Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 52.13

B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI NGUYỄN THANH TÂM GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH NH STREPTOMYCES 52.13 KHA LUN TT NGHIP DƯC S H NI-2013 B Y TÊ TRƯNG ĐI HC DƯC H NI NGUYỄN THANH TÂM GP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH NH STREPTOMYCES 52.13 KHA LUN TT NGHIP DƯC S Ngưi hưng dn: DS Tạ Thu Lan Nơi thc hin: B môn Vi sinh & Sinh hc H NI-2013 LI CẢM ƠN Tôi xin gi li c m ơn sâu sc nht đn cô gio DS -Tạ Thu Lan ngưi đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny. Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô gio , cc cn b , k thut viên ging dạy , công tc tại B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trư ng Đại hc Dưc H Ni, B môn Ha vt liu- khoa Ha trưng Đại hc Khoa hc tự nhiên H Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim. Nhân dp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc thy cô gio trưng Đại hc Dưc H Ni đ dạy d v tạo mi điu kin thun l i cho tôi trong thi gian tôi hc tp tại trưng. V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bạn b đ đng viên , gip đ tôi trong sut thi gian thực hin kha lun. Do thi gian lm thực nghim cng như kin th c ca bn thân c hạn, kha lun không th trnh khỏi nhiu thiu st. Tôi rt mong nhn đưc sự gp  ca cc thy cô , bạn b đ kha lun đưc hon thin hơn. Tôi xin chân thnh cm ơn! H Ni, ngày 18, tháng 5, năm 2013. Sinh viên Nguyễn Thanh Tâm Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1.Đại cương v khng sinh 2 1.1.1 Đnh nghĩa khng sinh 2 1.1.2.Tiêu chuẩn đi vi mt khng sinh 2 1.1.3.Đnh gi tc dụng: 3 1.1.4 Phân loại khng sinh 3 1.1.5. Cơ ch tc dụng ca khng sinh 4 1.1.6.Cc ng dụng ca khng sinh 5 1.2.Đặc đim ca xạ khuẩn chi Streptomyces 6 1.2.1.Đặc đim hnh thi: 6 1.2.2.Đặc đim sinh l: 7 1.2.3.Đặc đim cu tạo: 7 1.2.4.Kh năng tạo sc t: 7 1.3.Tuyn chn, ci tạo v bo qun ging xạ khuẩn 8 1.3.1.Chn chng c HTKS cao bằng sng lc ngu nhiên 8 1.3.2.Đt bin ci tạo ging 8 1.3.3.Bo qun ging xạ khuẩn 9 1.4.Sự sinh tổng hp khng sinh ở xạ khuẩn 9 1.4.1 Sự hnh thnh KS ở xạ khuẩn 9 1.4.2.Mt s yu t nh hưởng ti qu trnh sinh tổng hp KS 10 1.4.3.Lên men sinh tổng hp khng sinh t Streptomyces 11 1.5.Chit tch v tinh ch khng sinh t dch lên men 12 1.5.1.Vai trò ca chit tch v tinh ch khng sinh 12 1.5.2.Cc phương php chit tch 13 1.6.Bưc đu nghiên cu cu trc khng sinh 14 1.6.1.Phổ t ngoại - kh kin 144 1.6.2.Phổ hồng ngoại 14 1.6.3.Khi phổ 14 1.7. Mt s kt qu nghiên cu v KS 15 1.7.1.Ảnh hưởng ca Panamycin - 607 lên cc sn phẩm chuyn ha th cp sn xut bởi Streptomyces spp. 15 5 1.7.2. Cc polyene macrolid mi h hng vi nystatin c vng polyol ci bin thông qua công ngh sinh tổng hp S. noursei 15 1.7.3.Acid pivalic- đơn v khởi đu trong sinh tổng hp acid béo v khng sinh ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces 166 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 177 2.1 Nguyên vt liu v thit b 177 2.1.1Nguyên vt liu 177 2.1.2My mc thit b 199 2.2 Ni dung nghiên cu 20 2.2.1. Sng lc, ci tạo ging 20 2.2.2 Lên men, chit tch khng sinh 20 2.2.3 Sơ b xc đnh mt s tính cht ca khng sinh tinh khit thu đưc 20 2.3 Phương php thực nghim 20 2.3.1Nuôi cy v gi ging xạ khuẩn 20 2.3.2.Đnh gi hoạt tính khng sinh bằng phương php khuch tn 21 2.3.3.Phương php ci tạo ging 222 2.3.4.Lên men chm tổng hp khng sinh 244 2.3.5.Chit khng sinh t dch lên men bằng dung môi hu cơ 255 2.3.6. Sơ b xc đnh thnh phn trong khng sinh bằng sc k lp mỏng . 255 2.3.7. Thu khng sinh thô bằng phương php ct quay 266 2.3.8. Tinh ch khng sinh thô bằng sc k ct 266 2.3.9.Kt tinh lại KS 277 2.3.10. Sơ b xc đnh khng sinh tinh khit thu đưc 277 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 278 3.1.Nâng cao kh năng sinh tổng hp KS ca chng Streptomyces 52.13 288 3.1.1.Kt qu sng lc ngu nhiên 288 3.1.2.Kt qu đt bin nâng cao kh năng sinh tổng hp khng sinh ca Streptomyces 52.13 299 3.1.2.1.Đt bin bằng nh sng UV 29 3.1.2.2.Đt bin bằng ha cht: 311 3.2.Kt qu chn dung môi hu cơ v pH chit KS t dch lc 322 3.3. Lên men dch th sinh tổng hp khng sinh 333 3.3.1. Chn môi trưng lên men tt nht 333 3.3.2.Chn bin chng lên men tt nht: 333 3.4.Chit xut v bưc đu tinh ch cht khng sinh t dch lên men 344 3.4.1.Kt qu sc k lp mỏng 344 3.4.2.Kt qu tinh ch khng sinh bằng sc k ct 355 3.4.3.Kt qu kt tinh: 40 3.4.4.Kt qu đo phổ xc đnh cu trc ca KS tinh khit 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 411 1.Kt lun: 411 2.Kin ngh 422 Ti liu tham kho Phụ lục DANH MỤC CC CHỮ VIT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 CLNN Chn lc ngu nhiên CW Thnh t bo- Cell wall DM Dung môi DMHC Dung môi hu cơ ĐB Đt bin Gr Gram IR Hồng ngoại- Infrared KS Kháng sinh L-DAP L- diaminopimelat MTdt Môi trưng dch th P.mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SKLM Sc k lp mỏng SLNN Sàng lc ngu nhiên TB T bo TĐC Trao đổi cht VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vt UV T ngoại ultra violet DANH MỤC CC BẢNG Bng 2.1: Cc VSV kim đnh Bng 2.2: Môi trưng nuôi cy xạ khuẩn Bng 2.3: Cc môi trưng nuôi cy VSV kim đnh Bng 2.4: Các dung môi đ s dụng Bng 3.1: Kt qu th HTKS sng lc ngu nhiên chng Streptomyces 52.13 Bng 3.2: Kt qu th HTKS đt bin bằng UV ln 1 Bng 3.3: Kt qu th HTKS đt bin bằng UV ln 2 Bng 3.4: Kt qu th HTKS đt bin ha hc Bng 3.5: Kt qu chn dung môi v pH chit Bng 3.6: Kt qu chn môi trưng lên men chm Bng 3.7: Kt qu chn bin chng lên men chm tt nht Bng 3.8: Kt qu chạy sc kí lp mỏng Bng 3.9: Kt qu th HTKS cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 1 Bng 3.10: Kt qu sc kí lp mỏng cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 1 Bng 3.11: Kt qu th HTKS cc phân đoạn sau chạy ct ln 2 Bng 3.12: Kt qu sc kí cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 2 DANH MỤC CC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cơ ch tc dụng ca cc h KS chính Hình 1.2: Cc khuẩn ty ở xạ khuẩn Hình 1.3: Đưng cong biu diễn sự sinh trưởng v pht trin ca xạ khuẩn 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự pht hin ra tc dụng ca khng sinh ln đu tiên ca nh bc sĩ ngưi Anh Alexander Flaming vo thng 10 năm 1928 l mt thnh tựu vĩ đại ca y hc. Sự xut hin ca khng sinh đ gip con ngưi chng lại sự tn công ca cc loi vi khuẩn nguy him v lm gim tỉ l t vong cho ngưi bnh. Song, do bn năng sinh tồn, vi khuẩn luôn tm mi cch bin đổi đ trở nên khng thuc. Mt ví dụ đin hnh c th k đn l vic vi khuẩn c th tạo ra β- lactamase mt loại enzym do vi khuẩn tit ra c th ph hy cu trc ca penicillin v vô hiu ha tc dụng khng khuẩn ca cc khng sinh c cu trc vòng β-lactam. Tc đ bin đổi như v bo hin nay ca vi khuẩn c th tạo ra hng loạt cc loại siêu vi khuẩn đa khng thuc khin cho th gii lâm vo tnh trạng không c phương php cu cha cho nhiu loại bnh.Chính v vy vic tm ra, pht trin cc loại khng sinh mi c hoạt tính khng khuẩn v hiu qu điu tr cao đang l mt vn đ ht sc bc thit ca ngnh công nghip khng sinh hin nay. Như chng ta đ bit trong s cc khng sinh đưc bit đn hin nay mt tỉ l ln đu c nguồn gc t xạ khuẩn. Bên cạnh đ theo cc kt qu điu tra 65% khng sinh nguồn gc xạ khuẩn l do chi Streptomyces sn xut ra. Đ l cơ sở đ cc nh khoa hc nưc ta hin nay tp trung nghiên cu vo chi xạ khuẩn ny. Tại b môn Vi sinh – sinh hc trưng đại hc Dưc H Ni chng tôi đ chn đ ti : “Gp phn vo nghiên cu lên men tổng hp khng sinh t Streptomyces 52.13”. Ni dung ca kha lun mong mun đạt đưc cc mục tiêu sau đây: - Nghiên cu cc bin php ci tạo ging Streptomyces 52.13 nhằm lm tăng kh năng sinh tổng hp khng sinh. - Nghiên cu điu kin lên men, nuôi cy v chit xut thích hp. - Tìm điu kin tinh ch KS thích hp, bưc đu nghiên cu cu trc ca KS [...]... thay đổi đáng kể khả năng sinh tổng hợp của KS của nhiều loại xạ khuẩn 1.4.3 .Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces a.Định nghĩa: Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt động sống của VSV nhờ xúc tác của enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần cho chúng.[5] , [12] b.Các phương pháp lên men - Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong... 2.2.2.1 .Lên men - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các biến chủng tốt nhất đã được giữ lại sau mỗi lần chọn lọc cải tạo giống, lựa chọn biến chủng có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất 2.2.2.2.Chiết tách kháng sinh : - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng. .. (co-trimoxazol ) - Các kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline…) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…) - Các kháng sinh khác (rifapicin…) [8], [18] 1.1.5 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây... thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[13] 1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn 1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh tranh trong... methylbutyric cũng được kết hợp trong sinh tổng hợp kháng sinh avermectin [22] 17 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu  Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 52.13 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được phân lập từ mẫu đất Hà Nội  Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được trình...2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của Penicillin notatum mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị [6] Năm 1942, Waksman đưa ra định nghĩa: Kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất... thường dùng cho các chế phẩm bán tổng hợp và tinh khiết [8] 1.1.4 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết... dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Sàng lọc, cải tạo giống - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần và kết hợp với đột biến hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh 2.2.2.1 .Lên. .. kiểu lên men chìm như sau: + Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm + Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men + Lên. .. 6 – 12 giờ đầu của quá trình nuôi cấy Nồng độ O2 thích hợp cho sinh tổng hợp KS là 2 – 8 ml O2 / 100ml 11 - Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất là 36 – 72 giờ tuổi Lượng giống 2 – 10 % b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men: [11] , [24] - Nguồn Carbon: có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành KS Nguồn carbon thường được sử . trưng sẽ lm thay đổi đng k kh năng sinh tổng hp ca KS ca nhiu loại xạ khuẩn. 1.4.3 .Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces a.Định nghĩa: Lên men l qu trnh phân gii hydratcarbon. 1.4.Sự sinh tổng hp khng sinh ở xạ khuẩn 9 1.4.1 Sự hnh thnh KS ở xạ khuẩn 9 1.4.2.Mt s yu t nh hưởng ti qu trnh sinh tổng hp KS 10 1.4.3 .Lên men sinh tổng hp khng sinh t Streptomyces. vo nghiên cu lên men tổng hp khng sinh t Streptomyces 52. 13”. Ni dung ca kha lun mong mun đạt đưc cc mục tiêu sau đây: - Nghiên cu cc bin php ci tạo ging Streptomyces 52. 13