Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 183.222

Môi trường tự nhiên của nước ta tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ vi sinh vật, trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong

LỜI CẢM ƠN

Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, viện hóa học- viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Thị Nguyệt

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.4 Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 3

1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces 4

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 4

1.2.3 Đặc điểm sinh lý 4

1.2.4 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 5

1.3 Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 5

1.3.1 Cải tạo giống vi sinh vật 5

1.3.2 Bảo quản giống vi sinh vật 7

1.4 Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7

1.4.1 Khái niệm lên men 7

1.4.2 Các phương pháp lên men 7

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 9

1.6 Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh 10

1.6.1 Phổ hồng ngoại (IR) 10

1.6.2 Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS) 10

1.6.3 Phổ khối lượng (MS) 11

1.7 Một số nghiên cứu liên quan 11

1.7.1 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ

Streptomyces sp 11

1.7.2 Phương pháp tiếp cận mới để cải thiện năng suất của kháng sinh: sản xuất các chủng gây đột biến kháng kết hợp 12

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Giống xạ khuẩn 13

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 13

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 14

2.1.4 Dụng cụ và hóa chất 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 17

2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống 17

2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh 18

2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 18

2.3 Phương pháp thực nghiệm 18

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng 18

2.3.2 Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 18

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19

2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21

2.3.5 Phương pháp cải tạo và chọn giống 21

2.3.6 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men 23

2.3.8 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24

2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25

2.3.10 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 25

CHƯƠNG III KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 26

3.2 Kết quả sinh tổng hợp của kháng sinh do Streptomyces 183.222 sinh

tổng hợp trên các môi trường khác nhau 26

3.3 Kết quả cải tạo giống 27

3.3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27

3.3.2 Kết quả đột biến 28

3.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30

3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 32

3.6 Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh 33

3.7 Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 34

3.8 Kết quả chạy sắc kí cột 35

3.9 Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh thu được 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN Acid 2'- deoxyribonucleic

s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2

Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 13

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15

Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng 16

Bảng 3.1 Các đặc điểm của Streptomyces 183.222 và Streptomyces cellulosae 26

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định 27

Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 28

Bảng 3.4 Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 29

Bảng 3.5 Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 30

Bảng 3.6 Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men 31

Bảng 3.7 Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt 31

Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh 32

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh 32

Bảng 3.10 Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau 33

Bảng 3.11 Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 34

Bảng 3.12 Kết quả thử các phân đoạn sau chạy cột lần 1 35

Bảng 3.13 Kết quả SKLM với các phân đoạn 2- 16 36

Bảng 3.14 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 37

Bảng 3.15 Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 12 38

Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3………39

Bảng 3.17 Kết quả SKLM các phân đoạn 1-8……….40

PHỤ LỤC

Hình P.1 Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh

Hình P.2 Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 183.222 sau 6 ngày nuôi cấy Hình P.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương

Hình P.6 Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột

Hình P.7 Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces

183.222

Hình P.8 Phổ tử ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222

Hình P.9 Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222

Hình P.10 Phổ khối lượng vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày 28/9/1928, A.Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển

Walter Florey đã cùng hợp tác với ông nghiên cứu sâu hơn phát hiện này và tới năm

1941, họ đã chiết ra được Penicillin từ chủng penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và chính thức đưa nó vào sử dụng trong chiến tranh thế giới lần I giúp hàng ngàn thương binh thoát khỏi cái chết vì những nhiễm khuẩn thông thường Từ đó, kháng sinh tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời.[25] Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi tràn lan và không đúng cách của kháng sinh hiện nay nên tình hình kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng, nhiều kháng sinh đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới có hiệu quả cao, độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là yêu cầu tất yếu trong phát triển y tế

Môi trường tự nhiên của nước ta tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển

đa dạng của hệ vi sinh vật, trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces sản xuất Đồng thời,

chi này còn có nhiều vi sinh vật ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng

hợp các chất khác: chất điều trị ung thư như Streptomyces antibioticus sinh tổng

hợp actinomycin D điều trị ung thư, chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi… Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men tổng

hợp kháng sinh từ Streptomyces 183.222 ” với các mục tiêu sau:

- Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222

- Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế kháng sinh

- Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: ‘Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”

Theo nghĩa rộng hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chỉ được sinh tổng hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha suy tàn) của sinh trưởng VSV [9]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, hay theo phổ tác dụng…trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1.[8], [5]

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Mỗi kháng sinh có đích tác dụng trong các tế bào VSV khác nhau, tuy nhiên có thể khái quát thành 6 nhóm đích tác dụng chính:

- Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, Vancomycin

- Màng tế bào chất: Polyen, Amphotericin,

- Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin

- Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), Macrolid (liên kết t-ADN)

- Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,…

- Trao đổi chất folat: sulfamid,…

Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lục P.1 [9]

1.1.4 Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh

Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn,… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc trưng và trên các môi trường chọn lọc

Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:

- Phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch

- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định

- Phương pháp làm giàu đất

- Phương pháp thêm kháng sinh vào trong môi trường phân lập [4],[8]

1.2.Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong

tự nhiên

Đa số là vi khuẩn Gr (+), có tỷ lệ G+C > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty) Do đó, có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzyme, vitamin, vì vậy, chúng được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động vật.[4], [9],[11]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces

- Khuẩn lạc: khuẩn lạc xạ khuẩn Streptomyces khá đặc biệt, thường có dạng

khô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyển được khuẩn lạc xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu vào trong thạch

- Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,3- 1,0 µm đến 2-3µm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc khuẩn ty rất phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố như: sắc tố tan trong nước, sắc tố tan trong DMHC, đặc biệt có loài tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen

- Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành khuẩn

ty khí sinh Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, )

- Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn Streptomyces Bề

mặt bào tử có thể nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc, với các hình dạng phong phú: hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ…[9],[11]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn

- Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức năng duy

trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Chi Streptomyces thuộc nhóm CW I có chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin

- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10nm Chúng có cấu trúc và chức năng giống vi khuẩn nói chung

- Mesosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của CM và qua đó làm tăng cường hoạt tính enzyme, tăng vận chuyển điện tử…

- Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat, các hạt polysaccarid.[9],[16]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý

Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát triển, chúng phân

giải các hydrocarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, chúng có thể khử nitrat thành nitrit

pH tối thích thường từ 6,8-7,5 Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4

nhóm: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc

tố melanoid.[9]

1.2.4 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu để phân loại, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Gauze, đặc biệt để phân loại Streptomyces có 2 phương pháp phân lọai đang được

sử dụng phổ biến: phân loại ISP và phân loại theo giải trình tự gen

 Phân loại theo ISP

Tại hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X (1970), khóa phân loại do Shirling

& Gottlieb đề xuất đã được sử dụng để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces trong họ Streptomytaceae Khóa phân loại dựa trên các đặc điểm:

- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc khuẩn ty cơ chất, màu sắc khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và hình dạng bào tử

- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng

sử dụng nguồn hydratcarbon [9], [20], [2]

 Phân loại định tên theo giải trình tự gen

Phương pháp phân loại này sử dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc phân tích gen 16S rADN Trình tự nucleotid của gen hầu như không có sự trao đổi giữa các loài, vì vậy phương pháp này có tính chính xác cao và đáng tin cậy hơn [14],[21], [22]

1.3.Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật

1.3.1 Cải tạo giống vi sinh vật

 Mục đích

Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có

hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm các mục đích khác nhau:

- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn

- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn

- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới [8],[9]

 Các phương pháp cải tạo giống

 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên:

Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 20-30% những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp Việc chọn lọc này chỉ để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất [3]

 Đột biến nhân tạo

Các tác nhân gây đột biến mạnh như tia UV, X hay tác nhân hóa học như ethylenimin, dimethylsulfat, nitrosoguanidin, cho tác dụng với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương tính)

Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật

có kích thước nhỏ (0,5 -3,0µm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân Vì vậy, ánh sáng UV được dùng phổ biến trong cải tạo giống Liều lượng chiếu được đặc trưng bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến giới hạn nhất định Thông thường đột biến dương sẽ xuất hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót

từ 0,1-1,0%, còn đột biến âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn

Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng gen, kĩ thuật tách dòng gen, tạo và dung hợp tế bào trần

1.3.2 Bảo quản giống vi sinh vật

 Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không

bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ

 Các phương pháp bảo quản:

- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 20C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

- Làm khô: trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng

- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh

- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp (từ -780C đến -200C)

Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3-6 tháng cấy chuyền [8],[2],[10],[15]

1.4.Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh

1.4.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng

1.4.2 Các phương pháp lên men

Dựa vào thành phần đồng nhất của môi trường có thể chia làm 2 phương pháp:

 Lên men bề mặt

Là quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, đặc, lỏng VSV hấp thu các

chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và không quá sâu (5-10cm)

- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp

- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng trường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động hóa, tốn nhân công

Các phương pháp lên men chìm:

- Lên men mẻ: VSV được nuôi cố định trong bình lên men với thể tích môi trường xác định, ở điều kiện sinh lý tối thích Trong suốt thời gian lên men, không tác động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH Kết thúc quá trình, thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm

- Lên men bán liên tục: là lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát triển tạo ra nồng độ sinh khối cần thiết ta lấy bớt đi dịch lên men rồi bổ sung thêm lượng môi trường mới bằng lượng dịch đã lấy

- Lên men liên tục: là quá trình lên men được bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng vào bình lên men, đồng thời lấy ra khỏi hệ thống cùng lượng thể tích dịch lên men và tế bào cùng sản phẩm trao đổi chất của chúng

- Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng cao hiệu quả

sử dụng bình lên men.[2],[8],[10],[13]

1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Tùy theo đặc tính của loài mà kháng sinh đó được tiết vào môi trường nuôi cấy (penicillin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin ) Vì vậy để thu lấy hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp

để sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và giúp hạ giá thành sản phẩm

 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:

 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

 Phương pháp tạo phức kết tủa

 Phương pháp trao đổi ion

 Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, )

 Chiết xuất

- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ)

- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau

- Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng Kháng sinh nội bào tồn tại trong

tế bào nên tiến hành chiết rắn lỏng

 Tinh chế ( phương pháp sắc ký):

- Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng chất Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện vết cần tách

- Nguyên lý tách: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động, sau đó được đưa lên pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó Các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ

- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf

trong đó: dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết

ddm: Khoảng cách dung môi chạy

Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm

 Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo hành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha động [1],[2],[3],[8],[17]

1.6.Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh

1.6.2 Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)

- Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại

- Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn, liên kết bội, nhân thơm,…hoặc cặp electron tự do không tham gia vào liên

kết của O, N, halogen Vì vậy, dựa vào phổ hấp thụ UV ta có thể xác định các đặc điểm về cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu [3], [7]

1.6.3 Phổ khối lượng (MS)

- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

- Tiến hành:

Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6 mmHg) Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion và trở thành ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2 Loại ion này gọi là ion gốc hay ion phân

tử Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn hơn thì chúng sẽ bị vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc hay các phân tử trung hòa khác nhau Khi tách ion có số khối khác nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng ta vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan xác suất có mặt (cường độ I) và số khối z Đó là phổ khối lượng

- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất.[2],[15], [18]

1.7 Một số nghiên cứu liên quan

1.7.1 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces

Streptomyces sp USF- 4227 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, dịch

lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải bằng MeOH và aceton được gộp lại và bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh chế bằng sắc kí cột silicagel, DM rửa giải là n- hexan(1), n-hexan: ethylacetat= 3:7(2), n-hexan: acetone= 3:7 (3), và acetone(4)

Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn DM (1) và (2) sau đó sắc kí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH-20, DM rửa giải là MeOH, tinh chế phân đoạn DM (1) thu được 10mg bột từ 7,21g MT Tetrapetalone A có IC50 là 190 µm.[23], [24]

các chủng gây đột biến kháng kết hợp

Để cải thiện việc sản xuất các kháng sinh từ Streptomyces coelicolor A3 (2)

người ta gây đột biến kháng thuốc kết hợp Đột biến nâng cao việc sản xuất actinorhodin được phát hiện cao hơn (5-10%) trong số các chủng kháng streptomycin (Strr), gentamicin (Genr), hoặc rifampin (Rifr), phát triển một cách tự nhiên trên đĩa thạch có chứa một trong ba loại thuốc Xây dựng các đột biến gấp

đôi (Str gen và Str rif) bằng cách cho chủng kháng gentamicin hoặc rifampin vào 1

Str đột biến dẫn đến tăng thêm (1,7 -2,5 lần) sản lượng actinorhodin Tương tự như

vậy, đột biến gấp ba (Str gen rif), nghiên cứu đã được tìm thấy có một khả năng lớn

hơn để sản xuất thuốc kháng sinh, tạo ra một đột biến có thể sản xuất cao hơn 48 lần

so với actinorhodin ban đầu Phân tích Str đột biến cho thấy một đột biến điểm xảy

ra trong gen rpsL, mã hóa protein ribosome S12, đột biến rif đã tìm thấy có một điểm đột biến ở gen rpoB, mã hóa tiểu đơn vị β của RNA polymerase Các đột biến

đôi, ba được sắp xếp theo thứ bậc sự gia tăng đáng kể trong sản xuất ActII - ORF4- một protein phiên mã quá trình cụ thể , được xác định bằng phân tích thấm Western Khả năng vượt trội của các đột biến ba đã được chứng minh bằng các phân tích sinh lý trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau Phương pháp mới này có thể làm tăng sản xuất kháng sinh từng bước, đặc biệt hiệu quả cho bước đầu cải thiện việc sản xuất thuốc kháng sinh từ chủng hoang dại Các đột biến kháng kết hợp (đột biến ba) đã chứng minh không có suy giảm đáng kể trong sự phát triển hoặc hình thành bào tử trong điều kiện thử nghiệm [20]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Giống xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.222 đã được

phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh– Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

Vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định

Vi khuẩn Gram dương (+)

Staphyllococus aureus ATCC 1128 S aureus

Vi khuẩn Gram âm (-)

Pseudomonas aeruginosa VM 201 P aeruginosa

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: bảng 2.3

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần NaCl (g) Pepton (g) Cao thịt (g) Thạch (g) Nước (ml) pH

ISP 1: Tripton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0 -7,2

ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose 4,0g; thạch 20,0g; nước

ISP5: L-asparagine 1,0g; Glycerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; thạch 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0-7,4

ISP 9: Các nguồn đường tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A)

Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (Dung dịch B): CuSO4.5H2O 0,64g; FeSO4.7H2O 0,11g; MnCl2.2H2O 0,79g; ZnSO4.7H2O 0,15g; nước cất vđ 1000ml

dung dịch B 1,0g; thạch 15,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 6,8-7,0

đường A vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong môi trường thường là 1%

2.1.4 Dụng cụ và hóa chất

 Các dung môi sử dụng: bảng 2.4

Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi ( 0 C)

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48 Nồi hấp vô trùng Hyrayama model HL 3030

- Tủ sấy Sanyo Clean Bench, tủ lạnh, tủ lạnh sâu

- Tủ ấm Memmert, Binder 30oC – 37oC

- Cân kỹ thuật, cân phân tích

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 LF

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222

- Xác định các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.222

- So sánh các đặc điểm phân loại ISP của một số chủng Streptomyces để xác định tên khoa học của Streptomyces 183.222

2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống

- Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 183.222

- Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G (+) và 1 vi khuẩn G (-)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch chiết

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng

* Mục đích: Bảo quản các chủng giổng thuần khiết đã phân lập, các dạng chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các ngiên cứu tiếp theo

* Tiến hành: Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 -6ml Tiệt trùng ở 1 at/30 phút/120oC rồi đặt nghiêng

cho đông Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzag các bào tử

trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, cất giữ trong tủ lạnh (2- 4oC) Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng

2.3.2 Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP

Chuẩn bị ống giống gốc được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan:

MT xác định: ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 đã được hấp tiệt trùng, đổ vào đĩa

Petri, mỗi MT làm 4 đĩa Cấy zigzag bào tử của Streptomyces 183.222 lên bề mặt

thạch Ủ ở 28oC, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14 và 21 ngày

- Màu của khuẩn ty khí sinh: Quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc có thể có: màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W), trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau

- Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri), thường có các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không thấy ký hiệu là (0)

- Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại cao

+ Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S) Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm (ví dụ: SRA: chuỗi lò

- Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy bào tử trên các môi trường có chứa các nguồn đường khác nhau (các ISP9), đánh giá này ở ngày thứ 12, 14, 16 Nếu các bào tử phát triển mạnh hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP chứa đường glucose (chứng dương) thì ký hiệu là (+), nếu không phát triển mạnh bằng khi nuôi cấy trên MT ISP không có nguồn đường (chứng âm) thì ký hiệu là (-), nếu phát triển không rõ ràng: mạnh hơn chứng âm và kém hơn chứng dương thì ký hiệu

là (±)

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

*Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

*Tiến hành:

- Tạo hỗn dịch vi khuẩn kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường canh thang, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn định có nồng độ 107-108 tế bào/ml, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h

- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường ở 45 – 50oC sau khi đã hấp tiệt trùng với tỷ lệ V giống/V thạch thường = 5/200 Lắc đều để vi khuẩn kiểm định phân tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa

*Các phương pháp thử:

- Phương pháp khối thạch: Đưa các mẫu thử là các khối thạch ( = 6mm) chứa

vi sinh vật cần thử lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định

- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường vi sinh vật kiểm định ( = 6mm), sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng

- Phương pháp khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc (= 6mm) đã sấy khô tẩm dung dịch thử (3 lần), sấy khô ở 45oC, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định

Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24h Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm và được đánh giá theo công thức:

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thực nghiệm làm song song

2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

* Mục đích: tìm môi trường nuôi cấy và bảo quản chủng xạ khuẩn ổn định, giữ được hoạt tính kháng sinh tốt nhất

* Tiến hành: chủng được cấy lên 7 môi trường (MT1 – MT7) trong đĩa Petri,

ủ ở 280C trong 6 ngày, sau đó thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch Tiến hành thử song song trên 3 mẫu, chọn môi trường có HTKS mạnh nhất

để tiến hành nuôi cấy và nghiên cứu tiếp

2.3.5 Phương pháp cải tạo và chọn giống

2.3.5.1 Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên

* Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên những cá thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá thể khác từ các giống thuần khiết

* Tiến hành:

- Cân pha MT2, hấp tiệt trùng, đổ môi trường ra đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa)

- Chuẩn bị hỗn hợp dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn

Streptomyces 183.222 từ ống giống rồi hòa vào ống nghiệm chứa 10ml nước máy

vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1(định ước) Tiếp tục pha loãng hỗn dịch này bằng nước vô trùng đến nồng độ 10-6

- Cấy bào tử: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5-10-6, nhỏ lên bề mặt của MT2 trong đĩa Petri, nuôi xạ khuẩn trong tủ

ấm ở 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển

- Sàng lọc: Sau 6 ngày nuôi, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng mọc riêng rẽ, cấy zigzag lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri (chọn 32 khuẩn lạc) sau đó nuôi ở 28oC trong 6 ngày

- Thử hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh của các biến chủng bằng phương pháp khối thạch, đánh giá kết quả Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

2.3.5.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV