Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173.113

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths. Võ Thị Thu Thủy – người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Lê Thị Thu Hiền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………… 2 1.1 Đại cương về kháng sinh … ………………………………………………2 1.1.1 Lược sử phát triển của kháng sinh ……………….………………… 2 1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ……………………………………2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh …………………………………….4 1.1.4 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất kháng sinh ……………….…… 5 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ………………………………….……6 1.2 Đại cương về xạ khuẩn .…………………………………………….…… 6 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ……………………………………… 7 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………………………………7 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn …………………….….9 1.3.1 Mục đích …………………………………………………………… 9 1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng SLNN ………….……9 1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………….………………….9 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………….…………… 10 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………………………………… 11 1.4.1 Khái niệm lên men ………………………………………………….11 1.4.2 Các phương pháp lên men ………………………………………….11 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men …………………….12 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………… 13 1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh ………………14 1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến ……………………………………………14 1.6.2 Phổ hồng ngoại……… …………………………………………….14 1.6.3 Khổi phổ (MS)………………………………………………………15 1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh …………………………… 15 1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus …………………… 15 1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất Leptomycin bởi electroporation …………………………………….16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… ……… 17 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………………….17 2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17 2.1.2 Máy móc và thiết bị ………………………………………………….19 2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………….19 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ……………………………………………… 19 2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ……………………………………… 20 2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được …………………………20 2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ……… 20 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21 2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23 2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24 2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ……………………… 25 2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………………….25 2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………… 26 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………….… 27 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………….……… 27 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………….……… 28 3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ……………………………………29 3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………… …….……….30 3.6 Kết quả chọn chủng lên men ……………………………………….… 31 3.7 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ……………………… …32 3.8 Kết quả sắc kí cột …………………………………………….…………32 3.9 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết …………………………….38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận ………………………………………………………………….… 40 2 Kiến nghị ………………………………………………… …………………40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT S.A Staphylococcus aureus P. mirabilis Proteus mirabilis ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DMHC Dung môi hữu cơ ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 G (-) Gram âm G (+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại - Infrared KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất UV Tử ngoại – Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học 3 Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 17 Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 18 Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng 18 Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 27 Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 28 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 28 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 29 Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men 30 Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men 31 Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 32 Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 33 Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần1 (hiện hình bằng P. mirabilis) 34 Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35 Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2 (hiện hình bằng P. mirabilis) 36 Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 37 Bảng 3.13: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3 (hiện hình bằng P. mirabilis) 38 Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) 2 Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh 4 Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 6 Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 8 Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn …………………… 13 Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis………… 34 Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35 Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36 Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV. Hình P4: Sắc kí lớp mỏng. Hình P5: Sắc kí cột. Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y – dược. Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị được các bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Không dừng lại ở đó, ngày nay phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS cũng cho nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan và không đúng cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều cần thiết và được cả thế giới quan tâm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được nhiều thành tựu. Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Bởi vậy, trong khóa luận này tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất. - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. [...]... nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau [18]  Có 6 kiểu chủ yếu: [18] - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất - Tác dụng lên sự tổng hợp AND - Tác dụng lên sự tổng hợp protein - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian 1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh. .. thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [4,7,11] Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh. .. nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh thể với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h  Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa... ngày càng tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có Hiện nay, việc kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có cũng đạt được những... nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều... môi trường lên men cho hiệu suất sinh KS cao nhất thường là 36 – 72 giờ tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng 2 – 10%.[14,8] Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [14, 8] 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men  Kháng sinh là những... Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt... lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ...Chương 1 : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940 Ngay sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh... tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó (Hình 1.2) Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong . GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH. thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2 0 C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men là. kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi lựa chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ