Đem chủng ĐB1.01 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút. Thử HTKS của 36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 7.
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh S. aureus P. mirabilis D (mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D S % hoạt tính so với MC ĐB2.01 26,16 0,48 104,89 24,43 0,04 97,25
ĐB2.02 27,50 0,43 110,26 26,73 0,58 106,41 ĐB2.04 25,47 0,07 102,13 24,67 0,13 98,21 ĐB2.05 26,86 0,96 107,69 25,95 1,03 103,30 ĐB2.07 26,91 1,01 107,90 25,37 0,62 100,99 ĐB2.12 24,23 0,88 97,15 23,79 0,49 94,71 ĐB2.13 25,82 0,24 103,53 25,37 0,62 97,05 ĐB2.30 24,35 0,80 97,63 23,49 0,00 93,51 ĐB2.32 24,13 0,95 96,75 23,37 0,80 93,03 ĐB2.35 25,18 0,21 100,96 24,79 0,21 98,69 ĐB2.36 25,56 0,06 102,49 25,44 0,67 101,27 MC 24,94 0,00 100,00 25,12 0,45 100,00
Nhận xét: Tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là 0,54%. Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 02, 05, 07 (ĐB2.03, ĐB2.05, ĐB2.07) so với mẫu chứng được lưu giữ, nhân giống cho các nghiên cứu về sau. Riêng biến chủng số 02 của ĐB 2 được dùng cho đột biến hóa học bằng tác nhân HNO2.
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3
Đem chủng ĐB2.02 đột biến bằng tác nhân hóa học HNO2. Thử HTKS của 36 biến chủng thu được bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính được thể hiện trong bảng 8. Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 Ký hiệu dạng biến chủng Hoạt tính kháng sinh S. aureus P. mirabilis D (mm) S % hoạt tính so với MC (mm) D s % hoạt tính so với MC ĐB3.01 27,10 0.33 100,33 24,11 0,78 98,61 ĐB3.03 26,22 0,29 97,08 24,35 0,61 99,59 ĐB3.04 28,19 0,11 104,37 26,12 0,95 106,83 ĐB3.07 27,85 0,86 103,11 25,58 0,26 104,62 ĐB3.09 26,43 0,00 97,85 23,51 0,21 96,15 ĐB3.11 26,78 0,11 99,15 24,01 0,85 98,20 ĐB3.15 26,97 0,95 99,85 24,85 0,25 97,64
ĐB3.19 27,67 0,74 103,44 25,42 0,15 103,97
ĐB3.20 27,78 0,81 102,85 25,06 0,60 102,49 ĐB3.25 25,79 0,59 95,48 22,64 0,30 88,96 ĐB3.36 27,01 0,32 100,00 24,74 0,33 101,19
MC 27,01 0.12 100,00 24,45 0,00 100,00
Nhận xét: Tỷ lệ sống sót là 0,15%. Tỷ lệ sống sót khi đột biến bằng tác nhân hoá học nhỏ hơn rất nhiều so với đột biến bằng ánh sáng UV (0,15% so với 0,54%). Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 04, 07, 19(ĐB3.04, ĐB3.07, ĐB3.19) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu sau.
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Từ kết quả chọn MT nuôi cấy bề mặt đã tham khảo từ khóa luận trước, đã chọn được 3 MT tốt nhất là MT1, MT5 và MT6 [15]. Thực hiện lên men chìm
Streptomyces 173.113 trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT5dt và MT6dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 9.
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men
Môi trường S.aureus P. mirabilis (mm) s (mm) s MT1 dt 24,48 0,28 22,47 0,33 MT5 dt 21,15 0,67 19,53 0,75 MT6 dt 22,37 0,21 19,76 0,59
Nhận xét: Kết quả lên men Streptomyces 173.113 trên MT1dt có HTKS mạnh nhất nên lựa chọn MT1 làm môi trường lên men cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.6 Kết quả chọn chủng lên men
Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, lần 3 đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 173.113. Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt. Dịch lên men được lọc qua giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả chính được trình bày ở bảng 10.
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men
Dạng chủng, biến chủng Hoạt tính kháng sinh P. mirabilis S. aureus D(mm) s D(mm) s SLNN.04 22,14 0,37 23,46 0,27 SLNN.20 22,55 0,82 23,13 0,41 ĐB1.01 24,45 0,13 25,39 0,55 ĐB1.09 23,67 0,45 25,39 0,74 ĐB2.02 26,56 0,31 27,71 0,11 ĐB2.07 26,40 0,35 27,48 0,46 ĐB3.04 28,45 0,37 29,41 0,77 ĐB3.19 27,31 0,56 29,11 0,92
Nhận xét: Theo kết quả thử HTKS, biến chủng ĐB3.04 khả năng sinh tổng hợp KS tốt nhất, chọn làm chủng lên men chìm lấy dịch cho những nghiên cứu sau
3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 11.
Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf
Vết 1 Vết 2 1 Chloroform: methanol: amoniac
25% 2: 2: 1 - - 2 Butanol: ethanol:
dimethylformamid 3: 1: 1 - -
3 Butylacetat: aceton: triethylamin 1: 2: 1 0,31 0,42
4 Ethylacetat: propanol: aceton nitril 2: 3: 1 0,40 0,50
Nhận xét: Kết quả chỉ có hệ 3, 4 cho tách thành vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt hơn vì vết hiện hình VSV có dạng hình tròn, không có đuôi kéo dài trong khi với hệ 4 gần như giọt nước ngược, có đuôi kéo dài. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.8 Kết quả sắc ký cột
Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 7 lít, đem chiết bằng ethylacetat ở pH 5 thu được 950 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,7232g bột kháng sinh thô mang chạy sắc ký cột.
Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.
Chạy sắc ký lần 1:
Cân 0,1112 g bột KS thô để chạy cột với hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1).
- Bước 2: Rửa cột bằng 15-20ml n-hexan. - Bước 3: Chạy cột với hện dung môi 3.
Lấy 36 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P. mirabilis). Thu được 24 phân đoạn có HTKS. Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 12.
Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s
1 17,44 0,18 14 17,49 0,22 2 18,51 0,17 15 16,34 0,60 3 22,57 0,39 16 15,79 0,00 4 24,49 0,45 17 15,40 0,57 5 24,11 0,43 18 13,54 0,09 6 23,78 0,54 19 11,12 1,00 7 23,02 0,78 20 10,42 1,12 8 22,11 0,22 21 9,67 0,70 9 21,12 0,72 22 8,05 0,24 10 20,82 0,10 23 7,00 0,00 11 19,73 0,59 24 6,30 1,33 12 19,22 1,34 25 0,00 0,00 13 18,50 0,45 26-36 0,00 0,00
Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1). Kết quả được thể hiện ở bảng 13.
Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 1(hiện hình bằng P. mirabilis)
Phân đoạn Vết 1 Vết 2 Phân đoạn Vết 1 Vết 2 1 0,32 - 7 0,30 0,20 2-4 0,31 - 8-18 0,3 0,20 5 0,31 0,22 19-28 - 0,20 6 0,30 0,20 29-36 - -
Đánh giá cảm quan: Có một chất màu nâu bị giữ trên cột. Phân đoạn 1, 2 có màu vàng nhat. Phân đoạn 3 đến 8 có màu vàng cam. Phân đoạn 9 đến 36, màu vàng nhạt dần.
Nhận xét: Khả năng chạy sắc kí của hệ không được tốt. Tạm thời chia hệ chạy sắc kí làm 4 phần: Phần 1 từ phân đoạn 1 đến 4, phần 2 từ phân đoạn 5 đến 18 và phần 3 từ phân đoạn 19 đến 28 và phần 4 từ phân đoạn 29 đến 36. Phân đoạn chính là phân đoạn từ 1 đến 4. Phần 2 có 2 chất trong đó có hoạt chất chính. Nhận thấy hiệu suất quá trình tinh chế thấp, dựa theo nghiên cứu trước và khảo sát một loạt hệ dung môi, nhận thấy hệ Etylacetat – methanol (10:1) cho tách vết tốt. Dùng hệ dung môi này cho chạy cột lần 2.
Kết quả: Cô phần 1 thu được 0,0116g bột KS màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 1 là H1 = 10,36%. Cô phần 2 được 0,0655g KS hỗn hợp để chạy cho lần tách tiếp theo.
Chạy sắc ký lần 2
Dùng 0,0655g KS sau tinh chế lần 1, chạy cột với hệ dung môi Etylacetal: methanol (10: 1).
- Bước 1: Đưa silicagel lên cột bằng hệ dung môi đã chuẩn bị. - Bước 2: Rửa cột bằng 15 – 20 ml n-hexan.
- Bước 3: Chạy cột như bình thường.
Thu được 30 phân đoạn trong đó có 20 phân đoạn có HTKS. Kết quả thử HTKS được trình bày trong bảng 14.
Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s
1 16,34 0 13 21,04 0,19 2 17,33 0,55 14 19,37 0,72 3 18,45 0,74 15 14,32 0,44 4 19,01 0,30 16 11,49 0,56 5 20,13 0,49 17 9,43 0,00 6 20,44 0,25 18 7,67 0,58 7 21,59 0,69 19 7,11 0,19 8 22,56 0,73 20 6,19 0,25 9 23,12 0,12 21 0,00 0,00 10 25,11 0,14 22 0,00 0,00 11 24,45 0,23 26 0,00 0,00 12 23,11 0,45 27-30 0,00 0,00
Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính, hệ dung môi chạy là hệ dung môi Ethylacetat: methanol (10:1) .Kết quả được thể hiện ở bảng
Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2(hiện hình bằng P. mirabilis)
Phân đoạn Vết 1 Vết 2 Phân đoạn Vết 1 Vết 2 1,2 0,32 - 17-23 - 0,21 3-11 0,31 - 24-25 - 0,20 12-16 0,30 0,21 26-30 - -
Nhận xét: Dựa theo kết quả thử HTKS và chạy sắc kí ta chia làm 4 phần với 2 phần chính. Phần 1: gồm phân đoạn 1 tới 11: Thu được 1 chất và đây là phân đoạn chính. Phân đoạn 2: gồm phân đoạn 12 tới 16, có 2 chất, vẫn còn hoạt chất 1. Phần 3: gồm phân đoạn 17 tới 25, thu được 1 chất và là phân đoạn phụ. Phần 4: gồm phân đoạn 26 tới 30, không thu được hoạt chất ở phân đoạn này.
Kết qủa: Cô phần 1 thu được 0,0165g KS tinh khiết. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 2 là H2 = 25,19%. Cô phần 2 được 0,0225g KS hỗn hợp, được dùng cho lần chạy tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chạy sắc ký lần 3
Cân 0,0225 g KS sau tinh chế lần 2, chạy cột với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (10:1).
- Bước 1: Đưa silicagel lên cột bằng hệ dung môi đã chuẩn bị. - Bước 2: Rửa cột bằng 15-20 ml n-hexan.
- Bước 3: Chạy cột như bình thường.
Thu được 30 phân đoạn trong đó có 21 phân đoạn có HTKS. Kết quả thử HTKS được trình bày trong bảng 16.
Bảng 3.12: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 Phân đoạn D (mm) s Phân đoạn D (mm) s
1 15,76 0,00 11 12,12 0,73 2 16,12 0,33 12-14 0,00 0,00 3 17,79 0,76 15 10,22 0,37 4 17,23 0,28 16 9,55 0,45 5 16,33 0,44 17 9,12 0,06 6 15,58 0,12 18 8,35 0,17 7 14,82 0,36 19 7,46 0,78 8 14,11 0,56 20 6,14 0,44 9 13,55 0,45 21 5,68 0,23 10 12,69 0,76 22-30 0,00 0,00
Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn bằng hệ dung môi Ethylacetat: Methanol. Hiện hình VSV bằng P. mirabilis kết quả như sau.
Bảng 3.13 : Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3(hiện hình bằng P. mirabilis) Phân đoạn Vết 1 Vết 2 Phân đoạn Vết 1 Vết 2 1 0,32 - 15 - 0,2 2-11 0,31 - 16-21 - 0,2 12-14 - - 22-30 - -
Nhận xét:Sau lần chạy sắc kí, ta thu được 2 phần có hoạt chất. Phần 1 gồm phân đoạn 1 tới 11 và phần 2 từ phân đoạn 15 tới 21.
Kết quả: Từ kết quả bảng nhận thấy ở lần chạy sắc kí thứ 3 đã có phân đoạn tách rõ rang giữa KS 1 và KS 2.phân đoạn 1 – 11 là phân đoạn chính. Đem cô, kết tinh lại thu được 0,0094 g bột tinh thể KS chính màu vàng cam. Hiệu suất quá trình tinh chế lần 3 là H3 = 41,77% KS và của tổng quá trình tinh chế là H = 33,48%. KS tinh khiết này dùng để đo phổ IR, UV, nhiệt độ nóng chảy và khối phổ.
3.8 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết
Nhiệt độ nóng chảy : 217,40C.
Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 204 nm, 333 nm và 443 nm. Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc điểm trên.
Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 17.
Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR [20]
λ(nm) Nhóm chức đặc trưng λ(nm) Nhóm chức đặc trưng 3433 Liên kết hidro: nhóm
amin hoặc OH nhân thơm
2956 Metyl- RCH3-
2925 Alkan no ( C-H) 2863 CO của ester hoặc anhydride acid (RO)2O 1738 -CO- của aldehyd mạch
thẳng hoặc Ceton
1652 C=O của hợp chất Ceton không bão hòa= lien kết
CO trong amid 1465 Nhóm imin C=N 1372 Liên kết S=O 1191,1096 Alcol, ether, ester, acid,
carboxylic, anhydride (CO), hay nhóm amin (C-N)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:
Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần bằng tác nhân hoá học thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 173.113 tăng lên so với mẫu sàng lọc khoảng 10-20%.
Chọn môi trường lên men chìm tổng hợp kháng sinh là MT1dt.
Kháng sinh do Streptomyces 173.113 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau:
Có ít nhất 3 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 33, 48%.
Nhiệt độ nóng chảy 217,40
C.
Kháng sinh tinh khiết có hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid.
2. Kiến nghị
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:
Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của
Streptomyces 173.113.
Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 173.113 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang…) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.
Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách khác để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.
Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa … để xác định chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 173.113
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2.
2. Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến và ứng dụng trong định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật.
3. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. PL129-PL131.
4. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr. 22-87 5. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ
thuật.
6. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr. 25-57. 7. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39-67.
8. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuản thuộc chi Steptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học khóa 2006-2008, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên.
9. Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập 2.
10.Võ Thị Bạch Huệ (2008), Hóa phân tích, NXB y học, tập 2, tr. 58-122, tr. 205-225.
11. Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 2.