2.3.5.1. Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên
* Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên những cá thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá thể khác từ các giống thuần khiết.
* Tiến hành:
- Cân pha MT2, hấp tiệt trùng, đổ môi trường ra đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa). - Chuẩn bị hỗn hợp dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn
Streptomyces 183.222 từ ống giống rồi hòa vào ống nghiệm chứa 10ml nước máy vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Tiếp tục pha loãng hỗn dịch này bằng nước vô trùng đến nồng độ 10-6.
- Cấy bào tử: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5-10-6, nhỏ lên bề mặt của MT2 trong đĩa Petri, nuôi xạ khuẩn trong tủ ấm ở 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển.
- Sàng lọc: Sau 6 ngày nuôi, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng mọc riêng rẽ, cấy zigzag lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri (chọn 32 khuẩn lạc) sau đó nuôi ở 28oC trong 6 ngày.
- Thử hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh của các biến chủng bằng phương pháp khối thạch, đánh giá kết quả. Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
* Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
* Tiến hành:
- Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của sàng lọc ngẫu nhiên cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Lấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào đĩa Petri vô trùng và được đem đột biến dưới tác dụng ánh sáng UV với = 254 nm, khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu 5 phút.
Hỗn dịch bào tử sau khi được chiếu UV được đưa vào chỗ tối 2h, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-4-10-5.
- Cấy bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng ở nồng độ 10-6 và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, dùng que trang dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ pha loãng tiến hành trên 3 đĩa Petri song song, sau đó nuôi cấy ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót.
Tỷ lệ phần trăm xạ khuẩn sống sót được tính theo công thức. Tỷ lệ sống sót =
0
N Nm
x 10-6+k x 100%
Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến ở các nồng độ 10-k . N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử đã sử dụng.
Sàng lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như ở phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên, làm song song với mẫu chứng. Tính % biến đổi hoạt tính của biến chủng thứ i sau đột biến theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = 0
D Di
x 100%
Di: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB. D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn 3–5 biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.