trong dịch lọc
Dịch lọc được thử độ bền pH (ở các pH 3, 5, 7, 9, 11) và độ bền nhiệt (đun sôi cách thủy 30 phút, trực tiếp 10 phút). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và 3.8.
* Ảnh hưởng của pH: Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)
Mẫu thử
HTKS sau 1 ngày HTKS sau 5 ngày
P.mirabilis P.mirabilis D(mm) s D(mm) s pH 3 21,36 0,31 21,29 0,28 pH 5 21,44 0,31 21,45 0,33 pH 7 21,74 0,25 21,60 0,11 pH 9 21,31 0,19 21,20 0,14 pH 11 20,69 0,34 19,64 0,09
Nhận xét: Chủng Streptomyces 155.29 khá bền với pH từ acid đến trung tính, ít bền với pH base. Do đó bảo quản dịch lọc ở pH acid hoặc trung tính.
* Ảnh hưởng của độ bền nhiệt: Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis)
Thử nghiệm P.mirabilis
D(mm) s
Dịch lọc ở nhiệt độ thường 21.35 0.28
Dịch lọc đun sôi trực tiếp (10 phút) 21.52 0.18 Dịch lọc đun cách thủy ( 30 phút) 21.18 0.18
Nhận xét: Chủng streptomyces 155.29 khá bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh hầu như không thay đổi.
3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết
Thực hiện chiết dịch lọc với 4 dung môi: ethylacetat, butanol, butylacetat, dichloromethan ở 5 pH 3, 5, 7, 9, 11. Thử HTKS của pha nước và pha dung môi bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P.mirabilis )
pH Pha
Ethylacetat n-Butanol Butylacetat Chloroform
D (mm) s D (mm) s D (mm) s D (mm) s 3 Dung môi 21,28 0,23 21,54 0,31 16,55 0,17 17,61 0,23 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 14,47 0,19 15,59 0,18 5 Dung môi 21,67 0,17 21,67 0,25 17,23 0,18 17,53 0,26 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 13,75 0,12 15,61 0,19 7 Dung môi 21,89 0,14 21,66 0,18 17,36 0,11 16,43 0,08 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 13,95 0,43 14,53 0,41 9 Dung môi 21,33 0,15 21,56 0,20 15,50 0,20 16,67 0,33 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 14,57 0,42 15,00 0,19 11 Dung môi 16,62 0,28 16,83 0,17 15,15 0,12 15,29 0,28 Nước 0,00 0,00 0,00 0,00 14,58 0,18 14,49 0,23
Nhận xét: Dung môi Buthylacetat và Chloroform đều không chiết kiệt được kháng
sinh trong dịch lọc. Dung môi ethylacetal và n-butanol đều chiết kiệt kháng sinh trong dịch lọc ở các pH khác nhau, HTKS cũng tương đương nhau nhưng lựa chọn ethylacetat bởi vì khi chiết bằng n-butanol tạo rất nhiều nhũ tương, làm giảm hiệu suất chiết đáng kể. Ngoài ra, n-butanol là dung môi độc hơn so với ethylacetat.
HTKS khi chiết ở pH 7 có giá trị cao nhất.
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (Vi khuẩn sử dụng là P. mirabilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf
1 Chloroform: methanol: amoniac 25% 2: 2: 1 0,89 2 Butanol: ethanol: dimethylformamid 3: 1: 1 0,79 3 Butylacetat: aceton: triethylamin 1: 2: 1 0,84 4 Ethylacetat:propanol:dichloromethan 2: 2: 1 0,83
Nhận xét: Cả 4 hệ đều cho kết quả có vết kháng sinh. Hệ 3 có khả năng tách tốt hơn cả vì vết hiện hình VSV có dạng vết kéo dài, trong khi với các hệ 1, 2, 4 vết gần như hình tròn.
3.9. Kết quả sắc ký cột
Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu lấy kháng sinh tinh khiết.
Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 5,5 lít, đem chiết bằng ethylacetat ở pH 7 thu được 820 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất bằng máy cất quay chân không Buchi Waterbath, thu được 0,7045g bột kháng sinh thô.
Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel với hệ dung môi 3. Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (VSV kiểm định P. mirabilis). Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 (trên P.mirabilis)
Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s
1 0,00 0,00 12 10,05 0,21
2 24,45 0,36 13 10,03 0,33
4 23,37 0,34 15 9,51 0,22 5 22,75 0,43 16 9,16 0,18 6 22,33 0,24 17 8,66 0,34 7 21,14 0,18 18 8,27 0,19 8 19,49 0,31 19 8,23 0,20 9 17,23 0,34 20 8,12 0,14 10 16,25 0,24 21 7,83 0,14 11 10,21 0,12 22-30 0,00 0,00
Nhận xét: Có ít nhất 2 chất có HTKS trong bột kháng sinh thô thu được. Có thể phân đoạn kháng sinh chính là các phân đoạn từ 2-10. Gộp các phân đoạn lại đem cô chân không, thu được: 0,5148g bột kháng sinh. Cho lượng bột này chạy qua cột Silicagel với hệ dung môi ethylacetat: n-hexan: methanol (15:6:1). Lấy 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2ml vào ống nghiệm sạch. Thử HTKS từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc (trên P. mirabilis) và Rf mỗi phân đoạn. Kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 (trên P.mirabilis)
Phân đoạn
HTKS Rf Phân
đoạn
HTKS Rf
D(mm) s Vết 1 Vết 2 D(mm) s Vết 1 Vết 2
1 26,41 0,28 0,82 13 23,37 0,17 0,83 0,68 2 26,65 0,24 0,80 14 23,13 0,06 0,82 0,67 3 25,63 0,22 0,83 15 22,82 0,12 0,82 0,67 4 25,57 0,23 0,82 16 22,52 0,14 0,81 0,68 5 25,54 0,09 0,81 17 22,51 0,25 0,82 0,66 6 25,51 0,22 0,81 18 21,72 0,26 0,67 7 24,47 0,23 0,80 19 21,55 0,23 0,66 8 24,43 0,41 0,81 20 20,61 0,14 0,67 9 24,40 0,23 0,83 21 20,29 0,17 0,66 10 24,32 0,26 0,82 0,67 22 19,36 0,21 0,67
11 24,25 0,19 0,83 0,66 23 18,85 0,23 0,66
12 23,45 0,29 0,82 0,68 24-30 0,00 0,00
Nhận xét: Phân đoạn chính là phân đoạn từ 1-9, được gộp lại, đem cô chân không, kết tinh được 0,1748 g KS1 tinh khiết. Phân đoạn từ 18-23 cũng được gộp lại, đem cô chân không, kết tinh thu được 0,0529g KS2 tinh khiết. Như vậy hiệu suất tinh chế đạt 32,32%.
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức
đặc trưng của kháng sinh thu được
Nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh: 232,6ºC.
Phổ hấp thụ hồng ngoại, tử ngoại của kháng sinh sinh tổng hợp bởi Streptomyces
155.29 được giới thiệu ở phần phụ lục hình P6, P7.
Phổ tử ngoại (hình P6): Cho các đỉnh hấp thụ ở: 212nm, 239nm và 442 nm. Từ
đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố O, N, halogen…, hoặc kết hợp các đặc điểm trên.
Phổ hồng ngoại (hình P7): Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR có thể dự đoán trong cấu trúc phân tử kháng sinh có các nhóm chức amino, hydroxyl, carbonyl, amid, nitro, imin… Các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 3.13.
Bảng 3.13: Phổ IR
λ (cm-1
) Nhóm chức đặc trưng
3442 Đặc trưng cho nhóm chức Amin bậc 2 3057 Đặc trưng cho cấu trúc alken và vòng thơm 2964, 2928 Đặc trưng cho nhóm chức alcol và phenol 1745 Chứa gốc acid carboxylic, ester
1646 Đặc trưng cho cấu trúc alken 1300,1270,
1194, 1097
Đặc trưng cho các nhóm chức alcol, ether, acid carboxylic,ester
Phổ khối (hình P8 ): Khối lượng phân tử dự kiến của kháng sinh thu được là 1280,1 đvC.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của khóa luận tốt nghiệp. Các kết luận cụ thể như sau:
• Qua 2 lần đột biến bằng UV và 1 lần đột biến hóa học thì hoạt tính kháng sinh của
Streptomyces 155.29tăng lên đáng kể.
• Tìm được MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất là MT2 và MT lên men chìm tốt nhất với chủng Streptomyces 155.29 là MT2dt.
Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi ethylacetat ở pH 7 cho hiệu quả tốt nhất.
• Kháng sinh do Streptomyces 155.29 sinh tổng hợp có một số đặc điểm như sau: - Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, trên cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn
Gram(-),
- Tương đối bền với nhiệt độ,
- Bền với pH acid và trung tính, ít bền với pH base,
- Có ít nhất 2 thành phần hoạt động trong kháng sinh thô thu được, - Hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt khoảng 32,32%
- Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 232,6ºC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại. Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố; các nhóm chức có trong kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, imin, amin, nitro, amid.
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu hơn theo các hướng sau:
• Tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác tên khoa học của Streptomyces
155.29.
• Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 155.29 (bằng UV, bằng hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang,…) để tạo ra chủng có khả năng siêu sinh tổng hợp kháng sinh.
• Khảo sát tìm điều kiện lên men tốt nhất để nâng cao hiệu suất tinh chế và tạo kháng sinh tinh khiết.
• Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo ra kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao hơn. Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu hơn.
• Tiến hành cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa,… để xác định chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh do Streptomyces 155.29sinh tổng hợp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng trong kiểm nghiệm và độc chất, Trung tâm Thông tin- Thư viện ĐH Dược, Hà Nội, tr. 40-41, 49-59.
2. Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học kỹ
thuật, Hà Nội, tr. 167-172.
3. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 11-16.
4. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 15-16, 50-56.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr. 38-67.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu- Phân loại xạ khuẩn
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm.
7. Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng
sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên, Luận văn thạc sỹ Sinh học,
trường Đại học Sư Phạm, Thái Nguyên, tr.3-16.
8. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.42-54.
9. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 7-37. 10.Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp.
11.Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr.9-27.
12.Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 35-37.
13.Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr.40-52.
14.Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 14-57.
15.Trịnh Thị Thịnh (2009), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 80.259, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.
16.Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập 2..
17.Bộ môn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 23-69, 125-147, 215-219, 318.
18.Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 130-142. 19.Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr.105-119. 20.Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 68-82,
115-133.
21.Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr.26-40, 81-93.
22.Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, tr. 22-98. Tiếng Anh
23.Barun K. Bhattacharyya, Sushil C. Pal, Sukanta K. Sen (1998), “Antibiotic production by Streptomyces hygroscopius D1.5: cultural efect”, Revista de Microbiologia, 29 (3), pp.37-39.
24.Liu G, Chater KF, Chandra G, Niu G, Tan H (2013), Molecular regulation of
antibiotic biosynthesis in streptomyces, State Key Laboratoryof Microbial
Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.
25.Alam M, Dharni S, Abdul-Khaliq, Srivastava SK, Samad A, Gupta MK (2012), A promising strain of Streptomyces sp. with agricultural traits for growth promotion
and disease management, Department of Plant Pathology, CSIR-Central Institute
PHỤ LỤC
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch
Hình P3: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc
Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son DT: 0912140352 Mail: sonhuco@yahoo.com
Resolution: 4cm-1
BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN
MAU NGHI-155.29 Date: 3/13/2013 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600.0 0.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 103.1 cm-1 %T 3442 3057 2964 2928 1745 1646 1583 1478 1410 1363 1318 1300 1270 1194 1097 949 820 677 640
