Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119.112

[9], [16] Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất sau đây:  Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam penicillin, cephalosporin  Các kháng sinh

LÊ THỊ NGỌC HIỆP

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN

TỪSTREPTOMYCES 119.112

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ NGỌC HIỆP

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN

TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ

STREPTOMYCES 119.112

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

Ths Võ Thị Thu Thủy

Nơi thực hiện:

Bộ môn Vi sinh& Sinh học

HÀ NỘI-2013

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths Võ Thị Thu Thủy người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học , Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội , Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn , khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2013

Sinh viên

LÊ THỊ NGỌC HIỆP

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh .2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.2.Đại cương về xạ khuẩn 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5

1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh……….…6

1.4.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 6

1.4.1 Mục đích 7

1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sáng lọc ngẫu nhiên 7

1.4.3 Đột biến cải tạo giống… .7

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn ……… 8

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8

1.5.1 Các phương pháp lên men 9

1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 10

1.6.2 Các phương pháp chiết tách 11

1.7.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12

1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 12

1.7.2 Phổ hồng ngoại 12

1.7.3 Khối phổ 13

từStreptomyces sp M-Z18……… 13

1.8.2 Tinh chế ái lực Phosphoprotein xác định các protein tham gia vào S-adenosyl-L-methionine làm tăng cường sản xuất kháng sinh trong Streptomycescoelicolor………

14

1.8.3 Xác định định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces ambofaciens……… 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Máy móc thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 18

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 18

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 19

2.3 Phương pháp thực nghiệm 19

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19

2.3.3 Chọn lọc ngẫu nhiên 20

2.3.4 Đột biến ……… 21

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 22

2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 23

2.3.7 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 23

2.3.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26

3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 27

3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 27

3.4 Kết quả đột biến hóa học bằng HNO2 28

3.5 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 29

3.6 Kết quả chọn chủng lên men 30

3.7 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 30

3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31

3.9 Kết quả sắc kí cột……… 32

3.9.1 Kết quả sắc ký cột lần 1 32

3.9.2 Kết quả sắc ký cột lần 2 34

3.9.3 Kết quả sắc ký cột lần 3 36

3.10 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

ISP International Streptomyces Project

(Chương trình Streptomyces quốc tế) ADN Acid deoxyribonucleic

ATCC 6633 Trung tâm giữ giống Hoa Kỳ

BV 108 Bệnh viện 108

B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633

ĐB1 Đột biến lần 1

ĐB2 Đột biến lần 2

ĐBHH Đột biến hóa học

MT1dt Môi trường dịch thể 1

MT2dt Môi trường dịch thể 2

MT6dt Môi trường dịch thể 6

P mirabilis Proteus mirabilis BV 108

SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 1: Các vi khuẩn kiểm định

Bảng 2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 4: Các dung môi đã sử dụng

Bảng 5: Kết quả thử HTKS sàng học ngẫu nhiên

Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2

Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học

Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm

Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men

Bảng 11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết

Bảng 12: Kết quả SKLM chọn hệ dung môi

Bảng 13: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc ký lần 1

Bảng 14: Kết quả SKLM sau chạy cột lần 1

Bảng 15: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc ký lần 2

Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2

Bảng 17: Kết quả thử HTKS nhóm 2 sau chạy cột

Bảng 18: Kết quả SKLM nhóm 2 sau chạy cột

Bảng 19: Kết quả thử HTKS nhóm 3 sau chạy cột

Bảng 20: Kết quả SKLM nhóm 3 sau chạy cột

Bảng 21: Kết quả IR

Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính

Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

Hình 3: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

Hình 4: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Hình 5: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn

Hình 6: Pic sắc ký cột lần 1

Hình 7: Pic sắc ký cột lần 2

Hình 8: Pic sắc ký cột lần 3 nhóm 2

Hình 9: Pic sắc ký cột lần 3 nhóm 3

Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày

Hình PL2: Kết quả đột biến bằng ánh sáng UV

Hình PL3: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch(P mirabilis)

Hình PL4: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch (B subtilis)

Hình PL5: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc(B subtilis)

Hình PL6: Kết quả chọn MT lên men chìm

Hình PL7: Kết quả chọn chủng lên men

Hình PL8: Kết quả SKLM sau chạy cột lần 1

Hình PL9: Kết quả chạy sắc ký cột

Hình PL10: Kết quả đo phổ UV của kháng sinh

Hình PL11: Kết quả đo phổ IR của kháng sinh

Hình PL12: Kết quả đo phổ khối của kháng sinh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc khám phá và phát triển các kháng sinh đã tạo ra các thế lực vũ khí hữu hiệu giúp con người chống lại vi khuẩn Phạm vi điều trị của kháng sinh hiện nay không chỉ dừng lại ở các bệnh nhiễm khuẩn, mà kháng sinh còn được dùng ngày một nhiều để điều trị ung thư

Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển kháng sinh mới đang có xu hướng giảm theo thời gian Trong khi đó, mô hình các bệnh nhiễm khuẩn ngày càng đa dạng, việc sử dụng kháng sinh ngày một tràn lan, tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và đang là mối lo ngại toàn cầu

Hiện trạng đó đang là tiếng chuông cảnh báo, con người sẽ thua trong cuộc chiến chống vi khuẩn Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu và cấp thiết trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe người dân

Trong tất cả các kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 55% có nguồn

gốc từ xạ khuẩn và 60% trong số đó thuộc chi Streptomyces Đó là cơ sở để các nhà

khoa học nước ta hiện nay tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này

Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 119.112” làm khóa luận tốt nghiệp Chủng Streptomyces 119.112

do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội phân lập và cung cấp Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây:

- Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces

119.112bằng sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống

- Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men

- Chiết tách và tinh chế kháng sinh thu được

- Từng bước xác định đánh giá tính chất vật lý và cấu trúc hóa học của kháng

sinh do chủng Streptomyces 119.112

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn

tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …)

hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [9], [15]

Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao.[9], [15]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác [9], [16]

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất sau đây:

 Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)

 Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

 Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)

 Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)

 Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)

 Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)

 Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

 Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)

 Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D)

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó.[16]

Hình 1 giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính

Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính

 Ức chế quá trình tổng hợp vách TB vi khuẩn: -lactam, nhóm Glycopeptid

 Tác động lên tổng hợp protein của vi khuẩn: tetracycline, aminoglycosid (lên tiểu đơn vị 30S), cloramphenicol, macrolid, lincosamid (50S)

 Ức chế quá trình tổng hợp acid nhân: nhóm quinolon, rifampicin

 Thay đổi tính thấm của màng: polymicin (colistin)

 Kháng chuyển hóa: acid folic, sulfamid, trimethoprim

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh có tỷ lệ G+C>55% Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh

Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[5], [6], [10], [15]

Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 55% là do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác

Một số đặc điểm của xạ khuẩn:

 Đường kính khuẩn ty xấp xỉ khoảng 0,2-0,1 m đến 2-3

 Màu sắc khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím…

 Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10nm, không có cellulose, kitin

 Đa số khuẩn ty không có vách ngăn

 Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính

 Bắt màu nhóm vi khuẩn Gr(+) khi nhuộm Gram

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:

Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [5], [6], [10], [15]

Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 60% là từ Streptomyces [15]

 Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty

khí sinh:

• Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ

• Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ

• Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ

Actinomycetes

VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales

Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae …

Streptomyces

yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha)

Hình 3: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

 Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để

phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5

 Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc

tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh,sắc tố melanoid

1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Hình 4: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.4.1 Mục đích

Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Dịch lọc Sinh khối

Sinh khối thô

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm tinh chế

Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói

Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp [9], [13]

1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 10-30 % so với những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.[9]

Trong thực tế, chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo

1.4.3 Đột biến cải tạo giống

 Phương pháp đột biến nhân tạo kết hợp với sàng lọc là phương pháp cải tạo

giống hiệu quả

 Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

• Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat…

• Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

• Tác nhân sinh học: Transposon, Bacteriophage Mu, …

 Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương)

 Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần [9], [11]

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Bảo quản giữ giống VSV là công việc cần thiết do các giống dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học Mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp)

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2°C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [9], [13]

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng

Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng [9]

Hình 5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 1.5.1 Các phương pháp lên men

Có 2 phương pháp lên men chính:

 Lên men bề mặt: Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt

cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng

• Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp

• Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp

 Lên men chìm : Vi sinh vật (hiếu khí&kị khí) được nuôi cấy trong môi trường lỏng

• Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao

• Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn

• Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục

- Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm

- Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men

- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ sung thêm MT mới vào bình

- Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định [4], [9]

1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

 pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp

của các ion H+

hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp

 Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong

tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm phát Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí tương đối mạnh là tốt

 Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [13]

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết định giá thành của sản phẩm [9]

1.6.2 Các phương pháp chiết tách

 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tùy theo đặc tính của loài mà KS được tiết và o môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB Để thu lấy các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp

 Một số phương pháp chiết tách thường dùng:

• Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

• Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên cột…)

• Phương pháp tạo phức kết tủa, chưng cất, thăng hoa

 Chiết xuất:

Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thường một pha là nước)

 Phương pháp sắc ký:

• Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một hỗn hợp nhiều thành phần Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng

• Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

• Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:

- Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực

- Sắc ký cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động Dùng cột thủy tinh hoặc cột bằng kim loại có KT 50×1(cm) Bên trong cột có chứa chất hấp phụ ở dạng hạt nhỏ, thường là silicagel, nhôm oxyd, tinh bột…là pha tĩnh đã được chuẩn hóa để đảm bảo kích thước chuẩn Dung môi sử dụng là dung môi trơ hoặc dung môi có độ phân cực thích hợp là pha động(ethyl acetat, n-hexan, aceton, methanol…) hoặc hỗn hợp giữa chúng [1], [3], [15]

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.7.2 Phổ hồng ngoại

 Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau

 Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức [1], [2], [8]

1.7.3 Khối phổ (MS: mass spectrometry)

Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm tới một dòng electron có năng lượng cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion và trở thành ion co điện tích +1 (chiếm tỉ lệ lớn) và +2 Loại ion này được gọi là ion gốc hay ion phân tử Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn hơn thì chúng sẽ vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc hay các phân tử trung hòa khác nhau Các ion có khối lượng m và điện tích e Tỷ số m/e gọi là số khối z Người ta ghi lại phổ khối dưới dạng vạch hay bảng [8]

1.8 Một số nghiên cứu liên quan

1.8.1 So sánh glucose và glycerol làm nguồn carbon cho sản xuất ε-poly- Lysin từ Streptomyces sp M-Z18

L-Glucose được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các ε-poly-L-lysine(ε-PL) Tuy nhiên, glycerol là một nguồn carbon mới cho quá trình sản xuất ε-PL trong những năm gần đây Trong nghiên cứu này, Glycerol vượt trội so với đường glucose cho sản xuấtε-PL theo phương pháp lên men hàng loạt chủngStreptomyces sp M-Z18 trên glycerol được so sánh với glucose trong suốt quá trình lên men để chỉ ra sự khác biệt Hoạt động của các enzyme quan trọng cho thấy aspartate kinase (ASPK) và ε-PL synthetase (Pls) trong môi trường glycerollaf cao hơn so với đường glucose, và đặc biệt là hoạt động của Plscos thể tăng lên 2,3 đến 3,6 lần tương ứng tại thời điểm 24 và 36

giờ Hơn nữa, phân tích thông lượng chuyển hóa đã chứng minh rằng một thông lượng cao hơn 25% có nguồn gốc từ glycetol được hướng vào tổng hợp ε-PL hơn so với đường glucose Kết quả là, cơ chế của glycerol tốt hơn so với đường glucose được xác định: các hoạt động của ASPK và Pls trong glycerol cao hơn so với glucose, và kết quả là nguồn carbon trực tiếp vào tổng hợp ε-PL tăng lên Nghiên cứu này cung cấp một tài liệu tham khảo để thay thế glycerol glucose thông thường như nguồn carbon để sản xuất ε-PL [17]

1.8.2 Tinh chế ái lực Phosphoprotein xác định các protein tham gia vào adenosyl-L-methionine làm tăng cường sản xuất kháng sinh trong Streptomyces

S-coelicolor

Streptomyces là chi lớn sản xuất thuốc kháng sinh hữu ích có nguồn gốc tự

nhiên Các sản phẩm chuyển hóa trong Streptomyces thường biến dạng khá rõ ràng, do

đó rất khó để phát triển một phương pháp chung để thúc đẩy việc sản xuất các sản phẩm

chuyển hóa ở hầu hết các chủng Streptomyces Việc nâng cao sản phẩm chuyển hóa của nhiều Streptomyces bởi S-adenosylmethionine (SAM) trong các nghiên cứu trước đó

cho thấy sự tồn tại của một tác động điều hòa SAM (SAM regulatory effect) Trong nghiên cứu này đã sàng lọc 9 protein bằng cách sử dụng các cột lọc phosphoprotein từ

Streptomyces coelicolor Trong số đó, gen (SCO5477, SCO5113, SCO4647, SCO4885 và SCO1793) cho năm protein bị gián đoạn bởi đột biến chèn Các sản phẩm undecylprodigiosin và actinorhodin đã được thay đổi trong tất cả các đột biến SAM làm tăng cường sản xuất actinorhodin đã bị mất bởi tất cả các đột biến trừ đột biến SCO4885,làm giảm sản xuất các actinorhodin và undecylprodigiosin kho xử lý SAM (SAM) Nghiên cứu này chứng minh rằng lọc ái lực phosphoprotein có thể được sử dụng như một phương pháp sàng lọc để xác định các protein liên quan đến dấu hiệu SAM [18]

1.8.3 Xác định định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces

Ambofaciens

Nhu cầu tìm kiếm các thuốc mới để chống lại bệnh nhiễm trùng, ung thư và

những bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con người luôn là rất lớn Gần đây, những phương pháp nghiên cứu tiếp cận di truyền rất phát triển, thúc đẩy sự đổi mới trong việc

tìm kiếm các thuốc có nguồn gốc tự nhiên Phân tích bộ gen của S ambofaciens

ATCC23877 phát hiện thấy nhiều cụm gen sinh tổng hợp các chất chuyển hóa bậc 2, bao gồm một cụm gen sinh tổng hợp polyketide typ I (Polyketide synthetase- PKS) PKS bao gồm 25 gen (9 gen trong số đó mã hóa PKSs), dung lượng khoảng 150 kb Đó là một trong những gen sinh tổng hợp polyketid lớn nhất được mô tả cho đến nay Những sản phẩm chuyển hóa của cụm gen này chưa được biết rõ, phân tích quá trình phiên mã cho thấy nó không biểu hiện trong điều kiện phát triển ở phòng thí nghiệm Biểu hiện của một gen nhất định trong cụm mã hóa một protein, tương tự như liên kết ATP của LuxR trong một nhóm protein lớn (LAL), kích hoạt biểu hiện các gen sinh tổng hợp Điều này dẫn đến việc xác định được 4 trong 51 macrolid, được đặt tên là Stambomycin A-D như là sản phẩm chuyển hóa của cụm gen Cấu trúc của các hợp chất này bao gồm một số tính năng sinh tổng hợp thú vị, như sắp xếp các đơn vị mở rộng bất thường trong chuỗi polyketid và hydroxyl hóa các chuỗi polyketid đang phát triển để cung cấp nhóm hydroxyl cấu thành macrolid Stambomycin có thể chống lại sự gia tăng nhanh của các tế bào ung thư ở người Cơ sở dữ liệu tìm kiếm xác định các gen điều chỉnh mã hóa LAL trong nhiều cụm gen sinh tổng hợp bí ẩn của bộ gen xạ khuẩn, cho thấy biểu hiện hoạt hóa các con đường chuyển hóa riêng biệt đại diện cho cách tiếp cận mới các sản phẩm có hoạt tính sinh học từ tự nhiên [19]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 119.112 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học

trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được trình

bày ở bảng 1

Bảng 1: Các vi khuẩn kiểm định

Bacillus subtilis ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường

• Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở bảng 2

• Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng loại bỏ thạch

Bảng 2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

• Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần các MT trình bày ở bảng 3

Bảng 3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần

• Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

• Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 1.4 ở trên

• Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,03-0,1mm

 Hóa chất: dung dịch HCl 1M, NaOH 1M, NaNO2

 Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có

mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

 Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

 Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

 Đột biến hóa học

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu

 Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

 Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

 Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

 Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

 Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

 Xác định nhiệt độ nóng chảy

 Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

 Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C

 Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

 Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định,

kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

 Tiến hành:

• Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106

-108tế bào/ml

• Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa

• Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

- Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50°C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.(xem PL5)

- Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định (Xem hình PL3)

- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng (Xem hình PL4)

• Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định

• Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

 Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 119.112, cho

vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn

dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1(định ước) Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6

bằng nước vô trùng

 Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ

pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa Petri Dùng que trang

vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ

 Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ

sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt MT1 trong đĩa Petri cho các đĩa vào ủ ấm 28°C trong

6 ngày, lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Chọn 3-5 dạng chủng tốt nhất để nghiên cứu tiếp.(xem hình PL1)

2.3.4 Đột biến

 Đột biến bằng ánh sáng UV

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 119.112, cho

vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước) Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng

• Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1

đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5bằng nước vô trùng

• Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu

chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4

và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc

 Đột biến hóa học bằng HNO 2

Nguyên tắc: HCl +NaNO2 = NaCl + HNO2

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 119.112, cho

vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước) Sau đó dung 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6làm mẫu chứng, 9ml còn lại đưa vào ống nghiệm

• Đột biến bằng HNO 2: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ từ 10-1

, cho 0,0621g NaNO2 vào ống hòa tan hoàn toàn (nồng độ HNO2:0,1M) Sau đó, nhỏ HCl 0,1N vào ống nghiệm đó đến khi ph=4,5 để 2-3 phút, rồi nâng ph=7-8 bằng NaOH 0,1N, dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5 bằng nước cất vô trùng

• Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu

chứng 10-6và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-1

, 10-2 , 10-3 , 10-4 và 10-5vào các đĩa Petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc

 Cách tính kết quả:

• Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

% độ sống sót = x 10- 6+k x 100%

Trong đó: N m: Số khuẩn lạc sau đột biến,

N o: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng,

10-k: là nồng độ mẫu đột biến

• Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên Làm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

% biến đổi hoạt tính = Trong đó: