Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S.hygroscopius

S. hygroscopius D1.5 đã được phân lập và nghiên cứu thấy nó có khả năng kháng cả nấm cả vi khuẩn. Chủng này có thể sử dụng nguồn nitơ là arginine và nguồn cacbon là glycerin với nồng độ tối ưu lần lượt là 0,75 g/l; 11,5 g/l. S.hygroscopius D1.5 là một VSV mesophylic, sản xuất kháng sinh nhóm ester nonaromatic. Trong nghiên cứu này, VSV được sử dụng là B.subtilis và E.coli; sự tăng trưởng được đo bằng trọng lượng khô của sinh khối (mg/50ml); hoạt tính kháng sinh được xác định bằng vòng vô khuẩn. Ngoài 2 điều kiện dinh dưỡng trên, các thông số vật lý khác cũng được nghiễn cứu. Kết quả thu được là: pH, nhiệt độ lên men và số ngày lên men tối ưu lần lượt là 7,0; 300

C; 7 ngày. Như vậy, nghiên cứu này đưa ra một cách để sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius

D1.5 trong môi trường ít dinh dưỡng, nhiệt độ và pH kiểm soát được, từ đó góp phần giảm giá thành sản phẩm.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: Chủng Streptomyces 155.29 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại Tây Nguyên.

 Chủng vi sinh vật kiểm định: Do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định

Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)

Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108

Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201

Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220

Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112

 Môi trường

• Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Thành phần các MT được trình bày ở bảng 2.2.

• Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng loại bỏ thạch.

• Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: Thành phần các MT được trình bày ở bảng 2.3.

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút.

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần Đơn vị MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7

Tinh bột g 2 2 2.4 2

Lactose g 3

Glucose g 2 1

Cao ngô g 0,5 0,5

Bột đậu tương g 1,5

Cao thịt g 0,3 0,3 Pepton g 0,3 0,5 KNO3 g 0,1 KCl g 0,05 NaNO3 g 0,2 NH4NO3 g 0,2 0,2 CaCO3 g 0,3 0,4 0,4 0,2 (NH4)2SO4 g 0,2 FeSO4.7H2O g 0,01 K2HPO4 g 0,05 0,1 0,1 0,05 MgSO4.7H2O g 0,05 0,05 0,25 0,15 NaCl g 0,05 0,1 0,5

Cao nấm men g 0,5

Thạch g 1,8 2 2 2 2 2 1,8

Nước ml 100 100 100 100 100 100 100

pH 6,8-7,2

Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần NaCl % Cao thịt % Pepton % Thạch % Nước pH MT canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100 7,0-7,4 MT thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,8 100  Dung môi

Bảng 2.4: Giới thiệu các dung môi sử dụng các nghiên cứu cùng các đặc trưng cơ bản của chúng.

Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng

Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C)

Aceton 0,79 56 Acetonitril 0,782-0,783 80-82 n-Butanol 0,81 116-118 Butylacetat 0,880-0,885 117-118 Cloroform 1,470-1,480 60-62 Diclorometan 1,32 40 Dimethylformamid 0,95 153 Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,889-0,901 70,4 NH4OH 25% 0,880 n-hexan 0,6548 69 Methanol 0,791-0,793 64,5 Triethylamin 0,726-0,728 90  Vật liệu chạy sắc ký

• Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

• Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 2.4 ở trên

• Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,2mm

2.1.2. Máy móc thiết bị

• Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.

• Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

• Tủ ấm Memmert, Binder

• Tủ lạnh SamSung

• Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

• Lò vi sóng Whirlpool

• Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

• Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

• Cân phân tích Sartorius BP 121 S

• Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

• Máy cất quay Buchi Waterbath B480

• Kính hiển vi điện tử

• Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

• Hộp Petri đường kính 9cm

• Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống

• Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 155.29.

• Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G(+), 1 vi khuẩn G(+)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau.

• Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.

• Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc.

• Tiến hành đột biến hóa học

2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

• Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tối.

• Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.

• Tìm hệ dung môi khai triển có khả nãng tách hỗn hợp kháng sinh tối thích.

• Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

• Xác định nhiệt độ nóng chảy

• Đo phổ IR, phổ UV, phổ khối.

2.3. Phương pháp thực nghiệm

2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

• Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.

• Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.

2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

• Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.

• Tiến hành:

- Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106

-108 tế bào/ml.

- Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105

tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.

- Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã

được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định. (Xem hình P3 ở phụ lục).

Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV

Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng. (Xem hình P2).

- Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.

- Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = − = = − ∑ ∑ Trong đó:

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

i

D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3).

2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6

bằng nước vô trùng.

• Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

• Sàng lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.

2.3.4. Đột biến

• Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dung 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6

làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng.

• Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1

đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

bằng nước cất vô trùng.

• Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2):

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

Pha hỗn dịch bào tử : Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.29 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng , lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó lấy 1ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6

bằng nước vô trùng.

Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6

, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.

Đột biến bằng acid ni trơ: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1

cho thêm 0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N , rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

.

Phân tán bào tử sau đột biến , tính toán kết quả, chọn lọc ngẫu nhiên các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV.

• Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng

10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4

và 10-5vào các đĩa Petri có chứa MT2, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ

ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

% độ sống sót =

0

N Nm

x 10-6+k x 100% Trong đó: Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến, No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng, 10-k: Nồng độ hỗn dịch bào tử.

• Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

% biến đổi hoạt tính = i 100%

o

D D ×

Trong đó:

i

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến,

o

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.

• Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

• Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề

mặt tối thích cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng.

• Tiến hành

- Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 155.29 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.

- Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để

chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên

men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.

2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men

• Mục đích:Xác định khả năng chịu nhiệt của kháng sinh và mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh. Từ đó có những chú ý trong quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh.

• Tiến hành:

- Thử độ bền nhiệt: Dịch lọc được phân vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 7ml.

Một ống được đun sôi trực tiếp 10 phút, một ống được đun sôi cách thủy 30 phút, một ống để ở nhiệt độ bình thường. Sau khi ba ống trở về nhiệt độ bình thường, đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch.

- Thử độ bền pH: Dịch lọc được cho vào 5 ống nghiệm (làm 3 dãy song song),

mỗi ống khoảng 7ml. Điều chỉnh pH trong các ống lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 1 ngày và 5 ngày, chỉnh pH mỗi ống về pH trung tính, thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Theo dõi sự thay đổi HTKS.

2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ

• Mục đích:Xác định dung môi và pH chiết tối thích cho dịch lọc.

• Tiến hành:Dùng phương pháp chiết 1 lần.

- Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M.

- Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với một số dung môi khác nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 1 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.

- Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy.

2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng

• Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định

kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.

• Tiến hành:

- Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.

- Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi.