Nguyễn thị thanh huyền nghiên cứu chế tạo cao chiết và ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng của cao chiết lá phèn đen khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG CỦA CAO CHIẾT LÁ PHÈN ĐEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN Mã sinh viên: 1801318 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG CỦA CAO CHIẾT LÁ PHÈN ĐEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành kháo luận, em xin giúp đỡ quý báu thầy cô giáo cùn bạn bè giá đình Với lịng biết ơn kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Thái Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội – người tận tình hướng dẫn, quan tâm bảo sát tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới: Ban Giám Hiệu phòng ban, thầy cô giáo, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, người tạo điều kiện, tận tình dạy bảo cho em suốt năm học vừa qua Các bạn làm khóa luận khóa 73 Nguyễn Thị Vân Anh, Đỗ Trang Ngân, Lý Phương Linh nhóm nghiên cứu mơn Dược học cổ truyền, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè ln khích lệ, giúp đỡ cổ vũ em suốt thời gian qua Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân hạn chế nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý, chỉnh sửa q thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Phèn đen 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố, sinh thái 1.1.4 Bộ phận dùng 1.2 Tổng quan Phèn đen 1.2.1 Thành phần hóa học .3 1.2.2 Tác dụng dược lý 1.2.3 Công dụng 1.3 Acid gallic .8 1.4 Phương pháp hỏa chế 1.4.1 Đại cương .9 1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến vị thuốc 10 1.5 Tổng quan cao đặc 11 1.5.1 Định nghĩa 11 1.5.2 Phương pháp điều chế cao đặc .11 1.5.3 Yêu cầu chất lượng với cao đặc 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .13 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13 2.1.2 Thiết bị, máy móc 13 2.1.3 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp định lượng acid gallic cao chiết Phèn đen .14 2.3.2 Quy trình chiết xuất định lượng acid gallic chiết Phèn đen xử lý nhiệt .16 2.3.3 Phương pháp khảo sát yếu tố trình xử lý nhiệt Phèn đen ảnh hưởng đến chất lượng cao chiết Phèn đen 16 2.3.4 Phương pháp tối ưu hóa yếu tố trình xử lý nhiệt Phèn đen tạo cao chiết từ Phèn đen 17 2.3.5 Điều chế cao đặc Phèn đen 18 2.3.6 Đánh giá số tiêu hai mẫu cao điều chế 19 2.3.7 Phương pháp xử lí số liệu 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid gallic cao chiết Phèn đen 23 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic 24 3.2 Kết khảo sát yếu tố trình xử lý nhiệt Phèn đen ảnh hưởng đến chất lượng cao chiết Phèn đen 27 3.2.1 Thời gian sấy .27 3.2.2 Nhiệt độ sấy 28 3.3 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu .29 3.3.1 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm .29 3.3.2 Kết tối ưu hóa q trình 30 3.4 Kết điều chế cao đặc Phèn đen 32 3.4.1 Kết cao đặc điều chế 32 3.4.2 Xác định độ ẩm hiệu suất 32 3.5 Đánh giá số tiêu hai mẫu cao điều chế .32 3.5.1 Định lượng acid gallic 32 3.5.2 Định lượng polyphenol toàn phần .33 3.5.4 Tác dụng chống oxy hóa invitro 34 3.6 Bàn luận 36 3.6.1 Về phương pháp định lượng acid gallic cao chiết chiết Phèn đen 36 3.6.2 Về tối ưu hóa điều kiện xử lý nhiệt tạo cao chiết từ Phèn đen 37 3.6.3 Về đánh giá số tiêu hai mẫu cao điều chế 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 Kết luận 39 Đề xuất .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKLM Sắc kí lớp mỏng TT Thuốc thử YHCT Y học cổ truyền OFAT One factor at the time STT Số thứ tự EtOH Ethanol MeOH Methanol GA Acid gallic DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic 20 Bảng 2.2 Xây dựng dãy dung dịch thử 22 Bảng 2.3 Hỗn hợp phản ứng 22 Bảng 3.1 Kết tính phù hợp hệ thống phương pháp định lượng 24 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng acid gallic 25 Bảng 3.3 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng 26 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ phương pháp định lượng 27 Bảng 3.5 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 29 Bảng 3.6 Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình biểu thị mối tương quan hàm lượng acid gallic chiết dược liệu với biến đầu vào 31 Bảng 3.7 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm (n=2) 31 Bảng 3.8 Kết xác định độ ẩm hiệu suất điều chế cao 32 Bảng 3.9 Kết định lượng acid gallic cao đặc điều chế 32 Bảng 3.10 Độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn 33 Bảng 3.11 Hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu cao chiết 34 Bảng 3.12 Độ hấp thụ quang % ức chế gốc tự cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt xử lý nhiệt .34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo tanin pyrogallic Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo tanin pyrocatechic Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo acid gallic Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo số triterpenoid Hình 1.5 Công thức cấu tạo số sterol Hình 1.6 Công thức cấu tạo số flavonoid Hình 1.7 Công thức cấu tạo số thành phần khác Hình 2.1 Quy trình điều chế cao đặc Phèn đen xử lý nhiệt 18 Hình 2.2 Quy trình điều chế cao đặc Phèn đen khơng xử lý nhiệt 18 Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần 20 Hình 3.1 Hình ảnh phổ acid gallic khoảng 220 – 350 nm 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu mẫu thử (từ 3-9 phút) 24 Hình 3.3 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng GA 25 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ sấy 28 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian sấy 28 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng acid gallic chiết dược liệu với biến đầu vào 30 Hình 3.7 Hình ảnh cao đặc điều chế 32 Hình 3.9 Đồ thị thể khả chống oxy hóa cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt 35 Hình 3.10 Đồ thị thể khả chống oxy hóa cao chiết Phèn đen xử 35 lý nhiệt 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vị thuốc có chứa nhiều nhóm thành phần hóa học khác nhau, có tác dụng khác Thậm chí đối lập Đa số thành phần hoạt chất có hàm lượng nhỏ Vì vậy, chế biến khơng hợp lý có nguy làm giảm tác dụng điều trị tăng tác dụng không mong muốn vị thuốc, Hỏa chế - ba phương pháp (thủy chế, thủy hỏa hợp chế) sử dụng rộng rãi để chế biến vị thuốc; thực chất sử dụng tác động trực tiếp gián tiếp “nhiệt khơ” đến dược liệu Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn phương pháp chế biến khác (mức nhiệt độ thời gian khác nhau) Các công trình nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến thành phần hóa học cho thấy: nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng thành phần vị thuốc (thay đổi chất lượng chất chuyển hóa sang chất khác, ) Phèn đen loài mọc hoang phổ biến Việt Nam, dân gian Phèn đen biết đến dược liệu quý với tác dụng nhiệt, giải độc, sát khuẩn, tiêu viêm, chữa mụn nhọn, chữa tiêu chảy, giun sán, Các nghiên cứu thực nghiệm đại tác dụng sinh học tiềm Phèn đen tính kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa Điều cho thấy Phèn đen loại dược liệu tiềm để phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa từ thiên nhiên với giá thành rẻ Tuy nhiên loại dược liệu có số lượng dồi giá thành rẻ lại chưa khai thác tiềm Thành phần hóa học Phèn đen xác định chứa nhóm chất tanin, flavonoid, đường khử, sterol Trong đó, tanin gallic acid gallic góp phần mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm cho Phèn đen Tiêu chí để đánh giá hàm lượng thành phần dựa vào hàm lượng acid gallic Phèn đen Để hướng tới phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm từ Phèn đen, việc nghiên cứu điều chế dạng bào chế cho dịch chiết dược liệu cần thiết, cao chiết dạng bán thành phẩm trung gian để tiếp tục chuyển sang dạng bào chế khác Trong trình bào chế cao, có nhiều yếu tố ảnh hưởng nhiệt độ xử lý dược liệu tác động không nhỏ đến chất lượng cao chiết Từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo cao chiết ảnh hưởng nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng cao chiết phèn đen” đề xuất nghiên cứu với mục tiêu: Khảo sát tối ưu điều kiện xử lý nhiệt dược liệu tạo cao chiết Phèn đen Điều chế cao đặc Phèn đen theo thông số tối ưu 3.4 Kết điều chế cao đặc Phèn đen 3.4.1 Kết cao đặc điều chế Hình 3.7 Hình ảnh cao đặc điều chế (xử lý nhiệt không xử lý nhiệt) Nhận xét: Cao đặc chất đặc quánh, dễ hút ẩm để ngồi khơng khí Màu nâu đen, thơm, mùi thơm đặc trưng, vị đắng, chát 3.4.2 Xác định độ ẩm hiệu suất - Tiến hành: theo mục 2.3.5.2 2.3.5.3 - Kết trình bày theo bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết xác định độ ẩm hiệu suất điều chế cao Mẫu cao Cao đặc Phèn đen xử lý nhiệt Cao đặc Phèn đen không xử lý nhiệt Khối lượng cao trước sấy (g) Khối lượng cao sau sấy (g) Độ ẩm (%) 2,5043 2,0478 18,23 2,5024 2,0432 18,35 2,5006 2,0485 18,08 Trung bình 19,10 18,22 2,5014 2,0034 19,91 2,5038 2,0070 19,84 2,5029 2,0091 19,73 Trung bình Hiệu suất (%) 18,56 19,83 3.5 Đánh giá số tiêu hai mẫu cao điều chế 3.5.1 Định lượng acid gallic - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.4 - Tiến hành: theo mục 2.3.6.1 - Kết quả: trình bày theo bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết định lượng acid gallic cao đặc điều chế Nhận xét: Hàm lượng acid gallic chiết dược liệu 5,414 mg/g Hàm lượng 93,20% hàm lượng acid gallic chiết dược liệu dự đoán từ tối ưu 32 Mẫu cao Cao đặc Phèn đen xử lý nhiệt Cao đặc Phèn đen không xử lý nhiệt Hàm lượng acid Hàm lượng acid gallic gallic cao đặc (mg/g) chiết dược liệu (mg/g) Khối lượng cao Độ ẩm cao (%) 0,1002 18,22 28,548 0,1015 18,22 28,281 0,1027 18,22 28,213 Trung bình ± SD 28,348 ± 0,177 0,1028 19,83 20,537 0,1035 19,83 20,232 0,1008 19,83 20,507 Trung bình ± SD 5,414 3,791 20,426 ± 0,168 hóa xử lý nhiệt Điều cho thấy nâng quy mơ quy trình lên 10 lần hàm lượng acid gallic chiết không bị ảnh hưởng nhiều Hàm lượng acid gallic cao Phèn đen xử lý nhiệt (28,348 mg/g cao) cao mẫu cao Phèn đen không xử lý nhiệt (20,426 mg/g cao) Hàm lượng acid gallic cao tăng lên 38,78% sau xử lý nhiệt điều kiện tối ưu Hàm lượng acid gallic chiết dược liệu xử lý nhiệt 5,414 mg/g cao so với dược liệu không xử lý nhiệt 3,791 mg/g dược liệu Hàm lượng acid gallic tăng thêm 42,81% sau xử lý nhiệt điều kiện tối ưu 3.5.2 Định lượng polyphenol toàn phần - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.4 - Tiến hành: theo mục 2.3.6.2 - Kết quả: Xây dựng đường chuẩn acid gallic: Nồng độ chuẩn gốc Cgốc = 1060 µg/ml Bảng 3.10 Trình bày giá trị đo độ hấp thụ cực đại dãy dung dịch chuẩn acid gallic bước sóng 765 nm Bảng 3.10 Độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn Mẫu chuẩn C1 C2 C3 C4 C5 Nồng độ lý thuyết 20 30 40 50 60 Nồng độ chuẩn thực tế 21,20 31,80 42,40 53,00 63,60 Độ hấp thụ ABS 0,286 0,411 0,546 0,658 0,775 Dựa kết độ hấp thụ mẫu chuẩn bước sóng 765nm, xây dựng đường chuẩn hình sau: 33 1.0 y = 0,0116x + 0,0452 r² = 0,9989 Độ hấp thụ 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 20 40 Nồng độ (µg/ml) 60 80 Hình 3.8 Đường biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ acid gallic chuẩn Kết định lượng polyphenol toàn phần mẫu cao thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu cao chiết Cao xử lý nhiệt Cao không xử lý nhiệt Khối lượng cao đem định lượng (g) 0,1075 0,1003 Độ ẩm cao (%) 18,22 19,83 Hàm lượng polyphenol 342,44 326,20 toàn phần (mg GA/g cao) Nhận xét: Hàm lượng polyphenol toàn phần cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt (342,44 mg GA/g cao) cao cao chiết không xử lý nhiệt (326,20 mg GA/g cao) 3.5.4 Tác dụng chống oxy hóa invitro - Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc điều chế mục 3.4 - Tiến hành: theo mục 2.3.6.3 - Kết quả: Xây dựng dãy dung dịch thử Nồng độ dung dịch thử ban đầu  Đối với mẫu cao chiết không xử lý nhiệt C không xử lý nhiệt = 10030 µg/ml  Đối với mẫu cao chiết xử lý nhiệt C xử lý nhiệt = 10750 µg/ml Kết đo quang mẫu thử chứng thể bảng 3.10 Bảng 3.12 Độ hấp thụ quang % ức chế gốc tự cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt xử lý nhiệt 34 Mẫu cao Cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt Cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt Mẫu thử T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 Nồng độ (µg/ml) 107,50 134,38 268,75 537,50 806,25 100,30 125,38 250,75 501,50 752,25 Athử 0,548 0,537 0,487 0,295 0,173 0,559 0,542 0,458 0,350 0,247 Achứng 0,577 0,577 IC50 (µg/ml) I (%) 5,03 6,93 15,60 48,87 70,02 3,12 6,07 20,62 39,34 57,19 532,07 669,48 I (% ức chế) 80% y = 0,2614ln(x) - 1,2008 R² = 0,9771 60% 40% 20% 0% 100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml) 600 700 800 Hình 3.9 Đồ thị thể khả chống oxy hóa cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt 80% y = 0,3201ln(x) - 1,5092 R² = 0,9265 I (% ức chế) 60% 40% 20% 0% -20% 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.10 Đồ thị thể khả chống oxy hóa cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt Nhận xét: 35 % ức chế gốc tự cao chiết Phèn đen không xử lý nhiệt phụ thuộc vào nồng độ theo đường thẳng y = 0,2614ln(x) - 1,2008 với R² = 0,9771, có mối tương quan chặt chẽ % ức chế gốc tự nồng độ cao không xử lý nhiệt % ức chế gốc tự cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt phụ thuộc vào nồng độ theo đường thẳng y = 0,3201ln(x) - 1,5092 với R² = 0,9265, có mối tương quan chặt chẽ % ức chế gốc tự nồng độ cao xử lý nhiệt Kết chống oxy hóa mẫu cao thể bảng 3.12 cho thấy % ức chế gốc tự tỷ lệ thuận với nồng độ cao, tức nồng độ cao lớn khả chống oxy hóa cao tăng Hiệu loại bỏ gốc tự cao chiết Phèn đen xác định thông qua giá trị IC50 trình bày bảng 3.12, cho thấy khả chống oxy hóa cao chiết Phèn đen khơng xử lý nhiệt (IC50= 669,48 µg/ml) thấp so với cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt (IC50= 532,07 µg/ml) 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về phương pháp định lượng acid gallic cao chiết chiết Phèn đen Theo nghiên cứu khoa học công bố chất phân lập từ Phèn đen nghiên cứu tác dụng sinh học Phèn đen, nhận thấy có phù hợp nghiên cứu khoa học đại với cơng dụng đặc tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Phèn đen biết đến dân gian Trong đó, thành phần acid gallic tannin gallic biết đến có tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa phân lập từ Phèn đen Trong khóa luận “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học cao chiết từ Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir thu hái Bắc Giang” dược sĩ Hoàng Thị Mỹ Linh – Đại học Dược Hà Nội, sử dụng phương pháp sắc ký điều chế phân lập chất HL-65 (chất cho vết rõ đậm mỏng silicagel) Chất HL-65 sau xác định acid gallic Từ lý cho thấy, acid gallic tannin gallic hoạt chất liên quan đến tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Phèn đen Do đó, lựa chọn phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để tiến hành nghiên cứu định lượng acid gallic Phèn đen phương pháp phổ biến sử dụng để định lượng acid gallic, đồng thời phương pháp có độ nhạy cao, cho kết xác Tham khảo quy trình định lượng acid gallic dược liệu Ngũ Bội tử Dược điển Trung Quốc 2015 Dược điển Việt Nam V để tiến hành khảo sát kết điều kiện sắc ký lựa chọn sau:  Cột: C18 (250  4,6 mm; m) 36  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% = 15 : 85  Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 272 nm  Thể tích tiêm: µl Q trình thẩm định phương pháp định lượng acid gallic cao chiết Phèn đen tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ xác (độ lặp lại, độ xác trung gian), độ đạt giới hạn yêu cầu Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hồn tồn xác 3.6.2 Về tối ưu hóa điều kiện xử lý nhiệt tạo cao chiết từ Phèn đen Về việc lựa chọn phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD: Các yếu tố nhiệt độ sấy, thời gian sấy biến liên tục Do đó, khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố cần làm nhiều thí nghiệm, gây tốn Vì vậy, phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng kết hợp để rút gọn thí nghiệm cho kết có độ xác, tin cậy cao Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD cho phép đánh giá đầy đủ xác vai trị yếu tố tới biến đầu với số lượng thí nghiệm giảm đáng kể so với mơ hình khác phương pháp đáp ứng bề mặt (RSD), giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức chi phí [60] Về việc lựa chọn khảo sát, tối ưu hàm lượng acid gallic: Trong Phèn đen, acid gallic tanin gallic thành phần mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Tiêu chí dùng để đánh giá hàm lượng thành phần Phèn đen hàm lượng acid gallic Vì hàm lượng acid gallic lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng trình xử lý nhiệt đến chất lượng cao chiết Phèn đen nghiên cứu Về việc lựa chọn yếu tố trình xử lý nhiệt để tối ưu:  Lựa chọn nhiệt độ sấy Nhiệt độ khác ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất dược liệu Xử lý nhiệt làm giảm tỷ lệ nước dược liệu, kích thích mơ thực vật sống tiếp tục sản sinh hoạt chất q trình sấy, cịn làm ảnh hưởng đến độ bền tế bào dược liệu dẫn đến ảnh hưởng khả giải phóng hoạt chất Vì cần khảo sát tìm nhiệt độ sấy phù hợp Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát nhiệt độ: 80℃, 100℃, 120℃, 130℃, 140℃, 150℃,160℃, 180℃, 200℃ (các mức nhiệt tương đương các phương pháp theo YHCT)  Lựa chọn thời gian sấy 37 Thời gian sấy ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất dược liệu Thời gian ngắn chưa đủ để làm thay đổi đáng kể hàm lượng hoạt chất, thời gian dài khiến hoạt chất bị phân hủy Vì vậy, cần phải khảo sát thời gian sấy để lựa chọn thời gian sấy thích hợp để thu lượng hoạt chất cao Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khoảng thời gian sấy: phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút Các sai số xây dựng khảo sát: Các sai số giải thích số liệu thực nghiệm cịn có nhiều sai số Phần lớn sai số xảy q trình thực nghiệm đến từ bước cô dịch bị bám lại dụng cụ Ngồi cịn có sai số thiết bị, thao tác người thực 3.6.3 Về đánh giá số tiêu hai mẫu cao điều chế Về hàm lượng acid gallic Hàm lượng acid gallic cao phèn đen không xử lý nhiệt thấp so với cao Phèn đen xử lý nhiệt Hàm lượng acid gallic chiết dược liệu phèn đen không xử lý nhiệt (sống) thấp so với dược liệu xử lý nhiệt Hàm lượng lượng acid gallic tăng lên sau xử lý nhiệt giải thích q trình giải phóng acid gallic từ tế bào dược liệu tăng (có thể điều kiện nhiệt độ làm độ bền học tế bào dược liệu giảm, chất nguyên sinh bị đơng vón, giảm số chất gây cản trở q trình giải phóng hoạt chất: chất nhày, pectin gơm, Do dễ dàng thấm vào khuếch tán acid gallic tế bào thuận lợi) Hàm lượng acid gallic tăng lên giải phóng từ dạng liên kết (tanin gallic) Về hàm lượng polyphenol toàn phần Hàm lượng polyphenol mẫu cao Phèn đen xử lý nhiệt cao so với cao Phèn đen không xử lý nhiệt Khi xử lý nhiệt điều kiện tối ưu, giải phóng phenolic từ hợp chất phenol dạng liên kết, có chuyển hóa hợp chất phenolic dạng khơng hịa tan thành hịa tan, có phân hủy tanin dẫn đến phóng thích dẫn xuất acid phenolic làm phát sinh thêm phenolic Về tác dụng chống oxy hóa invitro Khả chống oxy hóa cao Phèn đen không xử lý nhiệt thấp so với cao Phèn đen xử lý nhiệt Qua kết trên, ta thấy mối tương quan chặt chẽ hàm lượng acid gallic hàm lượng polyphenol tác dụng chống oxy hóa cao Phèn đen 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành mục tiêu đề với kết cụ thể sau: Đã khảo sát tối ưu hóa yếu tố q trình xử lý nhiệt Phèn đen tạo cao chiết Phèn đen Đã tiến hành khảo sát yếu tố trình xử lý nhiệt Phèn đen ảnh hưởng đến hàm lượng acid gallic chiết phương pháp thay đổi số yếu tố (OFAT) Từ lựa chọn kiều kiện xử lý nhiệt tối ưu sau:  Nhiệt độ sấy: 138oC  Thời gian sấy: 15 phút Đã điều chế cao đặc Phèn đen theo thông số tối ưu Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid gallic cao chiết Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Quy trình xử lý mẫu thử: Cân xác khoảng 0,1 g cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt, siêu âm với ml methanol 50% 15 phút Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch định mức vừa đủ 10 ml methanol 50% Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu dung dịch thử Điều kiện sắc ký khảo sát được:  Cột: C18 (250  4,6 mm; m)  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% = 15 : 85  Tốc độ dịng: 1,2 ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 272 nm  Thể tích tiêm: µl Thẩm định phương pháp chọn qua độ đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, độ xác, khoảng tuyến tính, độ cho thấy đạt theo quy định AOAC Đã khảo sát số tiêu hai mẫu cao điều chế Hàm lượng acid gallic, polyphenol tác dụng chống oxy hóa invitro cao chiết Phèn đen xử lý nhiệt cao mẫu không xử lý Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quy trình loại tạp q trình điều chế cao đặc để thu quy trình điều chế cao đặc Phèn đen xử lý nhiệt - Bào chế sản phẩm có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa từ cao đặc điều chế 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất y học, Hà Nội Đỗ Thị Hà, Phạm Thị Thúy Bùi Thị Bình, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi, (2012), "Thành phần flavanoid Phèn đen", Tạp chí Dược liệu, 17, trang 189 GS.TS Phạm Xuân Sinh (2014), Giáo trình Dược học Cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội, Nhà xuất Y học Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội TS Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội GS.TS Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Công Việt Hải (1999), "Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng nhịêt độ đến Flavonoid hoè hoa", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1994 -1999, Đại học Dược Hà Nội, trang 14 – 23 Nguyễn Quốc Huy (2002), "Nghiên cứu ảnh huởng nhiệt độ đến thành phần Tanin Ngũ Bội Tử", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1997- 2002, Đại học Dược Hà Nội, trang 24 – 25 Hoàng Thị Thu Hương (2001), "Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng nhịêt độ đến Anthranoid Thảo minh", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 - 2001, Đại học Dược Hà Nội, trang 22, 30 – 32 10 Vũ Hương Thủy (2000), "Nghiên cứu ảnh huởng nhiệt độ đến thành phần Anthranoid Đại Hồng", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2000, Đại học Dược Hà Nội, trang 32-33 Tiếng Anh 11 Aarthi C, Ramesh PB (2017), "Studies on the antibacterial activities of the shoot extracts of Phyllanthus species commonly found in Tamil Nadu", Journal of Innovative Research and Solutions, 3(1), pp 66-76 12 Akhtar MM, Sharmin SA, et al (2013), "Md Soriful Islam1, 2", International Journal of Pharmaceutical Research and Development, 5(04), pp 88-94 13 Akhter S, Simom HM, et al (2018), "Investigation of in vivo analgesic and antiinflammatory activities of methanol extracts of Phyllanthus reticulatus and Mimosa pigra", J Pharmacog Phytochem, 7, pp 2378-2385 14 Bagul M, Srinivasa H, et al (2005), "A rapid densitometric method for simultaneous quantification of gallic acid and ellagic acid in herbal raw materials using HPTLC", Journal of separation science, 28(6), pp 581-584 15 Chakrabarty T, Balakrishnan NP (2009), "The family Euphorbiaceae in Sikkim State, India", Journal of Economic and Taxonomic Botany, 33(3), pp 483-539 16 Chandler RF, Hooper SN (1979), "Friedelin and associated triterpenoids", Phytochemistry, 18(5), pp 711-724 17 Chhabra SC, Mahunnah RLA, et al (1990), "Plants used in traditional medicine in Eastern Tanzania III Angiosperms (Euphorbiaceae to Menispermaceae)", Journal of Ethnopharmacology, 28(3), pp 255-283 18 Chu TY, Chang CH, et al (2001), "Microwave-accelerated derivatization processes for the determination of phenolic acids by gas chromatography–mass spectrometry", Talanta, 54(6), pp 1163-1171 19 Das BK, Bepary S, et al (2008), "Hepatoprotective activity of Phyllanthus reticulatus", Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 21(4), pp 1017-1023 20 Department Fisheries and Conservation, in Flora of China (2009), A Checklist for 21 22 23 24 the South China Botanical Garden, pp 183 Gajera F (2009), "Movalia d and Gajera K: Quantitation of Rutin in methanolic leaf extract of Phyllanthus reticulatus Poir by high performance thin layer chromatography", Journal of Pharmaceutical Research and Development, 5(1) Aswatha R, Shreedhara CS, Falguni G, Sachin Z (2008), "Antioxidant studies of aqueous extract of Phyllanthus reticulatus Poir", Pharmacologyonline, 1, pp 351364 Haque T, Muhsin M, Didare A, et al (2016), "Antimicrobial and analgesic activity of leaf extracts of Phyllanthus reticulatus Poir.(FamilyEuphorbiaceae)", Jahangirnagar University Journal of Biological Sciences, 5(1), pp 81-85 Hedberg I, Hedberg O, et al (1983), "Inventory of plants used in traditional medicine in Tanzania II Plants of the families Dilleniaceae Opiliaceae", Journal of Ethnopharmacology, 9(1), pp 105-127 25 Horwitz W (2010), Official methods of analysis of AOAC International Volume I, agricultural chemicals, contaminants, drugs/edited by William Horwitz, Gaithersburg (Maryland): AOAC International, 1997, pp 842-853 26 Hui WH, Li MM, et al (1976), "A new compound, 21α-hydroxyfriedel-4 (23)-en3-one and other triterpenoids from Phyllanthus reticulatus", Phytochemistry, 15(5), pp 797-798 27 Izhar H, Shabbir A, et al (2021), "Phyllanthus reticulatus Prevents Ethanol-Induced Gastric Ulcer via Downregulation of IL-8 and TNF-α Levels", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp 457-470 28 Jamal AK, Yaacob WA, et al (2008), "A chemical study on Phyllanthus reticulatus", Journal of Physical Science, 19(2), pp 45-50 29 James JM, Neethu PC, et al (2020), "Morpho-anatomical, fluorescence, phytochemical and antibacterial studies of Phyllanthus myrtifolius Moon And Phyllanthus reticulatus Poir of Kerala", pp 561-565 30 Jaya P, Rashmi G (2011), "Evaluation of Anti-inflammatory activity of Petroleum ether and Methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves", Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 1(6), pp 266-270 31 Kapur SK, Sarin YK (1984), "Medico-botanic survey of medicinal and aromatic plants of katra valley (J & K STATE) India", Indian drugs, 22(1), pp 4-10 32 Khan MR (2001), "Antibacterial activity of some Tanzanian medicinal plants", Pharmaceutical biology, 39(3), pp 206-212 33 Khan MR, Ndaalio G, et al (1980), "Studies on African medicinal plants", Planta 34 35 36 37 Medica, 40(S 1), pp 91-97 Khan MK, Abert VM, et al (2010), "Ultrasoundassisted extraction of polyphenols (flavanone glycosides) from orange (Citrus sinensis L.) peel", Food chemistry, 119(2), pp 851-858 Khatun H, Nesa L, et al (2013), "Anti-Inflammatory, Antinociceptive and CNS Depressant Activities of the Methanolic Extract of Phyllanthus reticulatus Leaves", Global Journal of Pharmacology, 7(2), pp 172-178 Khatun M, Billah M, et al (2012), "Sterols and sterol glucoside from Phyllanthus species", Dhaka University Journal of Science, 60(1), pp 5-10 Khatun MH, Nesa ML, et al (2014), "Antidiabetic and antidiarrheal effects of the methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves in mice", Asian Pacific Journal of Reproduction, 3(2), pp 121-127 38 Lam SH., Wang CY, et al (2007), "Chemical investigation of Phyllanthus reticulatus by HPLC-SPE-NMR and conventional methods", Phytochem Anal, 18(3), pp 251-5 39 Maruthappan V, Shree KS (2010), "Effects of Phyllanthus reticulatus on lipid profile and oxidative stress in hypercholesterolemic albino rats", Indian journal of pharmacology, 42(6), pp 388 40 Maruthappan V, Shree KS (2010), "A report on the antioxidant activity of the powder of the entire plant of Phyllanthus reticulatus Poir", International Journal of Green Pharmacy (IJGP), 4(4), pp 408 41 Neves AC, Neves MTC (1966), "Some determinations on the leaves of Phyllanthus reticulatus Poir of Mozambique", Bol Esc Farm Univ Coimbra, 25, pp 22 42 Omulokoli E, Khan B, et al (1997), "Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants", Journal of ethnopharmacology, 56(2), pp 133-137 43 Pojchaijongdee N (2006), Chemical constituents and biological activity of Phyllanthus reticulatus Poir leaves, Thesis 44 Pojchaijongdee N, Sotanaphun U, et al (2010), "Geraniinic acid derivative from the leaves of Phyllanthus reticulatus", Pharmaceutical Biology, 48(7), pp 740-744 45 Rahmatullah M, Rahman MA, et al (2010), "A Pharmacological Study on Antinociceptive and Anti-hyperglycemic Effects of Methanol Extract of Leaves of Phyllanthus", Advances in Natural and Applied Sciences, 4(3), pp 229-232 46 Ram HNA, Shreedhara CS, et al (2009), "Hypolipidemic activity of Phyllanthus reticulatus extracts in poloxamer-407 induced hyperlipidemic rats", Biomed, 4(4), pp 366-371 47 Ripa FA, Khatun M, et al (2014), "Antidiabetic and antidiarrheal effects of the methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves in mice" 48 Saha A, Masud MA, et al (2007), "The analgesic and antiinflammatory activities of the extracts of Phyllanthus reticulatus In mice model", Pharmaceutical Biology, 45(5), pp 355-359 49 Sangkasila R (1998), “Chemical constituents and some bioactivities of stem of Phyllanthus reticulatus Poir”, MS Thesis Bangkok, Ramkhamhaeng University 50 Sharma S, Kumar S (2013), "Phyllanthus reticulatus poir.-An important medicinal plant: A review of its phytochemistry, traditional uses and pharmacological properties", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 4(7), pp 2528 51 Sharma S, Kumar S (2013), "Phyllanthus reticulatus Poir.—an important medicinal plant: a review of its phytochemistry, traditional uses and pharmacological properties", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 4(7), pp 2528-2534 52 Shruthi S, Padmalatha RS, et al (2010), "In vitro antibacterial activities of Kirganelia reticulata baill against Methicilin-Resistant Staphilococcus aureus", Pharmacophore, 1(2), pp 123-131 53 Sinan KI, Luz CGM, et al (2021), "New insights on Phyllanthus reticulatus Poir leaves and stem bark extracts: UPLCESI-TOF-MS profiles, and biopharmaceutical and in silico analysis", New Journal of Chemistry, 45(45), pp 21049-21065 54 Zokhroof Y, Sharif T, et al (2014), "Bioactivities of Malvaviscus arboreus var drummondii and Phyllanthus reticulatus Poir.", Dhaka University Journal of Pharmaceutical Sciences, 13, pp 143-147 55 Narmatha VS, Vennila S, Rajanarayanan M, Ambikapathy V(2018), "The challenging perspective antimicrobial activity of Phyllanthus reticulatus against clinical microbes", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(6), pp 18031805 56 Jantan I, Haque MA., Ilangkovan M, & Arshad L (2019), "An insight into the modulatory effects and mechanisms of action of phyllanthus species and their bioactive metabolites on the immune System", Frontiers in Pharmacology, pp 10 57 Sharma S, Kumar S, Kumar D, Arya L, (2014), "Immunostimulant activity of Phyllanthus reticulatus Poir: a useful plant for infectious tropical diseases", Asian pacific journal of tropical disease, 4, pp 491–495 58 Maruthappana, Shreeb V, Sakthi K, , "In vitro and in vivo antioxidant activity of Phyllanthus reticulatus", Drug Invention Today (2010), Vol Issue 6, pp 303-307 59 Biplab KDM, Shohel ML , Adit MP, Rajib B, Banibrata D, Tahmina Y, Nasrin A and Hannan JMA (2011), “Anti Hepatitis B Viral Activity of Phyllanthus reticulatus”, Bangladesh Pharmaceutical Journal, Vol 14, No 1, pp 245-258 60 Bhattacharya S (2021), "Central composite design for response surface methodology and its application in pharmacy", Response surface methodology in engineering science, IntechOpen, pp 354-367 61 Anand AZ, Subhash LB (2014), "Polyphenols in the Prevention and Treatment of Vascular and Cardiac Disease, and Cancer", Polyphenols in Human Health and Disease, pp 254-265 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: DƯỢC LIỆU PHỤ LỤC 2: MẪU TIÊU BẢN