Góp phần nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học thân rễ mía dò (costus specisus smith)

Tác giả đã thái phiến thân rễ tươi cây mía dò rồi đem ủ ở 37°C với nước, có thêm những dung dịch điều hòa tăng trưởng trong 24h rồi sau đó định lượng bằng phương pháp đo màu.. Thân rễ rử

HỌC CỦA THÂN RỄ MÍA DÒ

(Costus speciosus Smith)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HỌC CỦA THÂN RỄ MÍA DÒ

(Costus speciosus Smith)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hoàng Tuấn, giảng viên bộ môn Dược liệu, người đã góp ý, chia sẻ kinh nghiệm giúp tôi thực hiện phần phân tích diosgenin

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn Dược liệu và các phòng ban trong nhà trường

đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương tới gia đình, bạn bè, những người

đã luôn ở bên, động viên, khích lệ rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say

mê trong nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2013 Sinh viên

Trần Thị Diệu Linh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 2

1.1.1 Vị trí phân loại: 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật: 2

1.1.3 Phân bố, sinh thái, bộ phận dùng 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC: 5

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ: 7

1.3.1 Tác dụng chống viêm: 7

1.3.2 Tác dụng gây thu teo tuyến ức: 8

1.3.3 Tác dụng giảm đau: 8

1.3.4 Ảnh hưởng của cao mía dò đối với sự sinh sản: 8

1.3.5 Về độc tính: 9

1.3.6 Một số tác dụng của hoạt chất Diosgenin: 9

1.4 CÔNG DỤNG, TÍNH VỊ VÀ CÔNG NĂNG: 10

1.4.1 Tính vị, công năng : 10

1.4.2 Công dụng và 1 số bài thuốc: 10

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU: 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 13

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật: 13

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học: 14

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT: 15

3.1.1 Đặc điểm thân rễ mía dò: 15

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu: 15

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu: 17

3.2 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC: 19

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học: 19

3.2.2.Định tính Flavonoid toàn phần bằng SKLM: 28

3.2.3.Nghiên cứu về Diosgenin 30

3.3 BÀN LUẬN 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 40

1 Kết luận: 40

2 Kiến nghị: 41

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ mía dò 26, 27

2 3.2 Kết quả định lượng 4 phương pháp chiết Diosgenin 34

13 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết 4 phương pháp với diosgenin chuẩn 33

14 3.9 Sắc ký đồ dịch chiết mẫu M1, M2 với diosgenin chuẩn 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mía dò là một cây rất sẵn có ở nước ta, có ở khắp mọi nơi trong cả nước Cây sinh trưởng phát triển nhanh, khả năng tái tinh vô cùng khỏe vì vậy nguồn trữ lượng Mía dò ở nước ta rất lớn, dồi dào, ước tính đến hàng tấn Trong YHCT, cây có nhiều tác dụng như: thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, chống viêm,

để chữa thấp khớp, viêm gan, thận, xơ gan cổ trướng, viêm bàng quang, niệu đạo tiểu buốt, tiểu rắt, sốt Ngoài ra trong nhiều công trình nghiên cứu và các tài liệu chuyên môn [6], [16], [17], hàm lượng Diosgenin trong thân rễ mía dò khá cao khoảng 1,3-5,0%, có thể là một nguồn khai thác Diosgenin, nguyên liệu bán tổng hợp các thuốc có nguồn gốc steroid và một số hormon tuyến thượng thận Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam, việc nghiên cứu về vị thuốc này vẫn còn ít, chưa có

hệ thống đầy đủ Để khai thác, bảo tồn nguồn tài nguyên cây thuốc này một cách bền vững, hướng dẫn sử dụng an toàn, hợp lí và hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Góp phần nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần

hóa học của thân rễ mía dò (Costus speciosus Smith)” với mục tiêu sau:

- Nhận dạng đặc điểm hình thái, vi phẫu và bột thân rễ mía dò

- Định tính thành phần hóa học thân rễ mía dò

- Khảo sát một số phương pháp chiết Diosgenin và phân tích cặn bằng SKLM

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại:

Mía dò có tên khoa học là Costus speciosus (Koenig) Smith Cây còn có các

tên gọi khác như: tậu chó (Lạng Sơn), đọt/ đót đắng, đọt hoàng, cát lồi, củ chóc,

sẹ vàng, nó ưởng, ỏi pha (Tày), co ướng bôn (Thái), mía voi, là 1 loài thuộc chi

Costus L [7], [9], [17], [1], [18], [12], [15]

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1997) [29], các tài liệu [7], [9], [17],

[1], [18], vị trí của chi Costus L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt

Theo các tài liệu [7], [9], [17], [18], [12], [10], đặc điểm thực vật của loài

Costus speciosus (Koenig) Smith được mô tả chung như sau:

Cây thảo, sống lâu năm, cao 1-2m, có khi đến 3m Thân rễ to, nạc, phân nhánh, mọc bò ngang, phần non có vảy bao bọc, vảy có lông ngắn Thân khí sinh, chia đốt, xốp, ít phân nhánh Lá mọc so le, hình trứng thuôn, gốc tròn có

bẹ, đầu nhọn, mép nguyên, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông mịn, dài 15–20cm, rộng 6–7cm, gân chính nổi rõ Lá non mọc thành một đường xoắn ốc rất đặc biệt

Bẹ lá nhẵn hoặc có lông, lúc non màu lục nhạt, sau chuyển trắng ngà hoặc đỏ sẫm; lưỡi bẹ phẳng hoặc hơi vát

Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông chùy, dài 8–15cm, rộng 5–9cm; hoa to, đẹp, màu trắng; lá bắc dày, xếp lợp, màu đỏ, có mũi nhọn, lá bắc con kề bên, cùng màu; đài hình ống loe ở đầu, có 3 răng cứng màu đỏ sẫm; tràng hình phễu,

có ống ngắn và cong màu trắng, họng vàng, nhẵn hoặc có lông; nhị dạng cánh mang 1 bao phấn, chỉ nhị kết hợp với trung đới kéo dài thành một phần phụ hình trứng đảo hẹp, đầu tròn cong lòng máng ôm lấy vòi nhụy; cánh môi to, màu hồng, trắng hoặc vàng, khía răng ở đầu; bầu nhẵn hoặc có lông Quả nang hình trứng hoặc hình bầu dục có 3 cạnh, màu đỏ sẫm, có đài tồn tại; hạt nhiều, có cạnh không đều, màu đen Mùa hoa quả: tháng 7–11

Loài này còn có 1 thứ là Costus speciosus (Koenig) Smith var argyrophyllus

Wall với đặc điểm là mặt dưới lá màu lục nhạt phủ lông dài và dày hơn Lá bắc, đài hoa, bầu và quả có lông cứng, nhỏ màu hung xám [17]

Ngoài ra còn có cây khác cũng mang tên mía dò, còn gọi là Mía dò hoa gốc

(Costus tonkinensis Gagnep.) hay Mía dò lá nhẵn, Chóc Bắc bộ, Cát lồi Bắc bộ, cùng chi với Costus speciosus (Koenig) Smith Cây này có đặc điểm gần giống cây mía dò Costus speciosus (Koenig) Smith, điểm khác cơ bản là hoa mọc ở

gốc, kích thước nhỏ hơn, hoa màu vàng, lá 2 mặt đều nhẵn, có nhiều chấm trắng

rải rác Công dụng dùng tương tự như cây Costus speciosus (Koenig) Smith [7],

[9], [17], [12]

1.1.3 Phân bố, sinh thái, bộ phận dùng

Chi Costus L có khoảng 175 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới, rộng rãi từ Ấn Độ sang Trung Quốc và xuống các quốc gia vùng Đông Nam Á Ở Việt Nam có 1 chi 2 loài và 1 thứ [8], [17], [18]

Mía dò chỉ thấy phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Á, bao gồm Ấn Độ, Xrilanca, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, Việt Nam, Tân Ghinê, các tỉnh Nam Trung Quốc và đảo Hải Nam Ở Việt Nam, cây phân bố rộng rãi ở tất cả các tỉnh thuộc vùng núi, trung du và cả đồng bằng Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng (khi nhỏ), thường mọc thành khóm lớn trên đất ẩm, xen với các cây cỏ khác ở ven rừng, ven bờ sông suối, bờ nương rẫy Ở vùng đồng bằng ít gặp hơn, trong các lùm bụi quanh làng hay vườn đã bị bỏ hoang lâu ngày Các tỉnh có nhiều mía dò là: Hòa Bình, Sơn La, Lai Châu, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Tiền Giang, Long An, Đồng Tháp Ở miền Nam cây mọc trên các bờ kênh rạch Độ cao phân bố của cây rất rộng, từ vài chục mét đến gần 1500m [9], [17]

b Sinh thái:

Mía dò là cây sinh trưởng phát triển nhanh trong mùa xuân-hè Từ thân rễ, hàng năm mọc ra nhiều chồi theo hướng nằm ngang Loại chồi này mọc thành cây và có thể ra hoa quả ngay trong năm đầu tiên Sau khi quả già, phần trên mặt đất thường lụi đi Cá biệt có trường hợp cây không lụi, nhưng lại mọc chồi ở nách lá [17] Quả Mía dò khi già tách thành 3 mảnh để hạt thoát ra ngoài, nảy mầm đạt tới 80% [18] Cây con mọc từ hạt thường thấy vào tháng 3-4 hàng năm

Mía dò có khả năng tái sinh vô tính khỏe Các đoạn thân khí sinh cũng như các đoạn thân rễ đều có thể tạo thành cây mới [17], [18]

Nguồn trữ lượng Mía dò ở Việt Nam rất dồi dào, ước tính đến hàng tấn [17]

c Bộ phận dùng, thu hái và chế biến:

Bộ phận dùng: thân rễ, búp non, cành non [9], [17]

Thân rễ, thu hoạch vào mùa thu, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, thái phiến phơi hay sấy nhẹ cho khô [9], [17], [18] Nếu thân rễ khô phải ủ cho mềm rồi thái phiến Dùng lửa nhỏ sao đến khi bề mặt phiến có màu vàng Búp và cành dùng tươi [17] hay thái lát phơi khô [18]

Costus speciosus tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [25]

Hình 1.1 Diosgenin

Hàm lượng Diosgenin trong Mía dò khác nhau ở các vùng phân bố địa lý khác nhau [18] Ở Việt Nam, năm 1985, Phạm Kim Mãn và cộng sự (Viện Dược Liệu) đã chứng minh các saponin steroid trong mía dò (di thực từ Ấn Độ sang Việt Nam dưới dạng furostan (vòng F mở) lên men trong môi trường nước sẽ

cao hiệu suất diosgenin lên nhiều lần Năm 1997, Inoue Kentaro, Ebizuka, Yutaka đã tinh chế và xác định β glucosidase để chuyển hóa các furostanol glycoside trong mía dò thành spirostanol glycoside [17]

Shah, Bhavsar và Seth (Curr.Sci.1978 N°8, 270-71) đã áp dụng phương pháp

ủ thân rễ Mía dò Costus speciosus Smith thu hoạch ở những cây 60 ngày tuổi

thấy hàm lượng Diosgenin được tăng lên hết sức cao Tác giả đã thái phiến thân

rễ tươi cây mía dò rồi đem ủ ở 37°C với nước, có thêm những dung dịch điều hòa tăng trưởng trong 24h rồi sau đó định lượng bằng phương pháp đo màu Kết quả cho thấy hàm lượng diosgenin là 1,3% trong mẫu đối chứng tăng lên đến 3,5% khi ủ với nước, 5,0% khi ủ có 2,4-D Mức tăng tối đa tính theo hiệu suất là 270% Có thể nói đây là 1 phương pháp làm tăng hoạt chất rất đáng chú ý Ngoài

ra còn có một số chất kích thích sinh trưởng khác có thể kể đến như: indol-3 acetic acid, acid gibberellic [6], [16]

+Các chất Triterpen:

Năm 1988, Gupta.M.M Sing S.P Shukla Y.N đã xác định một số triterpen trong thân rễ mía dò là 31 norcycloartanon (I) cycloartanol, cycloartenol và cycloandenol [17] Năm 2002, Qiao CF, Li QW, Dong H, Xu LS, Wang ZT cũng

đã phân lập được cycloartanol và 25-en-cycloartenol từ thân rễ Mía dò [25]

Hình 1.2 (I) 31 norcycloartanon Hình 1.3 Cycloartenol

+Curcumin:

Năm 1990, Gaitonde R.V Sapre S.P đã chiết và phân lập được chất curcumin,

từ thân rễ tươi cây Mía dò [17]

Hình 1.4 Curcumin

+Bis (2 ethyl hexyl) phtalat :

Năm 1988, một chất có hoạt tính sinh học là este của acid phtalic là bis (2 ethyl hexyl) phtalat đã được Farooqui A.H; Shukla Y.N phân lập từ thân rễ mía

dò Chất này ức chế sự phát triển của lúa mỳ ở nồng độ 200-400 μg/l [17]

Hình 1.5 Bis (2 ethyl hexyl) phtalat

Ngoài ra còn một số thành phần khác như: Thân rễ Mía dò tươi chứa 77-87% nước, khi khô là 5,5% nước, 0,75% chất tan trong ether, 6,75% chất albuminoid , 66,65% carbohydrate, 10,65% xơ và 9,70% tro ,… [9], [15], [18], [17]

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ:

1.3.1 Tác dụng chống viêm:

Ở cả hai giai đoạn viêm cấp tính và mạn tính, cao Mía dò đều có tác dụng chống viêm rõ rệt [18] Trên các mô hình viêm cấp như gây phù bàn chân chuột

ức chế phù đạt 32% và 58,5% Trên mô hình gây phù bằng kaolin với những liều dùng trên mức độ ức chế phù đạt 49,7% và 52%; còn trên mô hình gây viêm khớp thực nghiệm trên chuột cống trắng, cao mía dò với liều 0,25g/kg ức chế hiện tượng sưng khớp đạt 55,6% Ở giai đoạn viêm mạn tính với mô hình gây u hạt thực nghiệm trên chuột trắng; cao mía dò với các liều 0,75g/kg và 1,25g/kg làm giảm trọng lượng u hạt 29,5% và 47,2% [17] Trong 1 thí nghiệm khác thực nghiệm trên chuột cống trắng cũng cho thấy, cao Methanol của cây Mía dò ở liều

400 và 800 mg/kg có tác dụng ức chế phù nề chân đạt 75,50% và 68,33% [27]

1.3.2 Tác dụng gây thu teo tuyến ức:

Thí nghiệm trên chuột cống trắng đực còn non, cao mía dò tiêm dưới da với liều 0,3g/kg và 0,5g/kg làm giảm trọng lượng tuyến ức 34,5% và 49,7% so với lô đối chứng [17], [18]

1.3.3 Tác dụng giảm đau:

Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, gây đau nội tạng bằng cách tiêm xoang bụng dung dịch acid acetic, cao mía dò với các liều 0,17g/kg và 0,25g/kg có tác dụng làm giảm số lần quặn đau 48,8% và 60% so với lô đối chứng [17], [18]

1.3.4 Ảnh hưởng của cao mía dò đối với sự sinh sản:

Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng cả đực cả cái, cao mía dò dùng liều hàng ngày 0,7g/kg trong 10 ngày liên tục Khi bắt đầu dùng thuốc cho chuột giao phối, theo dõi tỉ lệ chuột có chửa, tình hình sinh đẻ, số lượng và quá trình phát triển của chuột con Kết quả cho thấy so với lô đối chứng, cao mía dò không ảnh hưởng đến sự sinh sản của chuột [17] Thí nghiệm trên chuột cống cái

đã cắt buồng trứng, hỗn hợp này làm tăng trọng lượng tử cung một cách có ý nghĩa [17] Saponin toàn phần trong rễ cát lồi (Mía dò) có tác dụng kiểu estrogen trên cơ địa chuột bình thường và chuột gây suy giảm chức năng sinh dục [13]

1.3.5 Về độc tính:

Đã tiến hành xác định độc tính cấp và mạn của cao mía dò Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, bằng đường uống, cao mía dò có LD50 = 7,28g/kg (5,38-9,82g/kg) Về độc tính mạn, liều dùng hàng ngày 0,3g/kg trong 30 ngày liên tiếp, được tiến hành trên thỏ không gây ảnh hưởng đến cân nặng, các chỉ số huyết học

và công năng gan, thận [17]

1.3.6 Một số tác dụng của hoạt chất Diosgenin:

a Tác dụng chống ung thư:

Trong 1 nghiên cứu mới đây tại Ấn Độ cho thấy Diosgenin đã thể hiện được tác dụng chống ung thư vú thông qua tác dụng làm giảm peroxy lipid, tăng cường hệ thống phòng thủ chống oxy hóa Thí nghiệm được thực hiện trên chuột cái Sprague Dawley Tiến hành gây ung thư vú trên chuột bằng cách tiêm vào phúc mạc chuột 1 liều duy nhất N–methyl–N–nitrosourea (NMU – 1 chất gây ung thư vú giống hệt như bệnh ung thư vú ở người) với nồng độ 50mg/kg trọng lượng cơ thể, pha loãng trong nước muối 0,9% Sau đó những con chuột được cho uống Diosgenin liều 20mg/kg trong 45 ngày Kết quả thật thú vị, điều trị bằng Diosgenin đã làm giảm đáng kể các phản ứng peroxy và hệ thống phòng thủ chống oxy hóa trong cơ thể đột xuất được tăng cường Nghiên cứu mô bệnh học của vú và các mô gan đã xác nhận sự thay đổi sinh hóa [23]

b Tác dụng kích thích tăng trưởng tuyến vú:

Tác dụng của Diosgenin trên biểu mô vú của chuột đã được báo cáo Diosgenin được theo dõi ở mức liều 20 và 40mg/kg trong thời gian 15 ngày, kích thích sự phát triển của biểu mô vú Điều này đã được chỉ ra bởi sự gia tăng đáng

kể trong những điểm phát triển vú, tăng số lượng các ống dẫn khi sử dụng

Diosgenin Dùng đồng thời estrogen và Diosgenin cho thấy làm tăng tác dụng của estrogen, đặc biệt là ở liều cao (40mg/kg) [21]

c Tác dụng trên chuyển hóa cholesterol, muối mật:

Diosgenin có tác dụng trong việc làm giảm hấp thu cholesterol, đồng thời làm tăng quá trình bài tiết cholesterol mật [20], ức chế enzyme HMG–CoA reductase [24], [26], [28] làm cho nồng độ cholesterol trong huyết thanh giảm xuống và quá trình bài tiết muối mật cũng giảm theo [20] Người ta đã chỉ ra rằng: có mối liên quan mật thiết giữa số lượng muối mật và số lượng cholesterol được bài tiết

ở gan khi sử dụng diosgenin, quá trình bài tiết cholesterol mật tăng thì lượng muối giảm [20]

1.4 CÔNG DỤNG, TÍNH VỊ VÀ CÔNG NĂNG:

ra, thân rễ Mía dò còn được dùng làm thuốc thanh lương, bổ, lọc máu, trị suyễn, chữa ho, chống nấm, tác dụng xổ, trừ giun [9], [12], [15] Trong công nghiệp, Mía dò được sử dụng làm nguyên liệu chiết diosgenin để bán tổng hợp thuốc corticoid, thuốc tránh thụ thai [18], [15], [10]

+ Một số bài thuốc:

- Chữa xơ gan cổ trướng: Thân, rễ cây Mía dò 30g, rễ cỏ tranh 20g, chó đẻ răng

cưa 20g, rau má 20g, đậu đen 20g, sắc uống ngày 1 thang [19]

- Chữa đau mắt, đau tai: Ngọn hay cành non mía dò đem nướng, rồi vắt lấy

nước nhỏ chữa đau mắt, đau tai [9], [17], [18], [15], [19], [10]

- Chữa đái buốt, đái dắt, đái nước tiểu vàng, viêm bàng quang, viêm thận: Thân,

rễ mía dò ngày dùng 5-10g dưới dạng nước sắc, cao lỏng hoặc cao mềm Dùng riêng hoặc phối hợp với lá lành ngạnh chữa bí tiểu tiện; với mộc tặc chữa đái đục

[17], [18], [10] Thân, rễ mía dò 20g, sắc uống ngày 1 thang [19] Thân, rễ cây

mía dò 10g, mã đề 20g, râu ngô 20g, cam thảo dây 10g, sắc ngày uống 1 thang

[19]

- Viêm thận, phù thũng cấp: Thân, rễ Mía dò 15g Mía dò, sắc uống ngày 1 thang

[9] Thân, rễ mía dò 20g, củ khúc khắc 20g, dây đau xương 20g sao vàng, rễ cỏ xước 20g, sắc uống ngày 1 thang [19]

- Chữa rắn cắn, sưng tấy, mẩn ngứa và các bệnh ngoài da: Thân cây mía dò giã

nát, băng đắp vào vết rắn cắn hoặc chỗ sưng tấy [9], [17], [19] Eczema, mày

đay, mẩn ngứa: nấu nước Mía dò với lượng vừa đủ để xoa, rửa, tắm [9]

- Chữa cảm sốt, ra mồ hôi: Thân rễ cây mía dò 10-20g, sắc uống ngày 1 thang

[15], [19] Dịch hãm hoặc nước sắc của lá mía dò làm thuốc ra mồ hôi hoặc dùng làm nước tắm cho bệnh nhân sốt cao (Lào, Malaysia) [17]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU:

a Nguyên liệu: Nguyên liệu là thân rễ cây Mía dò được thu hái tại Xã Đại

Phạm, Huyện Đoan Hùng, Tỉnh Phú Thọ tháng 02/2013 Thân rễ rửa sạch, thái lát mỏng, sấy ở nhiệt độ 60°C trong tủ sấy có quạt thông gió đến khô và bảo quản trong túi polyme kín, nơi khô mát tránh ẩm; mẫu tiêu bản cây được PGS.TS

Vũ Xuân Phương, Viện tài nguyên sinh thái, viện hàn lâm khoa học Việt Nam

xác định tên khoa học là Costus speciosus (Koenig) Smith, họ Mía dò

˗ Ethanol, Javen, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin,…

˗ Các dung môi: Methanol, ethanol, chloroform, n-hexan, cyclohexan, nước cất, ethylacetat, toluene, aceton, acid formic,…

˗ Thuốc thử: FeCl3 5%, Diazoni, Lugol, H2SO4 10%, Dragendorff, Mayer, Bourchadat, Gelatin 1% ,…

˗ Chất chuẩn Diosgenin: Do TS Nguyễn Hoàng Tuấn, Bộ môn Dược liệu, trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp

˗ Cân phân tích PRECISA

˗ Cân kỹ thuật SARTORIUS

˗ Tủ hốt Uni-Lab

˗ Máy siêu âm WiseClean

˗ Máy soi đèn tử ngoại CAMAG

˗ Máy cất quay BUCHI Rotavapor R-200

˗ Bản mỏng sắc ký tráng Silicagel 60 F254 (MERCK-Đức)

˗ Máy ly tâm cao tốc K universal centrifuge

˗ Máy chụp sắc ký TLC VISUALIZER CAMAG, máy chấm CAMAG-Limonat

5, được điều khiển bởi phần mềm winCATS; phần mềm phân tích pic trên sắc ký

đồ VideoScan

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật:

Các nghiên cứu đặc điểm thực vật, vi học theo các tài liệu hướng dẫn của bộ môn thực vật, dược liệu của bộ môn dược liệu [3], [4]

a Mô tả đặc điểm thân rễ mía dò:

Quan sát cây trực tiếp bằng mắt thường và kính lúp dưới ánh sáng thường để

mô tả đặc điểm bên ngoài, thể chất và mặt cắt ngang của dược liệu

b Nghiên cứu đặc điểm vi học:

˗ Vi phẫu thân rễ Mía dò: sử dụng mẫu thân rễ tươi, cắt vi phẫu bằng lưỡi dao

lam Tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép Lên tiêu bản bằng phương pháp giọt ép, quan sát trên kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô

tả phân tích [3], [4]

˗ Soi bột dược liệu: Dược liệu được nghiền mịn, rây Nhận xét cảm quan về màu

sắc, mùi, vị, tính chất của bột Lên tiêu bản bằng nước, quan sát và mô tả dưới kính hiển vi, chụp ảnh đặc điểm bột [3]

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học:

+ Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ mía dò theo các phương pháp hóa thực vật thường quy được ghi trong các tài liệu hóa thực vật [2], [6]

+ Định tính Flavonoid bằng SKLM [6]

+ Nghiên cứu về Diosgenin:

˗ Chiết xuất Diosgenin theo 4 phương pháp tham khảo trong các tài liệu [6], [16], [11], [14]

˗ Định tính Diosgenin của các phương pháp chiết bằng SKLM

˗ Định lượng Diosgenin của các phương pháp chiết bằng phương pháp cân [11]

˗ Kiểm tra Diosgenin sau khi chạy qua cột nhôm oxyd trung tính [5], [22]

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT:

3.1.1 Đặc điểm thân rễ mía dò:

Thân rễ Mía dò không có hình dạng nhất định, cong queo, to, nạc, thường phân nhánh, dài 7-10cm, đường kính 1-5cm Mặt ngoài màu vàng đến vàng nâu, mang nhiều lông nhỏ, có nhiều đốt ngang, ở các đốt có vảy màu vàng nâu Từ thân rễ mọc ra nhiều rễ con Mặt cắt ngang thấy bên trong có màu vàng nhạt, có vân tròn rõ và có nhiều sợi Thể chất mềm (Hình 3.1)

Dược liệu khô có hình gần tròn, cong queo, dày 2–3cm, đường kính 1–5cm Mặt ngoài màu vàng nâu, có vảy, bên trong màu vàng nâu nhạt, có vân tròn và nhiều sợi cứng Thể chất khô, giòn (Hình 3.2)

ruột cấu tạo từ những tế bào hình đa giác gần tròn, xếp sít nhau Các bó libe-gỗ tạo thành vòng sát trụ bì và xếp lộn xộn trong mô mềm vỏ và mô mềm ruột Mỗi

bó libe-gỗ hình tròn hay hình trứng có các mạch gỗ xếp kế nhau tạo thành vòng bao bên ngoài và libe ở phía trong, ở giữa có 1-4 mạch gỗ (Hình 3.3; 3.4)

Hình 3.4 Bó libe-gỗ

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu:

Bột màu vàng, mùi thơm mát, vị chua Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần

là những tế bào hình đa giác, thành dày, có màu vàng nâu (1); mảnh mô mềm là những tế bào hình gần tròn, thành mỏng, chứa nhiều tinh bột (2); hạt tinh bột rất nhiều, chủ yếu có hình thuôn dài rất đặc trưng, số ít có hình tròn, có rốn hoặc không, vân không rõ, thường đứng đơn lẻ (3); tinh thể calci oxalate hình đa giác (4); sợi kết thành từng bó (5); mảnh mạch xoắn và mảnh mạch vạch (6); mảnh mang màu có màu vàng đỏ và màu đỏ nâu (7); lông che chở đa bào (8) (Hình 3.5; 3.6)

Như vậy điểm đặc trưng nhất của bột thân rễ Mía dò đó là: có rất nhiều hạt tinh bột hình thuôn dài, có rốn hoặc không, vân không rõ và thường đứng riêng

lẻ

Gỗ cấp I

Libe cấp I Mạch gỗ

Hình 3.6 Đặc điểm bột thân rễ mía dò

Ghi chú: Mảnh bần (1); mảnh mô mềm (2); hạt tinh bột (3); tinh thể calci oxalate

(4); sợi kết thành từng bó (5); mảnh mạch (6); mảnh mang màu (7); lông che chở

3.2 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC:

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học:

Tiến hành chiết xuất dịch chiết ethanol để định tính Flavonoid và Coumarin :

Cho 5g bột dược liệu vào bình nón (200ml), thêm 30ml ethanol 90%, đun hồi lưu cách thủy 15 phút, lọc nóng; dùng dịch lọc để làm các phản ứng

3.2.1.1 Định tính Flavonoid:

a.Phản ứng Cyanidin:

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ít bột Magie kim loại Nhỏ 3-5 giọt HCl đậm đặc, lắc đều Đun nóng cách thủy thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ → phản ứng dương tính

b.Phản ứng với NaOH:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng Thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên → phản ứng dương tính

 Sơ bộ kết luận: Dược liệu có Flavonoid

3.2.1.2 Định tính Coumarin:

a.Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

c Quan sát hiện tượng huỳnh quang:

Nhỏ 2-3 giọt dịch chiết ethanol lên 1 khoanh giấy lọc, để khô, nhỏ tiếp 2-3 giọt dung dịch NaOH Sấy nhẹ Che 1 phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng 1 miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu …) rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: phần không bị che và phần bị che có huỳnh quang sáng như nhau → phản ứng âm tính

 Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Coumarin

3.2.1.3 Định tính Glycosid tim:

Lấy 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 25%, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h Gạn dịch vào cốc có mỏ, loại tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetat 20%, lọc loại tủa, loại chì acetat dư bằng

dung dịch natri sunfat 30%, để lắng, lọc Dịch lọc chuyển vào bình gạn và lắc với chloroform, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp chloroform, loại nước bằng Na2SO4

khan, lọc Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô Cắn thu được tiến hành làm các phản ứng định tính sau:

a.Phản ứng của khung steroid:

+ Phản ứng Liberman-Burchardat:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydride acetic Lắc đều cho tan hết cắn, nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu vàng, lớp dưới không màu → phản ứng dương tính

b Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh:

+ Phản ứng Baljet:

Pha thuốc thử Baliet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1%

và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, không thấy xuất hiện màu đỏ cam→ phản ứng âm tính

+ Phản ứng Legal:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprusiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều không thấy xuất hiện màu đỏ ở mẫu thử → phản ứng âm tính

c.Phản ứng của phần đường 2,6-desoxy:

+ Phản ứng Keller-Kiliani:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45° Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ → phản ứng dương tính

 Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không có glycoside tim

3.2.1.4 Định tính anthranoid:

a Phản ứng Borntraeger:

Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml dung dịch H2SO4 1N, đun cách thủy 20 phút Lọc nóng vào bình gạn, để nguội, lắc với 5ml ether ethylic Gạn lấy lớp ether ethylic để làm phản ứng

Cho vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: 1ml dịch chiết ether ethylic + 1ml dung dịch NH4OH 10%

Ống 2: 1ml dịch chiết ether ethylic + 1ml dung dịch NaOH 10%

Lắc nhẹ Quan sát thấy lớp nước trong cả 2 ống đều trong suốt → phản ứng

âm tính

b.Vi thăng hoa:

Lấy 1g bột dược liệu vào 1 nắp nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước Sau

đó đậy lên nắp nhôm một phiến kính, trên phiến kính có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5-10 phút Lấy lam kính ra để nguội Quan sát dưới kính hiển vi không thấy các tinh thể hình kim → phản ứng âm tính

 Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid

3.2.1.5 Định tính Alcaloid:

Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc Đậy kín bình 30 phút Cho 15ml chloroform

lắc đều, ngâm 12h Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với dung dịch H2SO4 1N x 2 lần, mỗi lần với 10ml Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 1ml

Ống 1: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Mayer

Ống 2: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff

Ống 3: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat

Quan sát thấy cả 3 ống đều không xuất hiện tủa → phản ứng âm tính

 Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không chứa alcaloid

3.2.1.6 Định tính saponin:

a.Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 10ml nước Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt Thấy cột bọt bền vững sau 15 phút → phản ứng dương tính

b.Phản ứng phân biệt sơ bộ 2 loại Saponin:

Cho vào ống nghiệm lớn 0,5g bột dược liệu, thêm 10ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các thí nghiệm sau:

Ống 1 : cho 5ml dung dịch NaOH 0,1 N + 5 giọt dịch lọc trên

Ống 2: Cho 5ml dung dịch HCl 0,1 N + 5 giọt dịch lọc trên

Lắc đều 2 ống nghiệm trong 1 phút Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ống

chiều cao 16cm, đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, , 10ml dịch chiết, thêm nước cất vào các ống cho đủ mỗi ống 10ml Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt

Kết quả: cột bọt trong ống số 8 có chiều cao 1cm

Chỉ số bọt của thân rễ Mía dò là:

Lấy dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml

Ống 1: thêm 2 -3 giọt dung dịch FeCl3 5%, không thấy xuất hiện tủa xanh đen

 Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò có chứa đường khử

3.2.1.9 Định tính polysaccharid:

Cho 4ml dịch chiết nước vào ống nghiệm to (ống số 1), thêm 5 giọt thuốc thử Lugol, dùng ngón cái bịt đầu ống nghiệm, lắc nhẹ nhàng cho thuốc thử được trộn đều Tiến hành đồng thời với một ống chứng (ống số 2) gồm 4ml nước cất có thêm 5 giọt thuốc thử Lugol

Kết quả: ống số 1 có màu tím đen, đậm hơn ống 2 → phản ứng dương tính

 Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò có chứa polysaccharid

3.2.1.10 Định tính acid amin:

Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút, không thấy dung dịch xuất hiện màu tím → phản ứng âm tính

 Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không chứa acid amin

3.2.1.11 Định tính acid hữu cơ:

Cho 2ml dịch lọc vào 1 ống nghiệm, thêm vào một ít tinh thể Na2CO3 Thấy có bọt khí bay lên → phản ứng dương tính

 Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò có chứa acid hữu cơ

Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định tính steroid, chất béo, carotene như sau: Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón

(50ml), đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm Lọc dịch chiết qua bông, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:

3.2.1.12 Định tính chất béo:

Nhỏ 1 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi không thấy để lại vết mờ → phản ứng âm tính

3.2.1.13 Định tính caroten:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, đun cách thủy đến cắn, thêm 2 giọt

H2SO4 đặc không thấy xuất hiện màu xanh → phản ứng âm tính

 Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò không chứa caroten

3.2.1.14 Định tính steroid:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, bốc hơi dung môi đến khô, thêm 1ml anhydride acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm từ từ từng giọt dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Quan sát thấy ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ, lớp chất lỏng trên có màu xanh nhạt → phản ứng dương tính

 Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò có chứa steroid

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ được tóm tắt ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ mía dò

quả Kết luận

1 Flavonoid

Phản ứng Cyanidin Phản ứng với NaOH Phản ứng với FeCl3 5%

Phản ứng với thuốc thử Diazo

Vi thăng hoa

-

- ++

-

Không có

3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt

Phản ứng phân biệt sơ bộ 2 saponin

+++

+++

Có Saponin

Chỉ số bọt 125 Steroid

4 Alcaloid

Phản ứng với TT Mayer Phản ứng với TT Dragendorff Phản ứng với TT Bouchardat

Phản ứng Baljet Phản ứng Keller-Kiliani

+

-

- +

Không có

9 Caroten Phản ứng với dd H2SO4 đặc - Không có

11 Đường khử Phản ứng với Fehling A và Fehling B ++ Có

12 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có

13 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% - Có

14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol +++ Có

Ghi chú: (-) phản ứng âm tính

(+) phản ứng dương tính

(++) phản ứng dương tính rõ

(+++) phản ứng dương tính rất rõ