Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 183.222

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183.222 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183.222 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Ngườihướngdẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơithựchiện: BộmônVisinhvàSinhhọc TrườngĐạihọcDượcHàNội HÀ NỘI – 201 4 LỜI CẢM ƠN Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, viện hóa học- viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Nguyệt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3 1.1.4. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces 4 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 4 1.2.3. Đặc điểm sinh lý 4 1.2.4. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 5 1.3. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 5 1.3.1. Cải tạo giống vi sinh vật 5 1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật 7 1.4. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7 1.4.1. Khái niệm lên men 7 1.4.2. Các phương pháp lên men 7 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 9 1.6. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 10 1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR) 10 1.6.2. Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS) 10 1.6.3. Phổ khối lượng (MS) 11 1.7. Một số nghiên cứu liên quan 11 1.7.1. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp. 11 1.7.2. Phương pháp tiếp cận mới để cải thiện năng suất của kháng sinh: sản xuất các chủng gây đột biến kháng kết hợp. 12 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1. Giống xạ khuẩn 13 2.1.2. Vi sinh vật kiểm định 13 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 14 2.1.4. Dụng cụ và hóa chất. 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 17 2.2.2. Chọn lọc và cải tạo giống 17 2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 18 2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 18 2.3. Phương pháp thực nghiệm 18 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng 18 2.3.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 18 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19 2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21 2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống 21 2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men. 23 2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24 2.3.9. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25 2.3.10. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 25 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 26 3.2. Kết quả sinh tổng hợp của kháng sinh do Streptomyces 183.222 sinh tổng hợp trên các môi trường khác nhau. 26 3.3. Kết quả cải tạo giống. 27 3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. 27 3.3.2. Kết quả đột biến 28 3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. 32 3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh. 33 3.7. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng. 34 3.8. Kết quả chạy sắc kí cột. 35 3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh thu được. 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 1. Kết luận 41 2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2'- deoxyribonucleic B.cereus Bacillus cereus DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project ( chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet ( tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học . 2 Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 13 Bảng 2.2. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). 14 Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15 Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng 16 Bảng 3.1. Các đặc điểm của Streptomyces 183.222 và Streptomyces cellulosae 26 Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định. 27 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 28 Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 29 Bảng 3.5. Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 30 Bảng 3.6. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men. 31 Bảng 3.7. Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt. 31 Bảng 3.8. Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh. 32 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh . 32 Bảng 3.10. Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau. 33 Bảng 3.11. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 34 Bảng 3.12. Kết quả thử các phân đoạn sau chạy cột lần 1. 35 Bảng 3.13. Kết quả SKLM với các phân đoạn 2- 16 36 Bảng 3.14. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 37 Bảng 3.15. Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 12 38 Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3………39 Bảng 3.17. Kết quả SKLM các phân đoạn 1-8…………………………………….40 PHỤ LỤC Hình P.1. Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh. Hình P.2. Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 183.222 sau 6 ngày nuôi cấy. Hình P.3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương pháp khối thạch. Hình P.4. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương pháp giếng thạch. Hình P.5. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P.6. Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột. Hình P.7. Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 183.222 Hình P.8. Phổ tử ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222. Hình P.9. Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222. Hình P.10. Phổ khối lượng vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày 28/9/1928, A.Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển S.aureus của penicillin notatum, sau đó 10 năm, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey đã cùng hợp tác với ông nghiên cứu sâu hơn phát hiện này và tới năm 1941, họ đã chiết ra được Penicillin từ chủng penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và chính thức đưa nó vào sử dụng trong chiến tranh thế giới lần I giúp hàng ngàn thương binh thoát khỏi cái chết vì những nhiễm khuẩn thông thường. Từ đó, kháng sinh tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời.[25]. Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi tràn lan và không đúng cách của kháng sinh hiện nay nên tình hình kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng, nhiều kháng sinh đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới có hiệu quả cao, độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là yêu cầu tất yếu trong phát triển y tế. Môi trường tự nhiên của nước ta tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ vi sinh vật, trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces sản xuất. Đồng thời, chi này còn có nhiều vi sinh vật ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất điều trị ung thư như Streptomyces antibioticus sinh tổng hợp actinomycin D điều trị ung thư, chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi… Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 183.222 ” với các mục tiêu sau: - Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222. - Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế kháng sinh. - Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được. [...]... G (-)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc 18 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu... trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3-6 tháng cấy chuyền [8],[2],[10],[15] 1.4 .Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là sản phẩm trao... + + Saccarose + Raffinose Nhận xét: theo bảng 3.1 Streptomyces 183.222 có 11/14 (78,57%) đặc điểm phân loại giống với Streptomyces cellulosae 3.2 Kết quả sinh tổng hợp của kháng sinh do Streptomyces 183.222 sinh tổng hợp trên các môi trường khác nhau Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces 183.222 trên 7 môi trường khác nhau, sau đó thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt khối thạch với 10 VSV kiểm... giống vi sinh vật 1.3.1 Cải tạo giống vi sinh vật  Mục đích Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có 6 hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm các mục đích khác nhau: - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cải... CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác” Theo nghĩa rộng hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có... các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men - Xác định độ bền nhiệt: lấy khoảng 5-7ml dịch lọc lên men vào 3 ống nghiệm Ống thứ nhất đun sôi trực tiếp 10 phút, ống thứ... ô nhiễm môi trường Các phương pháp lên men chìm: - Lên men mẻ: VSV được nuôi cố định trong bình lên men với thể tích môi trường xác định, ở điều kiện sinh lý tối thích Trong suốt thời gian lên men, không tác động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH Kết thúc quá trình, thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm - Lên men bán liên tục: là lên men VSV trong điều kiện xác định,... - Trao đổi chất folat: sulfamid,… Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lục P.1 [9] 1.1.4 Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn,… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc trưng và trên các... chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch chiết - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ 2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được - Xác định nhiệt... lượng phân tử và góp phần nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất.[2],[15], [18] 1.7 Một số nghiên cứu liên quan 1.7.1 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces sp Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase gồm tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C ( 3, C26H34NO8), D (4,C28H36NO10) từ Streptomyces sp USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp tetrapetalone . vi sinh vật 5 1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật 7 1.4. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7 1.4.1. Khái niệm lên men 7 1.4.2. Các phương pháp lên men 7 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng. NGUYỆT GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183. 222 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Ngườihướngdẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơithựchiện: BộmônVisinhvàSinhhọc TrườngĐạihọcDượcHàNội. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 183. 222 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT GÓP