Nguyên tắc:
Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106
-108 tế bào/ml.
đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105
tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau :
- Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50oC, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
- Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.
- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.
Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = − = = − ∑ ∑ Trong đó:
D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,
i
D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3).