3.2.1.Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa họ 5
8 Hình 3.3 : Đặc điểm bột dược liệu
ơn bào; 3.Mạch xoắn;4. Canxi oxalat;5.Tinh bột;6. Thể ứng;7. Tinh thể; 8.Bó mạch;9.Mảng mang màu.
ÀNH PHẦN HÓA HỌC ộ bằng phản ứng hóa học
6
9
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng phản ứng hoá học STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết Luận Dd FeCl3 5 % + Có 1 Tanin Dd chì acetat 10 % + Dd Gelatin 1 % +
2 Acid hữu cơ Bột Na2CO3 _ Không
3 Đường khử TT Felling A,B + Có
4 Acid amin TT Ninhydrin 3 % + Có
P/ư Cyanidin + Có Dd NaOH 10 % + 5 Flavonoid Hơi NH3 + Dd FeCl3 5 % + Diazo + Đóng mở vòng lacton _ Không
6 Coumarin Huỳnh quang _
Vi thăng hoa _
P/ư Diazo +
7 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Có
Liebermann-Burchardt +
Liebermann-Burchardt + Không
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết Luận
Baljet _
Keller – Kiliani +
9 Chất béo Quan sát vết trên giấy lọc _ Không
10 Caroten H2SO4 đậm đặc + Có
11 Sterol Liebermann-Burchardt + Có
12 Anthranoid Borntraeger (NH3) _ Không
Borntraeger (NaOH 10 %) _ TT Mayer + Có 13 Alcaloid TT Bouchardat + TT Dragendoff + Chú thích: TT: Thuốc thử : Dd: dung dịch (+) phản ứng dương tính (–) Phản ứng âm tính
Nhận xét: trong rễ mẫu cây nghiên cứu có chứa các nhóm chất alcaloid, flavo- noid, saponin, acid béo, acid amin, đường khử, sterol, caroten.
3.2.2.Đ nh tính Berberin và Palmatin b ng s c ký l p m ng
3.2.2.1. Khảo sát dung môi chạy sắc ký
Tiến hành triển khai bản mỏng trên một số hệ dung môi: - Hệ I: N-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0) - Hệ II: Chloroform: methanol (9,0 : 1,0 )
- Hệ III: Propanol: nước: acid fomic (90,0 : 8,0 : 0,4)
- Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0) - Hệ V: Ethylacetat: n-butanol : acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hệ VI: Toluen: ethyacetat: methanol: n-propanol: amoniac (12,0: 6,0 : 3,0 : 3,0 :1,0)
- Hệ VII: Chloroform: butanol (1,0 : 7,0)
- Hệ VIII: Methanol: nước: amoniac (8,0 : 1,0 :1,0) - Hệ IX: Chloroform: methanol: amoniac(14,0 : 5,0 : 1,0 )
Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid với môt số hệ dung môikhác nhau ở bước sóng 366 nm
1. Hệ I; 2. Hệ IV; 3. Hệ V
Nhận xét: 3 hệ cho kết quả tách tốt nhất là các hệ I; IV và V. Hệ I: n-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0)
Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0) Hệ V: Ethylacetat: n-butanol : acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0)
Tiến hành chạy trong 3 hệ trên với cùng 1 thời gian, hệ IV cho kết quả ổn định và tốt nhất. Đây là căn cứ để lựa chọn hệ (IV) Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0) làm hệ dung môi khai triển các phần tiếp theo.
3.2.2.2.Kết quả định tính alcaloid rễ Thổ hoàng liên bằng sắc ký lớp mỏng
Triển khai sắc ký lớp mỏng nhận thấy dịch chiết alcaloid to Ethylacetat: N-butanol: acid ace
2 vết có giá trị Rf = 0,51 và Rf =0 0,44).
A
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đ
1. Dịch chiết Thổ ho
Qua kết quả định tính bằng SKLM, nhận thấy hoàng liên có chứa Berberin
3.3.BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BẰNG 3.3.1. Chiết alcaloid toàn
Quy trình tiến hành n
3.3.2. Khảo sát lựa chọn
ắc ký lớp mỏng nhận thấy dịch chiết alcaloid toàn phần butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)tách ra 3 v
51 và Rf =0,44 trùng với Berberin (Rf= 0,51
B
ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid toàn phần với
A. 254 nm; B. 366 nm.
ịch chiết Thổ hoàng liên; 2. Berberin chuẩn; 3. Palmatin chu
ết quả định tính bằng SKLM, nhận thấy dịch chiết alcaloid toàn ph Berberin và Palmatin.
ỢNG BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP àn phần:
ành như mục 2.2.2.3.
ọn dãy nồng độberberin chuẩn
ần với hệ dung môi tách ra 3 vết, trong đó có 51) và Palmatin (Rf = ần với hệ IV . Palmatin chuẩn. alcaloid toàn phần Thổ PHƯƠNG PHÁP HPTLC
B ng 3.2. Kho ng n ng đ l a ch n Dãy 1 Nồng độ (mg/ml) 0,1 0,2 0,4 0,8 - - Diện tích pic 97559,3 157726,4 218314,3 297978,2 - - Dãy 2 Nồng độ (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,8 Diện tích pic 89532,45 136451,1 179433,8 198087,7 220044,7 271484,9 Dãy 3 Nồng độ (mg/ml) 0,018 0,027 0,036 0,054 0,072 - Diện tích pic 77132,0 105263,5 131261,5 172847,3 214150,6 - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. Đường chuẩn dãy 1
Nồng độ Berberin chuẩn 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 mg/ml. y = 27014x + 91589 R² = 0.953 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Hình 3.7. Đường chuẩn dãy 2
Nồng độ Berberin chuẩn 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;0,8 mg/ml
Hình 3.8. Đường chuẩn dãy 3
Nồng độ Berberin chuẩn 0,018; 0,027; 0,036; 0,054; 0,072 mg/ml.
Nhận xét:Dãy 3 có giá trị R² =0,9957 cao nhất và R > 0,9. Do vậy Chúng tôichọn dãy dung dịch berberin chuẩn có nồng độ 0,018; 0,027; 0,036; 0,054; 0,072 đơn vị (mg/ml). y = 21294x + 10740 R² = 0.964 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 y = 3E+06x + 36556 R² = 0.995 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
3.3.3. Kh o sát l ach n đ pha lo Hình ảnh sắc ký đư Độphaloãng(lần) Diện tích pic ChuẩnBerberin (mg/ml) Diện tích pic Hình 3.9 Kết quả: Dịch chi 312,5 lần và 500 lần nằm trong d mg/ml, với độ pha loãng 125 l lựa chọn độ pha loãng 250 l
3.3.4. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC
Hệ dung môi khai triển:
Ethylacetat: N-butanol: acid ace
Điều kiện chạy HPTLC: Như m
3.3.5Thẩm định phương pháp
n đ pha loãng cho dung d ch th
được trình bày ở (phụ lục 4).
Bảng 3.3. Khảo sát độ pha loãng
500 312.5 250 200
92950,72 141355,9 156283,2 186211,0 0,018 0,027 0,036 0,054 87736,73 117730,1 144213,3 180451,9
Hình 3.9: Đồ thị khảo sát độ pha loãng
ch chiết 1,000 gThổ hoàng liên với độ pha loãng ằm trong dãy chuẩn Berberin 0,018 ; 0,027; 0,036 ãng 125 lần không nằm trong dãy chuẩn đã ch ãng 250 lần để tiến hành dịch chấm định lượng.
ựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC
ệ dung môi khai triển:
anol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)
y HPTLC: Như mục 2.2.2.3. nh phương pháp bán định lượng 200 125 186211,0 243525,1 0,054 0,072 180451,9 224376,1 ãng: 200 lần ;250 lần 0,018 ; 0,027; 0,036; 0,054;0,072 ã chọn. Do đó, đề tài
3.3.5.1. Độ đặc hiệu Triển khai sắc ký tr lần), mẫu chuẩn (0,8 mg/ml) - Sắc ký đồ của m Rf (0,51) với vết Berberin - Sắc ký đồ các m trên sắc ký đồ của mẫu chu
- Pic của mẫu thử v
Hình 3.10. Kết quả chồng pic của
Nhận xét: Kết quả tr chất chuẩn Berberin.
3.3.5.2. Tính tuyến tính:
Triển khai sắc ký với các nồng độ từ diện tích pic tương ứng nh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ển khai sắc ký trên 3 mẫu trắng, mẫu thử (4,000g dược liệu pha lo (0,8 mg/ml) thu được kết quả như sau:
a mẫu thử cho vết Berberincó cùng hình dạ Berberin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương u chuẩn.
ủa mẫu thử và mẫu chuẩn có thông số tương ứng.
ết quả chồng pic của mẫu trắng (1), mẫu thử (2), m (3)
ết quả trên cho thấy phương pháp phân tích có tính đ
tính:
ển khai sắc ký với các nồng độ từ 0,018đến 0,072 mg/ml thu đư ứng như bảng 3.4.
ợc liệu pha loãng 200 ạng, màu sắc, giá trị t tương ứng với vếtBerberin
, mẫu chuẩn
ương pháp phân tích có tính đặc hiệu với
Bảng 3.4. Nồng độ STT Mẫu 1 C1 2 C2 3 C3 4 C4 5 C5 Hệ số t Hình 3.11
ồng độ Berberin chuẩn và diện tích pic đáp ứng
Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic 0,018 77132,0 0,027 105263,5 0,036 131261,5 0,054 172847,3 0,072 214150,6 ệ số tương quan r 0,9978
Hình 3.11. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic ện tích pic đáp ứng ện tích pic 77132,0 105263,5 131261,5 172847,3 214150,6 0,9978 ện tích pic
Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic theo excel : y = 2501800x + 36556
R² = 0,9957 y: diện tích pic.
x: nồng độ chuẩn Berberin
Hệ số tương quan R= 0,9978 (tương ứng với giá trị R2 = 0,9957).
Nhận xét: với giá trị R> 0,90, nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ Berberin và diện tích pic sắc ký.
3.3.5.3. Độ thích hợp của hệ thống
Từ 6 lần tiêm khác nhau mẫu chuẩn Berberin 0,04 mg/ml thu được giá trị Rf và diện tích pic như sau:
Bảng 3.5. Giá trị Rf và diện tích pic của các vết
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 RSD % Diện tích pic 156316,0 162588,0 164483,9 164804,2 158961,7 153776,4 2,88 Chiều cao pic 8183,4 8476,9 8550,2 8716,8 8343,1 7938,7 3,31 Rf 0,515 0,515 0,513 0,512 0,51 0,512 0,38
Nhận xét: Giá trị RSD tính theo diện tích pic> 2 %. RSD tính theo chiều cao pic > 2 % RSD tính theo Rf < 2 %
3.3.6. K t qu bán đ nh l ng Berberin b ng ph ng pháp HPTLC
Từ quy trình đã nghiên cứu, tiến hành bán định lượng Berberin trong thân rễ Thổ hoàng liên (Thailictrum foliolosum DC.) bằng phương pháp HPTLC với dãy dung dich Berberin chuẩn có nồng độ 0,018 ; 0,027 ; 0,036 ; 0,054 ; 0,072 mg/ml. Kết quả hình ảnh triển khai sắc ký được trình bày ở phụ luc 1. Xử lý hình ảnh sắc ký bằng phần mềm VideoScan thu đươc giá trị diện tích pic của các vết nồng độ Berberin trong các mẫu thử và chuẩn (phụ lục 2).
Xây dựng đường chuẩn dựa trên mối liên hệ diện tích pic Berberin và nồng độ bằng phần mềm excel(phụ lục 3).Kết quả hàm lượng Berberin trong các mẫu được trình bày trong bảng 3.6.
y = 2501800x + 36556 R² = 0,9957
Bảng 3.6. Kết quả bán định lượng Berberin bằng HPTLC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Khối lượng Hàm ẩm (%) Nồng độ mg/ml Hàm lượng % Hàm lượng trung bình (%) Lần1 Lần 2 Lần1 Lần 2 1 1,0502 7,5 0,0455 0,0390 1,17 1,00 1,035 2 1,0395 7,5 0,0435 0,0396 1,13 0,96 3 1,1033 7,5 0,0421 0,0366 1,03 0,90 4 1,0272 7,5 0,0382 0,0409 1,01 1,08
Qua bảng trên, nhận thấy hàm lượng berberin trung bình ở mẫu nghiên cứu là 1,035% (tính theo trọng lượng khô tuyệt đối).
BÀN LUẬN 4.1. VỀ THỰC VẬT
Theo Võ Văn Chi, chi Thalictrum ở Việt Nam có hai loài là Thalictrum foliolo- sum DC. và Thalictrum ichangensis Lecoyer ex Oliv. Điểm khác biệt giữa hai loài này là hình thái lá (số lần lá kép, vị trí cuống lá gắn vào gốc phiến lá, kiểu gân) [21].
,
A B
C D
E F
Hình 4.1. Hình ảnh Thalictrum foliolosum DC. (A; C; E) và Thalictrum ichangen- sis Lecoyer ex Oliv. (B; D; C).
So sánh tương đối giữa 2 loài này thì đặc điểm về mật độ rễ của 2 mẫu có sự khác biệt. Loài T. foliosum có thân rễ khoẻ, rễ nhiều và to hơn.
Loài nghiên cứu trong đề tài được thu hái tại Sơn La, do điều kiện thu mẫu chưa thu được hoa nên chưa có phần mô tả đầy đủ về cơ quan sinh sản của mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên, đề tài cũng đã mô tả đặc điểm vi phẫu rễ và đặc điểm vi học bột rễ Thổ hoàng liên, làm cơ sở cho việc tiêu chuẩn hoá dược liệu.
4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4.2.1. Về định tính các nhóm chất chính 4.2.1. Về định tính các nhóm chất chính
Định tính sơ bộ thành phần hóa học rễ cây Thổ hoàng liên Thalictrum foliolo- sumDC. đã xác định được các nhóm chất: tanin, acid hữu cơ, đường khử, acid amin, flavonid; saponin; caroten; alcaloid, trong đó alcaloid là thành phần hóa học chủ yếu với các phản ứng hiện lên rất rõ.
4.2.2. Về định tính alcaloid
Định tính dịch chiết alcaloid toàn phần rễ Thổ hoàng liên bằng sắc ký lớp mỏng với chất chuẩn là Berberin và Palmatin.Qua sắc ký lớp mỏng nhận thấy dịch alcaloid toàn phần được tách ra 3 vết có màu vàng tách rõ rệt ở bước sóng 366 nm với giá trị Rf tương ứng là 0,44; 0,51 và 0,62; trong đó có 2 vết trùng với Berberin (Rf= 0,51) và Palmatin (Rf = 0,44).
Hình ảnh sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của dịch chiết alcaloid với hệ dung môi Ethylacetat: N-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0) là cơ sở để xây dựng dấu vân tay dược liệu.
4.3. VỀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BĂNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC
Theo Nguyễn Thị Phương Thảo (2002),chiết bằng dung môi MeOH: HCl (100:1) theo phương pháp hồi lưu cách thủy có khả năng chiết alcaloid tốt nhất so với các dung môi như methanol và ethanol 95 % [12]. Luận văn cũng khảo sát và cho kết quả số lần chiết là 3 lần, thời gian mỗi lần 30 phút là tối ưu nhất. Đề tài đã tiến hành chiết alcaloid bằng dung môi MeOH: HCl (100:1), 3 lần mỗi lần 30 phút bằng phương pháp hồi lưu cách thủy.
Bán định lượng berberin bằng HPTLC là một phương pháp sử dụng hình ảnh sắc ký đồ để định lượng dựa trên cường độ màu của vết sắc ký. Với các vết hiện màu rõ và bản sắc ký đồ tách tốt thì đây là phương pháp được thực hiện khá đơn giản với
độ chính xác cao. Ưu điểm của phương pháp là tiến hành được trên số lượng mẫu lớn, thời gian thực hiện tương đối nhanh và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm vừa phải, chưa có trang bị HPLC. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là đòi hỏi các điều kiện thực hiện quá trình sắc ký lớp mỏng tốt thì khi đọc kết quả bằng việc quét lại hình ảnh sắc ký đồ mới đáng tin cậy, độ lặp lại của kết quả phân tích cao. Bên cạnh đó, nguyên tắc định lượng chủ yếu dựa trên cường độ màu của vết berberin ở bước sóng 366 nm. Berberin có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 230, 265, 345, 430 nm[20]. Do đó, việc quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ giới hạn ở bước sóng 366nm cũng là hạn chế của phương pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu đã tiến hành sơ bộ thẩm định phương pháp phân tích dựa trên một số tiêu chuẩn. Do không đủ thời gian nên nghiên cứu chưa tiến hành thẩm định độ đúng của phương pháp, độ lặp lại của phương pháp. Với các thử nghiệm đã tiến hành, kết quả cho thấy phương pháp có khả năng phân tích đặc hiệu với chuẩn Berberin, có độ tương quan tốt giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic đáp ứng. Độ lặp lại của hệ thống (RSDdiện tích pic= 2,88 %)khá tương đồng với nghiên cứunghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLCđược tiến hành ở Ấn Độnăm 2010 (RSDtính theo diên tích pic = 2,7 %)[27].
Trong quá trình tiến hành pha chuẩn thực tế cân được 21,6 mg Berberin chuẩn (83,7 %) khác với 0,0200g Berberin chuẩn dẫn tới kết quả nồng độ chuẩn bị lẻ. Khi sử dụng phần mền VideoScan để sử lý sơ bộ đường chuẩn thì hệ thống bị hạn chế tự động làm tròn các nồng độ dãy chuẩn đến hàng thứ 2 sau dấu phảy nên gây sai số cho đường chuẩn.
Kết quả bán định lượng Berberin trong thân rễ Thổ hoàng liên – Thalictrum fo- liolosum 1,035 % ≥1 % phù hợp với tiêu chuẩn của dược điển Việt Nam IV [6].
Bên cạnh đó, hình ảnh sắc ký đồ trên bản mỏng có thể cung cấp thêm thông tin về định tính dược liệu, góp phần sơ bộ vào phân loại và xác định nhanh các loài.
K T LU N VÀ Đ XU T 1. Kết luận
- Nghiên cứu đã tiến hành mô tả đặc điểm hình thái và đặc điểm giải phẫu, đặc điểm vi học bột của cây Thổ hoàng liên. Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Thalictrum foliosum DC., Menispermaceae.
- Định tính sơ bộ rễ Thổ hoàng liên bằng phản ứng hóa học đã cho thấy trong rễ có các nhóm chất chính như:Alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, acid amin.
- Định tính thành phần alcaloid bằng SKLM với hệ dung môi Ethylacetat: N- butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0) xác định được Berberin và pal- matin là 2 hợp chất chính.
- Thẩm định sơ bộ phương pháp bán định lượng Berberin trong alcaloid toàn phần bằng phương pháp HPTLC. Đề tài xác định được các thông số về dung môi chiết, dung môi triển khai, nồng độ mẫu chuẩn và xác định hàm lượng berberin trong mẫu Thổ hoàng liên thu hái tại Sơn La là 1,035 % (tính theo trọng lượng dược liệu khô tuyệt đối).
2. Đề xuất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiếp tục theo dõi mẫu cây có hoa, quả để hoàn thiện phần mô tả hình thái mẫu nghiên cứu.
- Thẩm định lại độ đúng, độ lặp lại của phương pháp HPTLC ở bước sóng 366 nm với bán định lượng Berberin từ đó có thể định hướng chính xác hàm lượng Berberin.
- Nghiên cứu bán định lượng berberin bằng phương pháp HPTLC ở bước sóng 345 nm.
TÀI LI U THAM KH O Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách Đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa Học Tự