2.3.8.1. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ
* Mục đích: Xác định pH và dung môi thích hợp để tách hoạt chất kháng sinh ra khỏi hỗn dịch dịch lọc lên men.
* Tiến hành:
- Dùng phương pháp chiết 1 lần.
- Dịch lọc lên men được điều chỉnh về pH thích hợp bằng dung dịch NaOH 1,0N hoặc HCl 1,0N. Cho dung môi hữu cơ và dịch lên men vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc= 1:5. Lắc đều, để 1h cho phân lớp. Tách riêng lớp dung môi và dịch lọc. Sau đó thử HTKS của lớp dung môi hữu cơ và lớp nước bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Căn cứ kết quả thu được chọn lấy dung môi hữu cơ và pH tối ưu để chiết.
2.3.8.2. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký
Sắc ký lớp mỏng
Mục đích: bước đầu cho biết mẫu thử có bao nhiêu thành phần, mẫu thử có độ tinh khiết thế nào.
Tiến hành:
- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút.
- Pha hệ dung môi theo đúng tỉ lệ, đổ vào bình sắc ký, cho bão hòa dung môi trong 30 phút sao cho lớp dung môi không quá 1cm.
- Chấm dịch chiết lên bản mỏng đã hoạt hóa, vết chấm cách mép dưới 1,5cm, cách 2 mép bên 1cm từ 3-5 lần. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, đặt bản mỏng vào bình sắc ký khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
- Sấy bản mỏng, soi đèn UV hoặc hiện hình bằng VSV.
- Phương pháp hiện hình VSV: đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch có cấy VSV kiểm định lên, ủ ở 370C trong 18-24h. Xác định vết kháng sinh bằng vòng vô khuẩn. - Tính Rf: Rf = dm v d d
trong đó: dv: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết. ddm: khoảng cách dung môi chạy.
Sắc ký cột
Mục đích: tinh chế và tách riêng các thành phần trong bột kháng sinh.
Tiến hành:
- Cột: =1cm, dài 50cm, rửa sạch, sấy khô.
- Chất nhồi: Silicagell 60 Merck cỡ hạt 0,040 - 0,063mm được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với hệ DMHC chạy đưa lên cột.
- Mẫu thử: bột kháng sinh thu được sau cất quay dịch chiết DMHC hòa tan với 1 lượng nhỏ dung môi rồi trộn với 1 lượng nhỏ Silicagel đã hoạt hóa. Sấy khô, rồi cho lên cột, để ổn định trong 30 phút.
- Chạy cột: cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,3-0,5ml/ phút. Lấy các phân đoạn đã chạy qua cột vào ống nghiệm sạch, mỗi ống 3-5ml. Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Các phân đoạn có HTKS được tiến hành SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đọan có thành phần giống nhau được gộp lại đem cất quay tinh chế tiếp.