Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155.29

B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ HỮU NGHỊ GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH NH STREPTOMYCES 155.29 KHA LUN TT NGHIP DƯC S H NI - 2013 B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ HỮU NGHỊ GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH NH STREPTOMYCES 155.29 KHA LUN TT NGHIP DƯC S Ngưi hưng dn: TS. Bùi Quang Phúc ThS. Lê Thị Thu Hương Nơi thc hin: B môn Vi sinh& Sinh hc Trưng Đại hc Dưc H Ni Viện sốt rét -KST-CT TW H NI - 2013 LI CẢM ƠN Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nht đn Thạc sĩ Lê Thị Thu Hương và Tin sĩ Bùi Quang Phúc đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hoàn thin kha lun này. Tôi xin chân thành cm ơn cc thy cô gio , cc cn b, k thut viên ging dạy, công tc tại B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trưng Đại hc Dưc Hà Ni, Vin sốt rét KST-CT TW đ gip đ tôi trong thi gian làm thc nghim. Cũng nhân dịp này tôi cũng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng toàn th cc thy cô gio trưng Đại hc Dưc Hà N i đ dạy d và tạo mi điu kin thun li cho tôi trong thi gian tôi hc tp tại trưng. Và cuối cng là li cm ơn tôi gi ti gia đnh và bạn b đ đng viên , giúp đ tôi trong suốt thi gian thc hin kha lun. Do thi gian làm thc nghim cũng như kin thc ca bn thân c hạn , khóa lun này cn c nhiu thiu st . Tôi rt mong nhn đưc s gp  ca cc thy cô , bạn b đ kha lun đưc hoàn thin hơn. Tôi xin chân thành cm ơn! Hà Ni, ngày 15, tháng 5, năm 2013 Sinh viên Lê Hu Nghị MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 3 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 4 1.1.5. Khái nim về tính kháng kháng sinh 5 1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh 5 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 6 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 6 1.2.2. Phân loại xạ khuẩn 6 1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces 7 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.3.1. Mục đích 8 1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngu nhiên 8 1.3.3. Đột biến cải tạo giống 8 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 9 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.4.1. Khái nim lên men 9 1.4.2. Các phương pháp lên men 10 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11 1.5.1. Mục đích 11 1.5.2. Các phương pháp chiết tách 12 1.6. Bưc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13 1.6.1. Phổ hồng ngoại 13 1.6.2. Phổ tử ngoại 13 1.6.2. Phổ khối 13 1.7. Một số nghiên cứu liên quan 14 1.7.1. Quy định phân tử của sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces 14 1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. vi những đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bnh trong nông nghip 14 1.7.3. Nghiên cứu mi trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius D1.5 15 CHƯƠNG II: ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CU 16 2.1. Nguyên vật liu, thiết bị 16 2.1.1. Nguyên vật liu 16 2.1.2. Máy móc thiết bị 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 19 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích 19 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 20 2.3. Phương pháp thc nghim 20 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20 2.3.3. Sàng lọc ngu nhiên 21 2.3.4. Đột biến 22 2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 24 2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24 2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lp mỏng 25 2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 26 2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 26 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26 CHƯƠNG III: KT QUẢ THỰC NGHIM VÀ NHN XÉT 27 3.1. Kết quả sàng lọc ngu nhiên 27 3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 27 3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 28 3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học 29 3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.5.1. Kết quả chọn môi trưng lên men chìm 30 3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men 31 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhit độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 32 3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 33 3.8. Kết quả sắc ký lp mỏng chọn h dung môi 34 3.9. Kết quả sắc ký cột 34 3.10. Kết quả đo nhit độ nóng chảy và bin giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được 36 KT LUN VÀ KIN NGHỊ 37 DANH MỤC CÁC CHỮ VIT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CW Thành t bào- Cell wall DMHC Dung môi hu cơ ĐB1 Đt bin 1 ĐB2 Đt bin 2 Gr Gram IR Hồng ngoại- Infrared ISP Chương trnh Streptomyces quốc t- International Streptomyces Project KS Kháng sinh MS Phổ khối- Mass Spectrometry MT Môi trưng MT2dt Môi trưng dịch th 2 SLNN Sàng lc ngu nhiên TB T bào TĐC Trao đổi cht VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vt UV T ngoại- Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bng 1: Phân loại các cht kháng sinh da theo cu trúc hóa hc. Bng 2.1: Cc vi khuẩn kim định. Bng 2.2: Cc MT nuôi cy xạ khuẩn. Bng 2.3: Các MT nuôi cy VSV kim định. Bng 2.4: Cc dung môi đ s dụng. Bng 3.1: Kt qu th HTKS sàng lc ngu nhiên. Bng 3.2: Kt qu th HTKS đt bin ln 1. Bng 3.3: Kt qu th HTKS đt bin ln 2 Bng 3.4: Kt qu th HTKS đt bin hóa hc. Bng 3.5: Kt qu chn môi trưng lên men (trên P.mirabilis). Bng 3.6: Kt qu chn chng lên men chìm. Bng 3.7: Ảnh hưởng ca pH đn đ bn kháng sinh (trên P.mirabilis). Bng 3.8: Ảnh hưởng ca nhit đ đn đ bn kháng sinh (trên P.mirabilis). Bng 3.9: Kt qu chn dung môi và pH chit (trên P.mirabilis ). Bng 3.10: Kt qu chn h dung môi chạy sc ký. Bng 3.11: Kt qu chạy sc kí ct ln 1 (trên P.mirabilis ). Bng 3.12: Kt qu chạy sc kí ct ln 2 (trên P.mirabilis ). Bng 3.13: Phổ IR. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp sn xut kháng sinh. Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn. Hình 3: Sơ b phân loại xạ khuẩn. Hình 4: Đưng cong sinh trưởng phát trin ca xạ khuẩn. Hình P1: Th HTKS bằng phương php khối thạch. Hình P2: Th HTKS bằng phương php ging thạch. Hình P3: Th HTKS bằng phương php khoanh giy lc. Hình P4: Phát hin vt sc ký bằng phương pháp hin hình VSV. Hình P5: Tinh ch kháng sinh bằng sc ký ct. Hình P6: Phổ t ngoại ca kháng sinh. Hình P7: Phổ hồng ngoại ca kháng sinh. Hình P8: Phổ khối (MS). [...]... chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.29 làm khóa luận tốt nghiệp Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Nghiên cứu các biện pháp nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh thu được - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1... của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau Có 6 kiểu chủ yếu: • Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào • Tác dụng lên màng nguyên sinh chất • Tác dụng lên sự tổng hợp ADN • Tác dụng lên sự tổng hợp protein • Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp • Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian 1.1.5 Khái niệm về tính kháng kháng sinh [22] Kháng thuốc... cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc • Tiến hành đột biến hóa học 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích • Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tối • Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất • Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết... nghiên cứu liên quan 1.7.1 Điều hòa phân tử sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces [24] Streptomyces là nguồn phổ biến nhất của thuốc kháng sinh Thông thường mỗi loài sản xuất một số thuốc kháng sinh với đặc điểm đặc trưng cho từng loài Streptomyces coelicolor là một điển hình, tạo ra ít nhất năm loại thuốc kháng sinh khác nhau Chúng tôi xem xét các cơ chế điều hòa về sinh tổng hợp kháng sinh trong... trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men [8], [22] 10 Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là một trong những... được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men • Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của kháng sinh và mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh Từ đó có những chú ý trong quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh •... - Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên 24 men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên. .. ether thơm Novobiocin 1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh [3], [8], [21] Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1 dưới đây 4 Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Nhân giống trong phòng thí nghiệm Nhân giống trên thiết bị nhân giống Lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khối Dịch lọc Chiết bằng... và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1 Mục đích [8] 12 Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết... ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn 11 Có 4 kiểu lên men chìm như sau: - Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định . 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.4.1. Khái nim lên men 9 1.4.2. Các phương pháp lên men 10 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng. thạch nghiêng thích hp, ct ống thạch nghiêng trong t lạnh và định kỳ 2-3 tháng cy lại 1 ln. 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1. Khái nim lên men [8], [22] 10 Lên men là. lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.5.1. Kết quả chọn môi trưng lên men chìm 30 3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men 31 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhit độ đến độ bền của kháng