3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học:
Tiến hành chiết xuất dịch chiết ethanol để định tính Flavonoid và Coumarin:
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón (200ml), thêm 30ml ethanol 90%, đun hồi lưu cách thủy 15 phút, lọc nóng; dùng dịch lọc để làm các phản ứng .
3.2.1.1. Định tính Flavonoid:
a.Phản ứng Cyanidin:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ít bột Magie kim loại. Nhỏ 3-5 giọt HCl đậm đặc, lắc đều. Đun nóng cách thủy thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ → phản ứng dương tính .
b.Phản ứng với NaOH:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên → phản ứng dương tính.
c.Phản ứng với FeCl3:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt FeCl3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen → phản ứng dương tính.
d.Phản ứng diazo hóa:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha. Lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút) thấy xuất hiện màu đỏ → phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có Flavonoid.
3.2.1.2. Định tính Coumarin:
a.Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: để nguyên
Đun cả ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát Ống 1: có tủa đục màu vàng đậm
Ống 2: trong
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều quan sát: Ống 1: trong suốt
Ống 2: trong suốt
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, thấy ống 1 vẫn trong suốt. → phản ứng âm tính.
b.Phản ứng diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo, xuất hiện màu đỏ → phản ứng dương tính.
c. Quan sát hiện tượng huỳnh quang:
Nhỏ 2-3 giọt dịch chiết ethanol lên 1 khoanh giấy lọc, để khô, nhỏ tiếp 2-3 giọt dung dịch NaOH. Sấy nhẹ. Che 1 phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng 1 miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu …) rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: phần không bị che và phần bị che có huỳnh quang sáng như nhau → phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Coumarin.
3.2.1.3. Định tính Glycosid tim:
Lấy 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 25%, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h. Gạn dịch vào cốc có mỏ, loại tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetat 20%, lọc loại tủa, loại chì acetat dư bằng
dung dịch natri sunfat 30%, để lắng, lọc. Dịch lọc chuyển vào bình gạn và lắc với chloroform, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp chloroform, loại nước bằng Na2SO4
khan, lọc. Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô. Cắn thu được tiến hành làm các phản ứng định tính sau:
a.Phản ứng của khung steroid:
+ Phản ứng Liberman-Burchardat:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydride acetic. Lắc đều cho tan hết cắn, nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu vàng, lớp dưới không màu → phản ứng dương tính.
b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh:
+ Phản ứng Baljet:
Pha thuốc thử Baliet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90% . Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, không thấy xuất hiện màu đỏ cam→ phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Legal:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprusiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều không thấy xuất hiện màu đỏ ở mẫu thử → phản ứng âm tính.
c.Phản ứng của phần đường 2,6-desoxy:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45°. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ → phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không có glycoside tim.
3.2.1.4. Định tính anthranoid:
a. Phản ứng Borntraeger:
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml dung dịch H2SO4 1N, đun cách thủy 20 phút. Lọc nóng vào bình gạn, để nguội, lắc với 5ml ether ethylic. Gạn lấy lớp ether ethylic để làm phản ứng.
Cho vào 2 ống nghiệm:
Ống 1: 1ml dịch chiết ether ethylic + 1ml dung dịch NH4OH 10%. Ống 2: 1ml dịch chiết ether ethylic + 1ml dung dịch NaOH 10%.
Lắc nhẹ. Quan sát thấy lớp nước trong cả 2 ống đều trong suốt → phản ứng âm tính.
b.Vi thăng hoa:
Lấy 1g bột dược liệu vào 1 nắp nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một phiến kính, trên phiến kính có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5-10 phút. Lấy lam kính ra để nguội. Quan sát dưới kính hiển vi không thấy các tinh thể hình kim → phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid.
3.2.1.5. Định tính Alcaloid:
Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc. Đậy kín bình 30 phút. Cho 15ml chloroform
lắc đều, ngâm 12h. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ với dung dịch H2SO4 1N x 2 lần, mỗi lần với 10ml. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 1ml
Ống 1: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Mayer Ống 2: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Ống 3: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat
Quan sát thấy cả 3 ống đều không xuất hiện tủa → phản ứng âm tính Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không chứa alcaloid.
3.2.1.6. Định tính saponin:
a.Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 10ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt. Thấy cột bọt bền vững sau 15 phút → phản ứng dương tính.
b.Phản ứng phân biệt sơ bộ 2 loại Saponin:
Cho vào ống nghiệm lớn 0,5g bột dược liệu, thêm 10ml ethanol 90%. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các thí nghiệm sau:
Ống 1 : cho 5ml dung dịch NaOH 0,1 N + 5 giọt dịch lọc trên Ống 2: Cho 5ml dung dịch HCl 0,1 N + 5 giọt dịch lọc trên
Lắc đều 2 ống nghiệm trong 1 phút. Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ống 2.
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò chứa Saponin Steroid.
c.Xác định chỉ số bọt:
Cân 1g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250ml đã chứa sẵn nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc nóng. Để nguội, cho dịch lọc và bình định mức có dung tich 100ml, thêm nước cho đủ 100ml. Lấy 10 ống nghiệm to có
chiều cao 16cm, đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3,.., 10ml dịch chiết, thêm nước cất vào các ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt.
Kết quả: cột bọt trong ống số 8 có chiều cao 1cm Chỉ số bọt của thân rễ Mía dò là:
0,08 1 10
= 125
Tiến hành chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tannin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccharide như sau: lấy 10 g bột
dược liệu cho vào bình nón (100ml), thêm 70ml nước cất, đun sôi nhẹ trong 15 phút, lọc nóng. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
3.2.1.7. Định tính tanin:
Lấy dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml.
Ống 1: thêm 2 -3 giọt dung dịch FeCl3 5%, không thấy xuất hiện tủa xanh đen → phản ứng âm tính.
Ống 2: thêm 2-3 giọt gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa bông trắng ở → phản ứng âm tính.
Ống 3: thêm 2-3 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông → phản ứng dương tính
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không chứa tanin.
3.2.1.8. Định tính đường khử:
Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B, đun cách thủy trong vài phút, thấy xuất hiện tủa đỏ gạch → phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò có chứa đường khử.
3.2.1.9. Định tính polysaccharid:
Cho 4ml dịch chiết nước vào ống nghiệm to (ống số 1), thêm 5 giọt thuốc thử Lugol, dùng ngón cái bịt đầu ống nghiệm, lắc nhẹ nhàng cho thuốc thử được trộn đều. Tiến hành đồng thời với một ống chứng (ống số 2) gồm 4ml nước cất có thêm 5 giọt thuốc thử Lugol.
Kết quả: ống số 1 có màu tím đen, đậm hơn ống 2 → phản ứng dương tính. Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò có chứa polysaccharid.
3.2.1.10. Định tính acid amin:
Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút, không thấy dung dịch xuất hiện màu tím → phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Thân rễ Mía dò không chứa acid amin.
3.2.1.11. Định tính acid hữu cơ:
Cho 2ml dịch lọc vào 1 ống nghiệm, thêm vào một ít tinh thể Na2CO3. Thấy có bọt khí bay lên → phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò có chứa acid hữu cơ.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định tính steroid, chất béo, carotene như sau: Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón
(50ml), đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm. Lọc dịch chiết qua bông, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
3.2.1.12. Định tính chất béo:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi không thấy để lại vết mờ → phản ứng âm tính.
3.2.1.13. Định tính caroten:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, đun cách thủy đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc không thấy xuất hiện màu xanh → phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò không chứa caroten.
3.2.1.14. Định tính steroid:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, bốc hơi dung môi đến khô, thêm 1ml anhydride acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm từ từ từng giọt dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát thấy ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ, lớp chất lỏng trên có màu xanh nhạt → phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Trong thân rễ Mía dò có chứa steroid. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ được tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ mía dò.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Flavonoid Phản ứng Cyanidin Phản ứng với NaOH Phản ứng với FeCl3 5% Phản ứng Diazo +++ ++ +++ ++ Có 2 Coumarin Phản ứng mở, đóng vòng lacton Quan sát huỳnh quang
Phản ứng với thuốc thử Diazo Vi thăng hoa - - ++ - Không có
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt
Phản ứng phân biệt sơ bộ 2 saponin
+++ +++
Có Saponin
Chỉ số bọt 125 Steroid 4 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer Phản ứng với TT Dragendorff Phản ứng với TT Bouchardat - - - Không có 5 Glycosid tim Phản ứng Liebermann Phản ứng Legal Phản ứng Baljet Phản ứng Keller-Kiliani + - - + Không có 6 Anthranoid Phản ứng Borntraeger Vi thăng hoa - - Không có 7 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% Phản ứng với dd Gelatin 1% Phản ứng với dd chì acetat 10% - - ++ Không có
8 Chất béo Thử trên giấy - Không có
9 Caroten Phản ứng với dd H2SO4 đặc - Không có
10 Steroid Phản ứng Liebermann ++ Có
11 Đường khử Phản ứng với Fehling A và Fehling B ++ Có 12 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có 13 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% - Có 14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol +++ Có Ghi chú: (-) phản ứng âm tính
(+) phản ứng dương tính (++) phản ứng dương tính rõ (+++) phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính ở trên, sơ bộ kết luận: trong thân rễ Mía
dò có chứa flavonoid, saponin steroid là 2 nhóm chất chính, ngoài ra còn chứa acid hữu cơ, steroid, polysaccharide, đường khử và không có alcaloid, anthranoid, caroten, glycoside tim, coumarin, tannin, chất béo, acid amin .
3.2.2.Định tính Flavonoid toàn phần bằng SKLM:
Qua định tính thấy nhóm flavonoid thể hiện rất rõ; vì vậy chúng tôi đi sâu phân tích bằng SKLM.
a. Chiết xuất: Cân khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón 250ml, thêm 50ml
ethanol 90%. Đun sôi hồi lưu cách thủy trong 15 phút, lọc nóng, bốc hơi dịch lọc, được cặn, thêm 10ml nước, đun nóng cho tan hết, cho vào bình gạn, lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần với 15ml để loại tạp. Dịch chiết nước được lắc với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần với 10ml. Gộp các dịch chiết ethyl acetat lại, cô trên bếp cách thủy đến cặn. (Phụ lục 1.1)
b. Tiến hành SKLM:
- Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (MERCK), hoạt hóa ở 110°C trong 1h.
- Dung dịch thử: Hòa tan cặn thu được trong 2ml Ethanol 90%. - Thể tích chấm mẫu: 3μl.
- Bình sắc ký được bão hòa dung môi, khai triển theo chiều từ dưới lên. - Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát trên một số hệ dung môi sau:
1. Ethylacetat: Acid fomic : Nước (8:1:1) 2. Ethylacetat: Acid fomic : Nước (6:1:1) 3. Chloroform: Methanol ( 9:1)
4. Ether dầu hỏa: Ethyl acetat (1 : 1) 5. Chloroform: Ether dầu hỏa (8: 2)
- Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Kết Quả: Quan sát các vết sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% dưới ánh sáng thường, ánh sáng UV ở 2 bước sóng 254nm, 366nm, nhận thấy hệ (2) cho kết quả tách tốt nhất. Sắc ký đồ và các thông số Rf được thể hiện trong hình 3.7 và phụ lục 2.
- Tại UV 366nm: có 5 vết màu xanh sáng, 3 vết đầu sáng rõ, 2 vết sau sáng mờ. - Tại ánh sáng thường: Có 6 vết trong đó 3 vết màu vàng rõ, 3 vết màu xám nhạt, các vết đều có Rf tương ứng với các vết soi ở bước sóng 366nm.
3.2.3.Nghiên cứu về Diosgenin
Theo một số tài liệu [6], [16], [17], hàm lượng Diosgenin trong mía dò khá cao khoảng 1,3-5%, Diosgenin là nguyên liệu cần thiết để tổng các thuốc dẫn chất steroid và hormone thượng thận. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu sâu hơn về Diosgenin.
3.2.3.1. Chiết xuất theo hướng chiết xuất Diosgenin
Chúng tôi tiến hành khảo sát qua 4 phương pháp chiết
+ Phương pháp 1: Lên men và chiết bằng chloroform
Bước 1. Ủ lên men bột dược liệu trong môi trường lỏng:
Cân chính xác 8g bột dược liệu (đã sấy khô và đo hàm ẩm) cho vào cốc có mỏ 500ml, làm ẩm dược liệu bằng nước 40°C, trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 48h.
Bước 2. Thủy phân bằng acid vô cơ:
Bột dược liệu sau khi đã ủ men, chuyển sang bình cầu nhỏ nối với sinh hàn, thủy phân bằng 100ml HCl 2N. Đun cách thủy sôi trong 5h.
Bước 3. Rửa bột dược liệu để loại acid vô cơ
Lọc trên 2 lớp giấy lọc, rửa bã bằng nước đến phản ứng trung tính. Tải mỏng bột ra đĩa petri, sấy khô ở nhiệt độ 60°C.
Bước 4. Chiết xuất diosgenin bằng dung môi hữu cơ:
Bột dược liệu đã sấy khô được chiết kiệt bằng CHCl3 trong Soxhlet trên nồi