Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây thổ hoàng liên thalictrum foliolosum DC

Với nhiều tác dụng của Berberin, các nguồn dược liệu chứa Berberin đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học cổ truyền và y học hiện đại.. Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước

N HÓA HỌC CỦA CÂY TH

HOÀNG LIÊN -THALICTRUM

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS Hoàng Quỳnh Hoa, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và

tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này Người không ngại vất vả giúp tôi vượt qua những ngày khó khăn nhất để tôi trưởng thành hơn Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:

- PGS TS Trần Văn Ơn, PGS TS Nguyễn Thu Hằng, ThS Nghiêm Đức Trọng,

ThS Nguyễn Hương Giang, DS Chu Thị Thoa và tập thể giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

- DS Nguyễn Thị Thùy Linh, DS Phạm Thị Linh Giang, DS Tạ Khắc Công,

DS Vũ Lê Thu và các anh chị đã tham gia nghiên cứu và làm khóa luận tại bộ môn, đã giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại

bộ môn

- Các bộ môn Dược Cổ Truyền Dược liệu Hóa sinh, Hóa phân tích, Hóa vô cơ,

Bào chế… đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài

- Các bạn Bùi Thanh Loan, Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Lương Thị Lan, Nguyễn

Đoàn Thoan, Nguyễn Thanh Tùng đã chia sẻ cùng tôi những lúc khó khăn

- Bạn Lê Tùng Sơn đã luôn góp ý giúp tôi hoàn thiện mình hơn

- Các bạn khóa 65 và khoá 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài tại bộ môn đã

động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn

- Em Nguyễn Đình Tuấn luôn nhắc nhở và cổ vũ tôi

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân, anh chị, bạn bè thân của tôi vẫn luôn bên tôi, hỏi thăm quan quan tâm tôi

Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua để tôi có được ngày hôm nay

Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Lương

Dd Dung dịch

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy

DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Tên bảng Trang

1 Bảng 2.1 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn 18

5 Bảng 3.4 Nồng độ Berberin chuẩn và diện tích pic đáp ứng 33

6 Bảng 3.5 Giá trị Rf và diện tích pic của các vết 34

7 Bảng 3.6 Kết quả bán định lượng Berberin bằng HPTLC 35

STT Hình Tên hình Trang

1 Hình 2.1 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC 12

2 Hình 2.2 Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất bằng phản

6 Hình 3.4 Các hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid với

các hệ dung môi khác nhau ở bước sóng 366 nm 27

7 Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid toàn phần

12 Hình 3.10 Kết quả chồng pic của mẫu trắng (1), mẫu thử

13 Hình 3.11 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33

14 Hình 4.1

Hình ảnh Thalictrum foliolosum DC (A; C; E)

và Thalictrum ichangensis Lecoyer ex Oliv (B;

D; C)

36

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 VỀ THỰC VẬT 2

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Thalictrum L 2

1.1.2 Loài Thalictrum foliolosum DC 3

1.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

1.3 BỘ PHẬN DÙNG 5

1.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 5

1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn – kháng viêm 5

1.4.2 Tác dụng hạ nhiệt 6

1.4.3 Độc tính cấp 6

1.5 CÔNG DỤNG 6

1.6 VÀI NÉT VỀ BERBERIN 6

1.6.1 Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin 6

1.6.2 Tác dụng sinh học của berberin 7

1.6.3 Chỉ định của berberin 8

1.6.4 Chống chị định 8

1.6.5 Dạng thuốc và hàm lượng 8

1.6.6 Định lượng Berberin 8

1.7 ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU 9

1.7.1 Định tính 9

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Hóa chất 12

2.1.3 Máy móc và dụng cụ nghiên cứu 12

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 21

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 21

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 22

3.1.3 Đặc điểm bột Thổ hoàng liên 23

3.2 ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 24

3.2.1 Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học 24

3.2.2 Định tính Berberin và Palmatin bắng sắc ký lớp mỏng 26

3.3 BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC 28

3.3.1 Chiết alcaloid toàn phần: 28

3.3.2 Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ berberin chuẩn 28

3.3.3 Khảo sát lựa chọn độ pha loãng cho dung dich thử 31

3.3.4 Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC 31

3.3.5 Thẩm định phương pháp bán định lượng 31

3.3.6 Kết quả bán định lượng Berberin bằng phương pháp HPTLC 34

BÀN LUẬN 36

4.1 VỀ THỰC VẬT 36

4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 37

4.3 VỀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BĂNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC 37KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay,Berberin được biết đến là một alcaloid có nhiều tác dụng chữa bệnh như: Bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy, viêm dạ dày ruột),tiểu đường, bệnh tim mạch (tăng lipid máu, hạ huyết áp), các tình trạng viêm, điều trị ung thư ,[24],[25],[29],[31], [36].Các tác dụng này đã được nghiên cứu, chứng minh và được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng

Berberin được tìm thấy trong 150 loài thuộc 23 chi và 7 họ thực vật khác nhau

Ở Việt Nam, các họ thường chứa berberin làhọ Hoàng liên (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Ruta-ceae)[17], họ Thuốc phiện (Papaveracae)[8] Với nhiều tác dụng của Berberin, các nguồn dược liệu chứa Berberin đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học

cổ truyền và y học hiện đại

Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum DC thuộc họ Hoàng liên-

Ranuncula-ceae được xếp vào diện những cây thuốc quý hiếm có hàm lượng berberin cao[1].Do nạn phá rừng làm nương rẫy và thường xuyên bị khai thác quá mức làm thuốc nên hiện nayThổ hoàng liên đã được xếp vào diện những cây thuốc có nguy cơ bị tuyệt chủng.Những nghiên cứu về Thổ hoàng liên chỉ tập trung chủ yếu vào bảo tồn và nhân giống[16]

Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước về đa dạng di truyền các dược liệu chứa

Berberin ở Việt Nam, đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học

của cây Thổ hoàng liên - Thalictrum foliolosum DC.”thu hái tại Sơn Lađược thực

hiện với 3 mục tiêu:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vậtvà giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2 Định tính thành phần alcaloid chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

3 Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liênThalictrum foliolosum bằng

phương pháp HPTLC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VỀ THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi ThalictrumL

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Theo một số tài liệu phân loại, chi Thalictrum được xếp vào vị trí phân loại như

sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngoc Lan (Magoliopsida)

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Bộ Hoàng liên (Ranuculales)

Họ Hoàng liên (Ranuculaceae)

Chi Thailictrum L.[5],[37]

Thalictrum L là một chi lớn, gồm khoảng 200 loài, phân bố ở vùng ôn đới Bắc

bán cầu, một số phân bố ở Nam Mỹ, Nam Phi hoặc vùng nhiệt đới núi cao châu Á Ở Trung Quốc có 70 loài, Đài Loan 6 loài, Ấn Độ gần 50 loài Riêng Việt Nam, theo các

tài liệu ghi nhận có 2 loài, đó là T foliosum DC và T ichangense Lecoy ex

Oliv.[9],[14],[22],[37]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Thalictrum L

Cây cỏ sống nhiều năm Thân rễ hoá gỗ có thịt màu vàng hoặc rễ củ Lá mọc ở gốc hoặc trên cành, lá có cuống hoặc không cuống, lá mọc ở thân thường so le,lá kép hình lông chim, ít khi lá đơn, lá chét hình tim, hình trứng hoặc hình mác, mép nguyên hoặc khía răng Cụm hoa ở đầu cành hay nách lá, cụm hoa xim hoặc chùm, nhiều hoa nhỏ,lá bắc 2, 3 hoặc 6 – 9 Hoa thường lưỡng tính Đài 4 – 10, màu xanh vàng hoặc tím, hình mác hoặc hình thìa, không tồn tại cùng quả; không có tràng; bộ nhị nhiều; bộ nhuỵ gồm 4 – 6 hoặc nhiều lá noãn, 1 noãn Quả đóng [5], [37]

1.1.2 Loài Thalictrum foliolosum DC

1.1.2.1 Khóa phân loại xác định loài Thalictrum foliolosum DC theo Thực vật chí Trung Quốc

Thực vật chí Trung Quốc đã xác định Thalictrumfoliosum DC dựa trên khoá

như sau [37]:

1.b Lá kép lông chim hoặc chụm 3 (gân)

2.b Hoa luôn luôn lưỡng tính, không bao giờ đơn tính,núm nhụy không bao

giờ hình roi, hiếm khi dài hơn bầu nhụy

3.b Lá chét hình trứng, dạng trứng ngược, hoặc hình cầu, thường có dạng thùy 4.b Lá chét không hình khiên, cuống nhỏ đính vào gốc

5.b Hoa từ lác đác đến nhiều, cuối cụm hoa

6.b Cụm hoa xim, luôn có lá trên thân cây

7.b Cây nhẵn nhụi

30.b Lá thường có hoặc khuyết, lá trên thân kép hình lông chim 2-4; cụm hoa

từ ít đến nhiều hoa; đài hoa hồng, xanh hoặc trắng

31.b Vòi nhụy thẳng đứng, không có túi, đầu nhụy dễ thấy hoặc hiếm khi

không thấy

46.b Đầu nhụy dày hơn vói nhụy, thường có cánh

48.b Lá trên thân ở xa trung tâm không có chồi ở nách

49.b Chỉ nhị dài nhọn hoặc chỉ hơi mở rộng ở biên

65.b Đầu nhụy có cánh

69.b Lá chét có dạng thùy hoặc mép lá có răng cưa

70.b Đầu nhụy không thon dài, có cánh rộng

71.b Lá chét dài hơn 6mm

72.b Cụm hoa không trải rộng, tụ lại; đỉnh bao phấn nhọn

73.b Cụm hoa chùy giống cành hoa; quả đóng nhỏ hơn 4mm

74.b Lá trên thân và nhánh cụm hoa trải rộng

75.b Đầu nhụy gần có cánh, dài nhọn hoặc gần tam giác

78.b Gân xa trục ở lá chét vươn lên, chỉ nhị hình sợi tơ

79.b Quả đóng không cuống, thân hơi bị lén; lá chét xa trục không vụn khi khô

T foliolosum

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật loài Thalictrum foliosumDC

Cây thảo sống nhiều năm, cao 50 – 150cm, phân nhánh ở phần trên, không lông[4],[10].Thân hình trụ, có đốt, nhẵn[1]

Rễ dài 3 – 15 cm, đường kính 0,1 – 0,4 cm, mặt ngoài màu nâu nhạt, có các nếp nhăn dọc, cong queo, có nhiều đốt khúc khuỷu, xung quanh thân rễ có nhiều rễ non, rễ chùm nhiều, cứng [1],[6],[15]

Lá 3 lần kép, cuống chung dài 15cm, lá chét bậc ba dài 1– 2,5cm, rộng 0,5 – 1,5cm, không lông, mép trên có răng to[10].Lá kép 3 lần lông chim, dài 28 cm, cuống chung dài 10 – 20cm, có bẹ Lá chét mỏng, gần hình tròn hoặc hình trứng, mép khía tai bèo, kích thước 1 – 1,5 x 0,5 – 1,2 cm[1],[4]

Cụm hoa là chuỳ rộng, phân nhánh nhiều, nụ to 6 – 7mm; lá đài màu trắng và thường là vàng nhạt hoặc có sọc tía, hình bầu dục, dài 3 – 4,5mm; nhị nhiều, dài 6 – 7mm Lá noãn 4 – 6[1],[4]

Quả đóng nhỏ, hình thoi, hơi dẹp, dài 3mm, có mỏ, thuôn, nhọn 2 đầu có các đường vân dọc theo sườn rõ[4],[10]

1.1.2.3 Phân bố

Trên thế giới, Thalictrumfoliosum DC xuất hiện ở Afghanistan [1], Ấn Độ,

Nêpan, Trung Quốc[1],[4] Ở Trung quốc, loài này gặp ở các khu vực Tứ Xuyên, Tây Tạng và Vân Nam với độ cao 1500 – 3200 m[4]

Trong nước, loài Thalictrumfoliosum DC được phân bố ở Lai Châu (Phong

Thổ, Sìn Hồ), Điện Biên (Tủa Chùa), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn), Vĩnh Phúc, Sơn la[4],[15],[22]

1.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Các nghiên cứu đều cho thấy thành phần chính trong thân rễThổ hoàng liên làBerberin, palmatin, atrorrhizin và thalictrin[1],[4],[10],[15]

Dược điển Việt Nam có quy định dược liệu Thổ hoàng liên (Thalictrum

foliolosum DC.) phải chứa ít nhất 1% berberin (tính theo dược liệu khô kiệt)[6]

Theo S.K Chattopadhyay và cộng sự, từ Thalictrum foliolosum DC đã phân lập

được mười một alcaloid bao gồm là protoberberin thalifendin, palmatin, berberin, lumbamin, jatrorrhizin, thalidastin, dehydrodiscretamin, benzylisoquinolines rugosion, tem–betarine, aporphin xanthoplanin và magnoflorin[34]

co-Theo Harish C.Andolavà cộng sự, các hợp chất đã được tìm thấy ở Thalictrum

foliolosum là N,O,O – trimethylsparsiflorin, 1 hợp chất alcaloid aporphin mới,

thalicarpin bậc 3, thailidasin, thalrugosidin, reticulin, alcaloid magnoflorine bậc 4, berberinvà palmatin[33]

Theo từ điển cây thuốc Ấn Độ có hơn 60 hợp chất isoquinoline và diterpenoid alkaloid đã được phân lậptừ cây Thổ hoàng liên [28]

1.3 BỘ PHẬN DÙNG

Rễ và thân rễ thường thu hái vào các tháng 6, 7, 8 là tốt nhất Vào mùa đông cây lụi đi, khí hậu lại rét nên khó tìm thấy Thân rễ đào được lúc trời khô ráo rữa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con và gốc thân rồi phơi hay sấy khô [10], [15],[16]

1.4.TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

1.4.1.Tác dụng kháng khuẩn – kháng viêm

Cao khô chiết từ rễ Thổ hoàng liên bằng methanol được thử tác dụng kháng

khuẩn với các chủng vi khuẩn thử là Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Streptococcus faecalis.Kết quả

cho thấy: Cao thuốc liều 3000µg có tác dụng tương tự gentamycin 10 μg ; tác dụng

kém hơn Neomycin30 μg trên K pneumoniae và S faecalis, nhưng lại tác dụng mạnh

hơn Neomycin 30 μgtrên 3 vi khuẩn còn lại.Liều 2000 μg có tác dụng kém Liều 1000

μg gần như không có tác dụng Các nồng độ trên không có tác dụng trên nấm[16]

Dịch chiết Thalictrum foliolosumDC trong methanol, chloroform, hexane thu

thập từ Nainital, Kumaun Himalaya, Ấn Độ được thử hoạt tính kháng khuẩn với năm

vi khuẩn gây bệnh (vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Bacillussubtilis, Erwinia

chrysanthemi, Escherichia coli và Xanthomonas phaseoli) bằng cách sử dụng phương

pháp đĩa thạch khuếch tán Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và hexane có hoạt tính cao nhất với tất cả các tác nhân gây bệnh được thử nghiệm tiếp theo là dịch chiết

chloroform Dịch chiết nước hầu như không có tác dụng ức chế trên các vi khuẩn thử nghiệm[35]

1.4.2 Tác dụng hạ nhiệt

Dịch nước của thân rễ Thalictrum foliolosumđược thử tác dụng hạ nhiệt ở

chuột bạch đã được gây sốt với liều lượng 300, 400, và 500 mg / Kg và được so sánh với thuốc Paracetamol chuẩn(150mg / kg ) Kết quả các dịch chiết nước của thân rễ cho thấy khả năng hạ nhiệt đáng kể sau 2 giờ với liều 300 & 400 mg / Kg cơ thể trong khi liều lượng 500mg / kg đã có hiệu quả trong vòng một giờ so với Paracetamol[15],[26]

Thổ hoàng liên thường dùng để chữa lỵ, giải nhiệt, đổ máu cam, mất ngủ(Viện

dược liệu) Dùng ngoài để chữa đau mắtvà mụn nhọt [10], trị đau mắt nhặm, viêm ruột

, tiêu chảy, viêm gan, vàng da, tim nhiệt, phổi nhiệt sốt cao [15]

Ở Trung Quốc Thổ hoàng liên được dùng để trị sởi đậu khó mọc[10]

Ở Ấn Độ rễ dùng chữa chứng khó tiêu do mất trương lực cơ và giúp khôi phục sau những cơn đau cấp tính và dùng đắp trị đau mắt[10]

1.6 VÀI NÉT VỀ BERBERIN

1.6.1 Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin

Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin (5,6 dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno (5,6-a) anthracen)

dihydro-8,9-Công thức phân tử C20H18NO4Cl 2H2O P.t.l: 407,9

Berberin được phát hiện trong 150 lo

thuộc 23 chi và 7 họ.Trong đó

Hoàng Liên Gai (Berberidaceae

họ Thuốc phiện (Papaveracae)

đường, chống viêm, chống oxy

ợc phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ thực vật kh.Trong đó Việt Nam các họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), hBerberidaceae), họ Tiết Dê (Menispermaceae), h

(Papaveracae) chứa berberin[8], [17]

ờng có lẫn tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin

ộ tan của một số muối Berberin (Hồ Đắc Trinh - 1983)

Độ tan Stt Muối

1 : 2130 5 Br acetat 1: 500 6 Br sulfat

t rét, kí sinh trùng đường ruột)

có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng

bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột[30ụng chống ung thư, hạ glucose máu, chống trầm cảmống oxy hóa[29],[31],[36]

Berberin

ộc nhiều họ thực vật khác nhau Hoàng Liên (Ranunculaceae), họ

ê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae),

caloid khác như: palmatin, jatrorrhizin[7]

Độ tan

1 : 20

1 : 30

1 : 100

shigella, tụ cầu và liên cầu

m men, ký sinh trùng gây bệnh (ký

t khi dùng không ảnh 30],[23]

ạ glucose máu, chống trầm cảm, đái tháo

1.6.3 Chỉ định của berberin

Berberin thường được dùng trong các bệnh hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt rét, mụn nhọt.Ngoài ra, berberin còn được dùng để điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,

gió, lạnh, bụi, khói…), điều trị các bệnh đường sinh dục gây ra bởi Leishmania,

Trichomonas

1.6.4 Chống chị định

Berberin gây ra co bóp tử cung nên chống chỉ định cho phụ nữ có thai

Người dị ứng với berberin (rất hiếm gặp)

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ thuật SKLM Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động : Máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3,4) và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [38]

Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là

 Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

 Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

 Thời gian triển khai ngắn hơn

 Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi

Với những ưu điểm trên HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định

So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn) Nếu trên cả 3 sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình dạng vết, về màu sắc vết trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng nhất [2]

Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng) Sau đó so sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ

lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [2]

Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định, trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là không đổi

về số vết, về trị số Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối

giữa các vết… Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu[2]

Theo kết quả thống kê trong tài liệu, SKLM là một trong các tiêu chuẩn định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Dược điển thảo dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873 chuyên luận

và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168 Hình ảnh sắc ký đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu Ứng dụng này giúp xây dựng “dấu vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn,

giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu

Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như: nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi trường [11] Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển Năm 2010, nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0% Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7%[27] Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012, Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và rễ của 1 số cây loài

Berberis bằng phương pháp HPTLC Kết quả hàm lượng berberin trong mẫu rễ là

3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [13]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thân rễ Thổ hoàng liên thu hái tại xã Co Mạ, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào thời gian 11/04/2012

Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu được làm tiêu bản cây khô và lưu tại phòng tiêu bản, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã số tiêu bản là: HNIP/18125/15

Mẫu nghiên cứu về hoá học được phơi khô, sấy ở 55oC – 60oC cho tới khi đạt hàm ẩm ≤ 8%, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát

2.1.3 Máy móc và dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy Linomat 5,

ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan

Hình 2.1 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC

- Tủ sấy WiseVen ® WOF

- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60

- Cân phân tích Shimadzu (AY220)

- Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T

- Kính lúp soi nổi màn hình Nikon ECLIPSE

- Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 (Merk) dành cho HPTLC và TLC

- Bình chiết hồi lưu

- Bình triển khai sắc ký

- Nồi đun cách thủy

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 50,100 và 200 ml; bình định mức 5, 10, 25, 50,100 ml; pipet 1, 2, 5, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu

 Làm vi phẫu rễ, quan sát, mô tả đặc điểm qua kính hiển vi màn hình

 Làm tiêu bản giọt ép soi bột và xác định đặc điểm bột dược liệu qua kính hiển

 Chiết xuất alcaloid toàn phần trong dược liệu

 Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ chuẩn

 Khảo sát lựa chọn nồng độ pha loãng dịch chiết

 Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC

 Thẩm định phương pháp

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái bằng phương pháp mô tả phân tích [18]

 Làm tiêu bản vi học bằng phương pháp cắt, tẩy nhuộm kép tiêu bản [18]

 Làm tiêu bản giọt ép soi bột rễ để phân tích đặc điểm bột dược liệu

 Các mẫu được chụp ảnh trên kính hiển vi gắn kết camera Nikon DS Fi2

2.2.2.2 Định tính thành phần hóa học

 Định tính bằng phản ứng hóa học

Định tính bằng phản ứng hóa học theo tài liệu Dược liệu học[3]

 Chuẩn bị dược liệu:

Rễ sấy khô ở 600C đến độ ẩm ≤ 8 %, nghiền nhỏ thành bột bằng máy xay

 Dụng cụ hóa chất

 Dược liệu khô: khoảng 50 g

 Dung môi: Ethanol 90% (500ml), ethanol 25% (50ml), chloroform (250ml), ether dầu hỏa (20ml), dd H2SO4 5%, dd H2SO4 1N, dd NH3 6N (20ml)

 Thuốc thử: anhydrit acetic, H2SO4 đặc, bouchardat, dragendoff, mayer, Dd natri acetat, dd FeCl3 5%, formol, HCl đặc, gelatin, chì acetat 10%, Dd NaOH 10%,

dd NH3 đặc, Dd H2SO4 đặc, TT Diazo, TT xanhydrol, acid acetic, bột Mg, nol, acid picric, chì acetat 30%

octa- Dụng cụ: máy xay, bình nón 100ml, 50ml; bình gạn 50ml, 100ml; ống nghiệm lớn, ống nghiệm nhỏ, pipet, giấy lọc, phễu lọc, kính hiển vi, đèn tử ngoại

 Chiết xuất alcaloid

Cân chính xác khoảng 4,0000g bột dược liệu Thêm 50 ml hỗn hợp methanol : acid hydrochlorid (100:1) Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết Thêm 50

ml hỗn hợp dung môi methanol : acid hydrochlorid (100:1) chiết tiếp 2 lần tương tự Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi lần 15 ml, lọc lấy dịch chiết Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn trong methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm[13],[19],[20]

 Tiến hành sắc ký lớp mỏng

 Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng TLC silica gel 60 GF254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 60 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

 Chuẩn bị pha động:

Pha động là 1 số hỗn hợp dung môi sau:

- Hệ I: N-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0) [19]

- Hệ II: Chloroform: methanol (9,0 : 1,0 ) [19]

- Hệ III: Propanol: nước: acid fomic (90,0 : 8,0 : 0,4) [19], [27]

- Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)[19]

- Hệ V: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0) [13]

- Hệ VI: Toluen: ethyacetat: methanol: n-propanol: amoniac (12,0: 6,0 : 3,0 : 3,0 :1,0)

- Hệ VII: Chloroform: butanol (1,0 : 7,0)

- Hệ VIII: Methanol: nước: amoniac (8,0 : 1,0 :1,0) [32]

- Hệ IX: Chloroform: methanol: amoniac (14,0 : 5,0 : 1,0 ) [32]

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: dung dịch Berberin chuẩn 0.08 % và Palmatin chuẩn dùng để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu

Hòa tan chính xác 0,0200 g berberin chlorid chuẩn (83,7 %), palmatin chlorid chuẩn (96,24%) trong methanol, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm methanol vừa

đủ tới vạch, lắc đều, lọc Thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,08%

 Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: là dung dịch alcaloid toàn phần pha loãng 100 lần

 Lựa chọn các điều kiện triển khai sắc kývới 9 hệ dung môi chuẩn bị theo điều

kiện được trình bày ở mục 2.2.2.3

 Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer và sử lý kết quá bằng phần mềm wincat ở bước sóng 366 nm và 254 nm

Kiểm tra số lượng vết tách,đồng thời đánh giá khả năng tách của các hệ dung môi, lựa chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất để tiến hành định tính và bán định lượng

2.2.2.3 Bán định lượng berberin bằng phương pháp HPTLC

 Chiết xuất alcaloid toàn phần

Cân chính xác khoảng 1,0000g bột dược liệu Thêm 50 ml hỗn hợp methanol : acid hydrochlorid (100:1) Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết Thêm 50

ml hỗn hợp dung môi methanol : acid hydrochlorid (100:1) chiết tiếp 2 lần tương tự Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn, hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi lần 15 ml, lọc lấy dịch chiết Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn trong methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc

0,45 µm

 Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ chuẩn Berberin

Pha các dãy dung dịch berberinchuẩncó các giới hạn nồng độ khác nhau như bảng 2.1

Bảng 2.1 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn Nồng độ

Pha loãng thành dãy chuẩn có nồng độ tương tương ứng với từng dãy ở trên

 Khảo sát lựa chọn nồng độ pha loãng dung dich

Từ 50ml dung dịch alcaloid toàn phần thu được, đem pha loãng thành dãy dung dich có độ pha loãng 125; 200; 250; 312,5 và 500 lần

 Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC

 Điều kiện chấm mẫu trên máy Linomat 5

Chất hấp thụ bản mỏng Aluminum silicagel GF254, kích thước 10 x20 cm hoạt hóa ở 110oC trong 60 phút, để nguội về nhiệt độ phòng.Thể tích phun mẫu: 3 µl dung

dịch thử, độ dài vết 6 mm, vị trí chấm cách mép dưới 0,8mm, cách mép 2 bên 1,5mm

 Điều kiện triển khai sắc ký trên máy ADC2

- Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml

- Dung môi khai triển: 10ml

- Thời gian bão hòa dung môi 20 phút

- Thời gian sấy khô bản mỏng 5 phút

- Quãng đường di chuyển của pha động 80 mm

- Hệ dung môi khai triển là hệ được lựa chọn ở mục 2.2.2.2

 Điều kiện quan sát trên máy TLC Visualizer

 Quan sát bản mỏng dưới đèn UV bước sóng 254nm và 366 nm

 Xử lý sơ bộ dữ liệu bằng phần mền VideoScan

 Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010

Hàm lượng Berberin trong mẫu nghiên cứu (tính theo dược liệu khô) được tính theo công thức :

( )/ × 100 Trong đó X% : Hàm lượng Berberin trong mẫu cây

Ct : Nồng độ Berberin trong dung dịch thử (mg/ml)

Mt : Khối lượng dược liệu cân được (mg)

b : Hàm ẩm của bột dược liệu

a : độ pha loãng của dung dịch thử

 Thẩm định phương pháp

 Độ đặc hiệu

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác

định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử[12]

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

1) Mẫu trắng: dung dịch methanol

2) Mẫu thử: dịch chiết methanol

3) Mẫu chuẩn Berberin hòa tan trong methanol

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên Soi

và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 366 nm, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

 Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị

Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn

 Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

 Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5% Độ lệch giá trị

Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [21]

 Khảo sát độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành:Pha mẫu chuẩn Berberin 0,04% g/ml trong methanol.Tiêm 6 lần mẫu

chuẩn và tiến hành sắc ký với điều kiện triển khai HPTLC đã chọn.Ghi diện tích pic thu được Độ ổn định của hệ thống HPTLC được biểu thị bằng sai số tương đối (ε%) của 6 lần tiêm mẫu chuẩn

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic Giá trị RSD của diện tích

(chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n ≥ 5) nên nhỏ hơn 2,0% [21]

 Khảo sát tính tuyến tính

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân

tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử[21]

Tiến hành: Pha 1 dãy dung dich chuẩn Berberin clorid từ 0,02 tới 0,08 g/ml

methanol.Tiêm lần lượt 0,3μl mỗi dung dịch vào bản mỏng và triển khai HPTLC trong điều kiện đã chọn Giá trị diện tích pic thu được tương ứng với nồng độ Berberin.Độ tuyến tính được thể hiện thông qua hệ số tương quan R, xác định bởi phương trình hồi quy của diện tích pic với nống độ

Đánh giá:Giá trị R> 0,90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính

tốt[12] Trên cơ sở đó chọnkhoảng tuyến tính và nồng độ chất chuẩn định lượng

CHƯƠNG 3 TH 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Hình 3.1 Ảnh mẫu nghiên cứu

ươi;3 Ảnh toàn thể; 4 Thân rễ; 5 Thân rễ phân đốt;

ễ có nhiều nếp nhăn; 7 Mặt cắt ngang rễ; 8 Mặt cắt ngang thân

ng lâu năm Cao khoảng 90 cm Lá kép 3 lầ

Thân rễ dài 3 –8 cm , đường kính 0,3 tới 1 cm, cong queo, có nhiều đốt khúc khuỷuto, vết bẻ màu vàng nhạt, không phẳng,xung quanh thân rễ có nhiều rễ con(rễ chùm),cứng Mặt cắt ngang có 3 phần rõ rệt: Phần vỏ màu nâu sẫm, phần gỗ màu vàng, ruột màu xám Rễ dài 3 - 15 cm, đường kính 0,05 - 0,2 cm, mặt ngoài màu nâu nhạt,

có các nếp nhăn dọc Rễ mềm hơn thân rễ và mặt cắt ngang cũng có hai phần rõ rệt, phần ngoài màu vàng nhạt, lõi gỗ phía trong màu vàng đậm Vị rất đắng

Mẫu nghiên cứu được xác định tên khoa học là Thalictrum foliolosum DC., họ

Ranunculaceae (Phụ lục 5)

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu

Hình 3.2 là hình ảnh vi phẫu rễ Thalictrum foliolosum DC Mặt cắt ngang vi

phẫu rễ có thiết diện tròn (1) Quan sát từ ngoài vào trong thấy các đặc điểm sau: Bần gồm 2 –4 lớp tế bào hình chữ nhật có thành dày, hóa bần xếp đều thành các vòng tròn đồng tâm Tầng phát sinh bần –lục bì gồm 1 lớp tế bào thành mỏng xếp ngay dưới bần (2) Mô mềm vỏ tập hợp các tề bào hình tròn hoặc đa giác xếp không khít nhau lộn xộn (2) Libe cấp 2 là tập hợp các tế bào bắt màu hồng, thành mỏng, xếp khít nhau thành xuyên tâm Tập hợp các tế bào nhỏ bắt màu hồng đậm nằm dải rác trong mô mền vỏ và libe cấp 2 (3) Mô mềm ruột là những tế bào hình trứng, đa giác xếp khít nhau trong cùng (4) Tầng phát sinh libe –gỗ là 1 lớp tế bào thành mỏng xếp đều đặn thành vòng tròn, cạnh gỗ bắt màu xanh (5).Gỗ cấp 2 bắt màu xanh, gồm các mạnh gỗ dày, xếp đều đặn thành dãy(6) Tia ruột rất hẹp là đường tế bào thành mỏng từ ruột ra lớp vỏ (3)

Hình 3.2 Vi ph

1 Lát cắt toàn ph

vỏ; 5 Tầng phát sinh libe

3.1.3 Đặc điểm bột Thổ ho

Soi bột rễ Thổ hoàng liên dư

sau: Mảnh bần màu vàng nâu

dày, xếp đều khít nhau Lông đ

Hình 3.2 Vi phẫu rễ Thổ hoàng liên

àn phần rễ Thổ hoàng liên; 2 Bần; 3 Ruột; 4 Mô mềm ỏ; 5 Tầng phát sinh libe –gỗ; 6 Gỗ cấp 2.

ặc điểm bột Thổ hoàng liên

àng liên dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc đ

àu vàng nâu (1) cấu tạo bởi các tế bào hình chữ nhật th

ếp đều khít nhau Lông đơn bào (2) thẳng, thành dày Tinh th

ơn lẻ hay xếp

õ (6) Các hạt Hình 3.3 là hình ảnh

3

4

7 Hình 3.3 :

1 Mảnh bần; 2.Lông đơn bào; 3.M

ơn bào; 3.Mạch xoắn;4 Canxi oxalat;5.Tinh bột;6 Thể ứng;7 Tinh thể; 8.Bó mạch;9.Mảng mang màu

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng phản ứng

hoá học STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết

Luận

1 Tanin Dd chì acetat 10 % +

2 Acid hữu cơ Bột Na2CO3 _ Không

3 Đường khử TT Felling A,B + Có

4 Acid amin TT Ninhydrin 3 % + Có

11 Sterol Liebermann-Burchardt + Có

12 Anthranoid Borntraeger (NH3) _ Không

3.2.2.1 Khảo sát dung môi chạy sắc ký

Tiến hành triển khai bản mỏng trên một số hệ dung môi:

- Hệ I: N-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0)

- Hệ II: Chloroform: methanol (9,0 : 1,0 )

- Hệ III: Propanol: nước: acid fomic (90,0 : 8,0 : 0,4)

- Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)

- Hệ V: Ethylacetat: n-butanol : acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0)

- Hệ VI: Toluen: ethyacetat: methanol: n-propanol: amoniac (12,0: 6,0 : 3,0 : 3,0 :1,0)