*Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
*Tiến hành:
- Tạo hỗn dịch vi khuẩn kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường canh thang, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn định có nồng độ 107-108 tế bào/ml, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h.
- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường ở 45 – 50oC sau khi đã hấp tiệt trùng với tỷ lệ V giống/V thạch thường = 5/200. Lắc đều để vi khuẩn kiểm định phân tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
*Các phương pháp thử:
- Phương pháp khối thạch: Đưa các mẫu thử là các khối thạch ( = 6mm) chứa vi sinh vật cần thử lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường vi sinh vật kiểm định ( = 6mm), sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng.
- Phương pháp khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc (= 6mm) đã sấy khô tẩm dung dịch thử (3 lần), sấy khô ở 45oC, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định.
Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 18- 24h. Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm và được đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn. Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i. s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh. n: Số thực nghiệm làm song song.