Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155.29

Hiện nay xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các nhà khoa học Scotland, hay

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 155.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 155.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: TS Bùi Quang Phúc

Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội

Vi ện sốt rét -KST-CT TW

HÀ NỘI - 2013

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hương và Tiến sĩ Bùi Quang Phúc đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội, Viện sốt rét KST-CT TW đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Cũng nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà N ội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn , khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15, tháng 5, năm 2013

Sinh viên

Lê Hữu Nghị

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân lo ại kháng sinh 2

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 3

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 4

1.1.5 Khái niệm về tính kháng kháng sinh 5

1.1.6 Các ứng dụng của kháng sinh 5

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 6

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 6

1.2.2 Phân lo ại xạ khuẩn 6

1.2.3 Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces 7

1.3 Tuy ển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8

1.3.1 M ục đích 8

1.3.2 Ch ọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8

1.3.3 Đột biến cải tạo giống 8

1.3.4 B ảo quản giống xạ khuẩn 9

1.4 Lên men sinh t ổng hợp kháng sinh 9

1.4.1 Khái ni ệm lên men 9

1.4.2 Các phương pháp lên men 10

1.4.3 M ột số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11

1.5.1 M ục đích 11

1.5.2 Các phương pháp chiết tách 12

1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13

1.6.1 Ph ổ hồng ngoại 13

1.6.2 Phổ tử ngoại 13

1.6.2 Ph ổ khối 13

1.7 M ột số nghiên cứu liên quan 14

1.7.1 Quy định phân tử của sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces 14

1.7.2 Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp với những đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp .14

1.7.3 Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S hygroscopius D1.5 15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên v ật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên v ật liệu 16

2.1.2 Máy móc thiết bị 18

2.2 N ội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Ch ọn lọc, cải tạo giống 19

2.2.2 Lên men, chi ết tách kháng sinh tối thích 19

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 20

2.3 Phương pháp thực nghiệm 20

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20

2.3.3 Sàng l ọc ngẫu nhiên 21

2.3.4 Đột biến 22

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 24

2.3.7 Chi ết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24

2.3.8 Tách các thành ph ần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng .25

2.3.9 Thu kháng sinh thô b ằng phương pháp cất quay 26

2.3.10 Tinh ch ế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 26

2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27

3.2 K ết quả đột biến cải tạo giống lần 1 27

3.3 K ết quả đột biến cải tạo giống lần 2 28

3.4 K ết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học 29

3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30

3.5.1 K ết quả chọn môi trường lên men chìm 30

3.5.2 K ết quả chọn chủng lên men 31

3.6 K ết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 32

3.7 K ết quả chọn dung môi và pH chiết 33 3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 34

3.10 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic

CW Thành tế bào- Cell wall

DMHC Dung môi hữu cơ

MT2dt Môi trường dịch thể 2

SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men (trên P.mirabilis)

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men chìm

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)

Bảng 3.9: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P.mirabilis )

Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc kí cột lần 1 (trên P.mirabilis )

Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc kí cột lần 2 (trên P.mirabilis )

Bảng 3.13: Phổ IR

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn

Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch

Hình P3: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Hình P4: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV Hình P5: Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột

Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh

Hình P7: Phổ hồng ngoại của kháng sinh

Hình P8: Phổ khối (MS)

Nhu cầu sử dụng cao dẫn đến việc sử dụng kháng sinh tràn lan, khó kiểm soát đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh, thuốc kháng sinh mất dần tác dụng đang ngày trở nên nghiêm trọng, trong khi lại có quá ít các loại thuốc thay thế Vì

vậy việc nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới, các kháng sinh có hoạt tính cao, độc tính thấp, ít bị kháng khuốc là vấn đề được các nhà khoa học trên thế giới và trong nước quan tâm

Hiện nay xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh

vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các nhà khoa học Scotland, hay từ các loài nấm rừng của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan,…hay là từ chi xạ khuẩn

Streptomyces loài vi sinh vật thường sống ở đất, chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh của thế giới và đó là những sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế (như : thuốc kháng sinh, thuốc chống nấm, thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn

dịch,…) Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng

hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.29” làm khóa luận tốt nghiệp Khóa luận mong

muốn đạt được các mục tiêu sau đây:

- Nghiên cứu các biện pháp nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh thu được

- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

- Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh [18], [21], [22]

Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh

Theo nghĩa hẹp: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh v ật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp

Theo nghĩa rộng: Kháng sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…)

Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao

1.1.2 Phân lo ại kháng sinh [2], [3], [4], [8]

Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh : Phân loại theo nguồn gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên , kháng sinh bán tổng hợp ), theo phổ tác dụng (phổ rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách t ế bào, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nhân, thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế

tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học…

Song cách phân loại KS theo cấu trúc hóa học là khoa h ọc nhất vì nó giúp cho các nhà nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được công thức hóa học của nó

Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1)

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

1 KS có chứa đường trong

Dẫn xuất aminoacid Cycloserin

5 KS dị vòng chứa N Các KS nucleotid Polyoxin

6 KS dị vòng chứa O Các KS polyether Mononsin

7 Các KS nhân thơm Dẫn xuất benzen Chloramphenicol

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh [3], [8], [21]

Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được

thể hiện trong hình 1 dưới đây

Lọc, ly tâm

Chiết bằng dung môi hữu cơ

Dùng cột trao đổi ion…

Nhân giống trên thiết bị nhân giống Nhân giống trong phòng thí nghiệm Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm

Sinh khối

Lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm đã được kiểm nghiệm

Sản phẩm đóng gói

tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó Mỗi nhóm kháng sinh tác

dụng lên các đích khác nhau Có 6 kiểu chủ yếu:

• Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào

• Tác dụng lên màng nguyên sinh chất

• Tác dụng lên sự tổng hợp ADN

• Tác dụng lên sự tổng hợp protein

• Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp

• Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.5 Khái niệm về tính kháng kháng sinh [22]

Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong

một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu

Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh

nhất định nào đó Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng

1.1.6 Các ứng dụng của kháng sinh [8], [21]

• Trong lĩnh vực y học : Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn , nấm gây ra Ngày nay , một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung thư

• Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh

vực khác nhau:

- Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật:

Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt

- Trong tr ồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus

gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani

gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả

- Trong công nghi ệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực

phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh

subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra)

1.2 Đại cương về xạ khuẩn [4], [5], [9], [22]

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55% Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh Do có thể sinh tổng hợp được nhiều

sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều

Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là

do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [22]

Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát

triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn

ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn khá

đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà

thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có

các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ (Hình 2)

Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong

khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám…

1.2.2 Phân loại xạ khuẩn [6], [22]

Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đ ã được các nhà KH nghiên cứu phát triển để phân loại xạ khuẩn , phải kể đến khóa phân loại của Waksman , khóa phân loại Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn

(Actinomycetes) thành bộ Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn Bộ

Hình 2 : Khuẩn lạc xạ khuẩn

Actinomycetales được chia thành các họ : Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,

Streptomycetaceae, Mocromonosporaceae, Nocardiaceae…

Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3

Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP) do

Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn

thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae Trong khóa phân loại nà y, các đặc

trưng phân loại được sử dụng bao gồm : màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan , hình dạng chuỗi bào tử , bề mặt bào tử , khả năng tiêu thụ các nguồn carbon

1.2.3 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [7], [22]

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu

trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì

có tới 55% là từ Streptomyces

Đặc điểm hình thái: Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí

Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae …

Streptomyces

Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một

thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ

Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu,

xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của

xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha)

Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát

triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C,

pH tối thích thường là 6,8-7,5

Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố

hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid

1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1 M ục đích [8], [13]

Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp

1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên [13], [21]

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác Cần

phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp

Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo

1.3.3 Đột biến cải tạo giống [8], [10]

Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

Tác nhân hóa h ọc: 5-bromouracil, ethylenimin, 2-aminopurin, dimethylsulfat,

hydroxylamin…

Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β Tác nhân vật lý hay được

dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học các Tn, bacteriophage Mu,…

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết

hầu hết các vi sinh vật Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương)

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính,

kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [8], [12], [15]

Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa,

nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học Mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: bảo quản lạnh - cấy chuyền (bảo quản lạnh trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông

lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp)

Để giữ giống xạ khuẩn trong phňng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1 Khái ni ệm lên men [8], [22]

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng

Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng

Hình 4 : Giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn

1.4.2 Cá c phương pháp lên men [3], [8]

Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể

lỏng tùy loài VSV VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống

Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều

nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu

tư trang thiết bị ban đầu lớn

Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản

phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm

- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao

hiệu quả sử dụng bình lên men

- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng

thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình

- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau

những khoảng thời gian nhất định

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [12]

pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của

các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp

Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong

tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm phát Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí

mạnh là tốt

Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.5.1 Mục đích [8]

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp

Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm

1.5.2 Các phương pháp chiết tách [1], [2], [11], [17], [21]

Một số phương pháp chiết tách thường dùng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

- Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên cột…)

- Phương pháp tạo phức kết tủa

- Phương pháp chưng cất

Chiết xuất: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp

Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: Một pha lỏng và

một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thường

một pha là nước)

Phương pháp sắc ký:

Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một hỗn

hợp nhiều thành phần Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và

chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng

Cơ chế của sự phân tách là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh

và dung môi làm pha động

Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:

S ắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng

Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực

S ắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha

tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động

1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh [17], [19], [20]

1.6.1 Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau

Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi

trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở

của việc phân tích cấu trúc bằng IR

1.6.3 Phổ khối

Phổ khối là tập hợp các tín hiệu tương ứng với các ion- được thể hiện dưới dạng các pic có cường độ khác nhau Các tín hiệu này thu được khi các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối của máy khối phổ Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng các ion, phân tử, xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu hoặc dùng trong phân tích định lượng

1.7 Một số nghiên cứu liên quan

1.7.1 Điều hòa phân tử sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces [24]

Streptomyces là nguồn phổ biến nhất của thuốc kháng sinh Thông thường mỗi loài sản xuất một số thuốc kháng sinh với đặc điểm đặc trưng cho từng loài

Streptomyces coelicolor là một điển hình, tạo ra ít nhất năm loại thuốc kháng sinh khác nhau Chúng tôi xem xét các cơ chế điều hòa về sinh tổng hợp kháng sinh trong S

coelicolor và các Streptomyces không mô hình trong hướng các nghiên cứu gần đây Sinh tổng hợp của mỗi kháng sinh được xác định bởi một nhóm gen lớn, thường bao gồm cả gen điều tiết [CSR s] Đây là những điểm chính để kết nối với rất nhiều hệ thống quản

lý bảo tồn nói chung như theo dõi chức năng sinh lý của sinh vật, tổ chức sinh vật, mật độ sinh vật và môi trường để khởi phát và mức sản xuất của mỗi thuốc kháng sinh Một

số CSR cũng có thể nhạy cảm với các mức độ ở các loài khác nhau của các phối tử, bao

gồm cả các sản phẩm của quá trình riêng của mình, cũng như là các sản phẩm của con đường kháng sinh khác trong cơ thể, và đặc biệt là các phân tử nhỏ như gamma- butyrolactones Những tương tác này có thể dẫn đến sự tăng cường các chất chuyển tiếp

và các mạch liên hệ phức tạp giữa các con đường Các tín hiệu sinh lý và cơ chế điều tiết

có tầm quan trọng cho sự hoạt hóa của nhiều nhóm chuyển hóa thứ cấp trong sự phát

hiện của nhiều trình tự gen Streptomyces gần đây

1.7.2 Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp với những đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp [25]

Một chủng vi khuẩn Streptomyces sp CIMAP-A1 được phân lập từ rễ Phong lữ và

xác định bởi hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa và phân tử (16S trình tự gen rDNA) Nó

đã được tìm thấy có liên quan chặt chẽ nhất với S vinacendrappus, chủng NRRL-2363

với 99% trình tự giống nhau Chủng đã có hoạt động tiềm năng đối kháng (in vitro) chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng như Stemphylium sp., Botrytis cinerea,

Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum spp., Curvularia spp., Corynespora cassicola

và Thielavia basicola Các chất chuyển hóa trung gian ngoại bào được tạo ra bởi chủng trong dịch lọc nuôi cấy ức chế mạnh sự nảy mầm bào tử, phát triển của ống mầm của các bào tử nảy mầm và phát triển xuyên tâm của Alternaria alternata, Colletotrichum

acutatum, Curvularia andropogonis và Fusarium moniliforme Việc khai thác nuôi cấy trong dịch lọc bằng các dung môi và lọc bằng VLC và PTLC phương pháp luôn luôn mang lại 10 hợp chất chống nấm có thể chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật Các chủng có thể sản xuất siderophores và axit indole-3-acetic Chủng đã được tìm thấy để tăng cường sự tăng trưởng và sản xuất của Phong lữ Nó tăng 11,3% sinh khối chồi của Phong lữ và sản lượng dầu cần thiết 21,7%

1.7.3 Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S hygroscopius D1.5 [23]

S hygroscopius D1.5 đã được phân lập và nghiên cứu thấy nó có khả năng kháng cả nấm cả vi khuẩn Chủng này có thể sử dụng nguồn nitơ là arginine và nguồn cacbon là glycerin với nồng độ tối ưu lần lượt là 0,75 g/l; 11,5 g/l S.hygroscopius D1.5 là một

VSV mesophylic, sản xuất kháng sinh nhóm ester nonaromatic Trong nghiên cứu này,

VSV được sử dụng là B.subtilis và E.coli; sự tăng trưởng được đo bằng trọng lượng khô

của sinh khối (mg/50ml); hoạt tính kháng sinh được xác định bằng vòng vô khuẩn Ngoài

2 điều kiện dinh dưỡng trên, các thông số vật lý khác cũng được nghiễn cứu Kết quả thu được là: pH, nhiệt độ lên men và số ngày lên men tối ưu lần lượt là 7,0; 300

C; 7 ngày

Như vậy, nghiên cứu này đưa ra một cách để sản xuất kháng sinh từ S hygroscopius

D1.5 trong môi trường ít dinh dưỡng, nhiệt độ và pH kiểm soát được, từ đó góp phần

giảm giá thành sản phẩm

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: Chủng Streptomyces 155.29 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại Tây Nguyên

trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định

Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108

Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201

Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220

Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112

• Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: Thành phần các MT được trình bày ở bảng 2.3

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

• Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

• Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 2.4 ở trên

• Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,2mm

2.1.2 Máy móc thiết bị

• Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện

thế 220V

• Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

• Tủ ấm Memmert, Binder

• Tủ lạnh SamSung

• Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

• Tủ sấy SL shellab