 0,47 110,18 25,93 0,72 111,24 21 23,87 0,77 107,52 25,54 0,58 109,57 22 23,15 1,09 104,28 25,17 1,45 107,98 23 21,73 0,61 97,88 23,94 0,75 102,70 24 22,34 23,08 24,98 23,88 0,51 102,45 25 23,73 0,71 106,89 23,29 0,99 99,91 26 22,07 1,18 99,41 22,84 1,47 97,98 27 22,03 0,82 99,23 21,50 0,77 92,24 28 21,67 0,89 97,61 22,28 1,29 95,58 29 23,34 1,17 105,14 24,11 0,85 103,43 30 22,03 0,84 99,23 23,15 1,62 99,31 31 22,55 0,32 101,58 23,03 0,79 98,80 32 21,51 0,78 96,89 22,47 1,50 96,40 33 21,46 0,91 96,67 21,91 0,90 93,99 MC 22,20 0,66 100,00 23,31 0,32 100,00 Bảng PB.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV2 Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B subtilis P mirabilis Biến chủng D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 23,18 0,42 100,74 22,98 0,63 98,12 24,65 1,05 107,13 25,51 0,91 108,92 21,90 0,56 95,18 22,75 0,25 97,14 25,13 0,34 109,21 25,79 0,81 110,12 24,78 0,56 107,69 25,15 0,76 107,39 24,59 0,40 106,87 25,55 0,52 109,09 23,39 0,56 101,65 25,01 0,12 106,79 24,65 0,81 107,13 25,30 1,11 108,03 23,40 0,56 101,69 23,48 0,68 100,26 10 23,05 0,36 100,17 24,43 0,99 104,31 11 23,36 0,20 101,52 23,55 0,69 100,56 12 23,27 0,67 101,13 22,61 0,54 96,54 13 24,88 0,86 108,13 25,83 0,57 110,29 14 23,87 0,66 103,74 24,23 0,58 103,46 15 23,33 0,29 101,39 24,82 0,88 105,98 16 22,53 1,10 97,91 23,67 0,48 101,07 17 23,03 0,91 100,09 23,65 0,86 100,98 18 24,30 0,36 105,61 24,54 0,17 104,78 19 25,25 0,35 109,73 25,98 0,61 110,93 20 24,38 0,84 105,95 24,59 0,94 105,00 21 23,92 0,92 103,95 24,32 0,88 103,84 22 24,64 0,66 107,08 25,54 0,53 109,05 23 23,17 0,90 100,70 22,77 0,50 97,22 24 23,55 1,00 102,35 24,68 0,88 105,38 25 25,06 0,98 108,91 25,26 0,62 107,86 26 23,53 0,46 102,26 24,26 1,05 103,59 27 23,13 0,72 100,52 24,61 0,48 105,08 28 24,13 0,36 104,87 24,66 0,88 105,29 29 23,65 0,87 102,78 23,19 1,19 99,02 30 24,54 0,52 106,65 25,21 0,58 107,64 31 23,45 0,34 101,91 24,93 0,62 106,45 32 22,86 0,92 99,35 22,17 0,88 94,66 33 22,13 0,26 96,18 22,39 1,02 95,60 MC 23,01 0,63 100,00 23,42 0,79 100,00 Bảng PB.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) B subtilis P mirabilis Biến chủng D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính 22,55 0,86 98,34 22,36 0,62 95,43 23,83 0,74 103,92 23,79 1,36 101,54 23,27 1,07 101,48 24,04 0,87 102,60 25,47 0,59 111,08 26,06 0,48 111,22 22,89 0,71 99,83 24,91 0,71 106,32 22,07 0,65 96,25 22,67 1,10 96,76 24,65 0,93 107,50 23,77 0,67 101,45 24,73 0,62 107,85 24,10 0,10 102,86 22,87 0,25 99,74 22,29 0,11 95,13 10 25,61 0,42 111,69 26,41 0,50 112,72 11 24,63 1,27 107,41 23,56 0,67 100,55 12 22,85 0,36 99,65 23,58 0,60 100,64 13 23,79 0,38 103,75 24,05 0,88 102,65 14 23,23 0,46 101,31 24,87 0,93 106,15 15 23,42 0,73 102,14 24,17 0,72 103,16 16 23,41 0,30 102,09 23,77 1,30 101,45 17 21,85 0,66 95,29 22,14 0,82 94,49 18 23,08 1,11 100,65 25,52 0,45 108,92 19 25,29 0,55 110,29 26,26 1,11 112,08 20 25,90 0,56 112,95 26,47 0,51 112,97 21 25,75 0,79 112,30 26,30 0,44 112,25 22 25,43 0,23 110,90 25,99 1,00 110,93 23 25,09 0,44 109,42 25,57 0,59 109,13 24 23,00 0,92 100,31 25,27 0,90 107,85 25 22,39 1,21 97,65 22,43 0,57 95,73 26 23,86 0,59 104,06 23,15 0,65 98,80 27 25,03 0,91 109,16 25,71 0,72 109,73 28 24,53 0,42 106,98 24,95 0,82 106,49 29 22,69 0,61 98,95 23,15 0,84 98,80 30 22,39 0,60 97,65 23,26 0,73 99,27 31 24,19 0,27 105,49 23,66 0,80 100,98 32 25,15 0,34 109,68 25,99 0,66 110,93 33 25,27 1,22 110,20 26,47 0,45 112,97 MC 22,93 0,60 100,00 23,43 0,28 100,00 ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ BÍCH PHƯƠNG MSV: 1201461 GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183. 221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS... ? ?Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 183. 221? ?? với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 183. 221. .. 14 Vũ Thị Ngà (2016), ? ?Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh sinh tổng hợp từ Streptomyces 183. 221? ??, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học khóa 2011-2016, Trường đại học dược Hà Nội 15 Lương Đức