Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycyl Funtumin lên mức độ phiên mã gen Xiap trên dòng tế bào BT474

Apoptosis được khởi đầu bởi cytochrom C thông qua liên kết với cardiolipin ở màng trong ty thể, thông qua một chuỗi phản ứng, kích hoạt các caspase - một nhóm các protease cystein – tron

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THANH HOA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN XIAP TRÊN

DÒNG TẾ BÀO BT474

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA

GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ

PHIÊN MÃ GEN XIAP TRÊN

DÒNG TẾ BÀO BT474

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS TS Đỗ Hồng Quảng

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh – Trường ĐH Dược HN

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học - Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN

Để khóa luận tốt nghiệp được hoàn thiện, em đã nhận được sự động viên,

hỗ trợ và giúp đỡ nhiệt tình đến từ các thầy các cô, các anh chị, bạn bè và người thân trong thời gian qua.Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể các thầy, cô giáo – giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, các bộ môn, các phòng ban đã luôn giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều kiện tốt nhất cho em được học tập, rèn luyện trong suốt 5 năm học ngồi trên ghế nhà trường Em cũng xin cảm ơn các thầy cô, anh chị và các bạn cùng nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Hóa Sinh, cũng như các thầy cô, anh chị và các bạn đang công tác tại phòng Công nghệ tế bào động vật và phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình làm nghiên cứu

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Hồng Quảng - giảng

viên Bộ môn Hóa sinh, cán bộ phòng Sau Đại học trường Đại học Dược Hà Nội Thầy là người đã truyền đạt cho em những kiến thức, kỹ năng, phương pháp và tác phong làm việc nghiêm túc, cẩn thận cần có của một người làm nghiên cứu Hơn thế nữa, thầy luôn hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Thị Thùy Dương

- cán bộ phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người đã hỗ trợ rất nhiều về mặt chuyên môn trong suốt thời gian em nghiên cứu

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn vè đã động viên, cổ vũ và giúp

đỡ em trong suốt thời gian qua

Xác nhận của GV hướng dẫn Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Đỗ Thị Thanh Hoa

MỤC LỤC

1.1 Tổng quan về XIAP……… 2

1.1.1 Cấu trúc phân tử……… 2

1.1.2 Chức năng sinh học của XIAP……… 4

1.1.2.1 Vai trò ức chế sự chết tế bào theo chu trình……… 4

1.1.2.2 Vai trò trong sự vận chuyển tín hiệu trong tế bào……… 6

1.1.3 Vai trò của XIAP trong ung thư……… 6

1.1.3.1 Biểu hiện của XIAP trong ung thư……… 6

1.1.3.2 Ứng dụng……… 7

1.2 Tổng quan phương pháp đánh giá biểu hiện gen……… 8

1.2.1 Quá trình biểu hiện gen……… 8

1.2.2 Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen…… ……… 8

1.2.2.1 Kỹ thuật PCR đánh giá biểu hiện gen ở mức độ phiên mã……… 9

1.2.2.2 Kỹ thuật Western Blot đánh giá biểu hiện gen ở mức độ dịch mã……… 12

1.2.2.3 Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen XIAP……… 13

1.3 Tổng quan về glycyl funtumin………… ……… 14

1.3.1 Cấu tạo phân tử glycyl funtumin……… 14

1.3.2 Tác dụng dược lý của glycyl funtumin… ……… ……… 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu, trang thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……… 16

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Nuôi cấy tế bào……… 18

2.2.2 Tách chiết ARN……… 18

2.2.3 Xác định độ tinh sạch và đo phổ hấp thụ bằng máy NanoDrop………… 18

2.2.4 Phản ứng tổng hợp cDNA từ ARN………18

2.2.5 Phản ứng realtime PCR phát hiện gen XIAP……… 20

2.2.6 Điện di trên gel agarose……… … 22

2.2.7 Giải trình tự ADN……… 22

2.2.8 Đánh giá ảnh hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP……… 22

2.2.9 Xử lý thống kê……… … 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết quả 24 3.1.1 Kết quả nuôi cấy và thử thuốc Aslem trên tế bào BT474………… …… 24

3.1.2 Kết quả tách chiết và xác định độ tinh sạch bằng quang phổ hấp thụ… 25

3.1.2.1 Kết quả quét phổ hấp thụ của các mẫu sau tách chiết……… 25

3.1.2.2 Kết quả đo nồng độ và chỉ số OD260/280……….……… 25

3.1.3 Kết quả phát hiện gen XIAP……… 26

3.1.3.1 Kết quả điện di sản phẩm realtime RT-PCR……… 26

3.1.3.2 Kết quả giải trình tự gen thu được sau phản ứng khuếch đại gen……… 27 3.1.4 Kết quả đánh giá tác dụng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã

gen XIAP……… 28

3.2.1 Về quá trình nuôi cấy và tách chiết ARN……… 31 3.2.2 Về đánh giá mức độ biểu hiện gen XIAP……….…31 3.2.3 Về ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

BIR Baculoviral IAP repeat Chuỗi lặp IAP

BIRC4 Baculoviral IAP repeat-containing

protein 4

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò

GF Glycyl-funtumin

IAP Inhibitors of Apoptosis Chất ức chế sự chết theo

chương trình của tế bào

IARC The International Agency

for Research on Cancer

IL Interleukin

IFN Interferon

LD50 Median lethal dose

Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế

Liều gây chết trung bình

MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa

PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm phosphate

PCD Programmed cell death Sự chết tế bào theo chu trình

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RT Reverse transcription Phiên mã ngược

RT-PCR Reverse transcription

polymerase chain reaction

Phản ứng PCR phiên mã ngược

TAK Protein kinase hoạt hóa

XIAP X-linked Inhibitor of

apoptosis protein

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Vị trí của gen XIAP trên nhiễm sắc thể X ở người 3

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc phân tử các protein họ IAPs [22] 3

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein XIAP 4

Hình 1.4 Cơ chế ức chế apoptosis của XIAP bằng cách ức chế caspase-3,7,9 5

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của XIAP vận chuyển tín hiệu tế bào [30] 6

Hình 1.6 Nguyên tắc của phản ứng PCR là nhân bản ADN theo chu kỳ nhiệt 10

Hình 1.7 Nguyên tắc tiến hành RT-PCR 10

Hình 1.8 Cơ chế phát huỳnh quang của SYBR Green I 12

Hình 1.9 Hình ảnh bao bì thuốc tiêm Aslem [24]……… ……… 14

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474 17

Hình 2.2 Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của cặp mồi XIAP 21

Hình 3.1 Hình ảnh tế bào BT474 sau 24 giờ thử thuốc ở nồng độ 3,0 µg/mL và 6,0 µg/mL 24

Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV của các mẫu ARN chiết từ dòng tế bào BT474 25

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng realtime RT-PCR trên gel agarose 1% 26

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại với trình tự gen đã được công bố trong ngân hàng gen Genbank 28

Hình 3.5 Hình ảnh đồ thị huỳnh quang thu được từ phản ứng realtime PCR 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số thuốc, hoạt chất tác dụng hướng đích XIAP 7

Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp mix 1 19

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng thêm vào hỗn hợp mix 1 19

Bảng 2.3 Thành phần hỗn hợp phản ứng realtime PCR 20

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR 20

Bảng 2.5 Trình tự cặp mồi XIAP, β-actin được sử dụng trong phản ứng 21

Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ, độ tinh sạch của các mẫu ARN đối với dòng tế bào BT474 26

Bảng 3.2 Kết quả giá trị chu kỳ ngưỡng phát hiện được từ các mẫu 29

Bảng 3.3 Kết quả giá trị 2-∆Ct trung bình phát hiện được và giá trị p, 95%CI khi so sánh với mẫu đối chứng 30

Bảng 3.4 Kết quả so sánh tương đối theo công thức Livak 30

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ung thư được coi là căn bệnh đe dọa nghiêm trọng đến tình hình sức khỏe của con người khi tỷ lệ mắc ung thư đang ngày một gia tăng trên toàn thế giới Theo dữ liệu thống kê của Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC), chỉ tính riêng trong năm 2018, đã có hơn 18 triệu ca bệnh ung thư mới mắc và đáng kinh ngạc hơn nữa, hơn 9,5 triệu người chết vì căn bệnh ung thư trên toàn cầu Việt Nam với tổng số dân khoảng hơn 96 triệu dân, trong năm 2018, có đến có đến 114871 người chết vì căn bệnh ung thư và chưa dừng lại ở đó, 164671 ca mới được chẩn đoán ung thư trên cả nước [40]

Đứng trước gánh nặng do bệnh ung thư đặt ra, việc tiếp tục đẩy mạnh hoạt động nghiên cứu các thuốc, hoạt chất có tác dụng trong điều trị ung thư là hết sức cần thiết Trong đó, glycyl funtumin là hoạt chất chính trong biệt dược Aslem – thuốc tiêm có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào hiện đang sử dụng với chỉ định hỗ trợ điều trị ung thư Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra glycyl funtumin

có khả năng ức chế sự phiên mã gen survivin tại nồng độ thích hợp Nghiên cứu của Lê

Hà Phương (2016) cho thấy sau 48 giờ, ở mức nồng độ 6,0μg/mL, glycyl funtumin ức chế 40% sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào ung thư vú BT474 [4] Ngoài ra, nghiên cứu của PGS.TS.Đỗ Hồng Quảng (2017) cho kết luận glycyl funtumin nồng độ 6,0μg/mL làm giảm sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào A549 sau 24 giờ [5] Trong đó, survivin cùng với 7 protein khác bao gồm: XIAP, NAIP, cIAP-1, cIAP-2, Apollon, ML-IAP, ILP-2 đều thuộc nhóm các protein ức chế sự chết tế bào theo chu trình (IAPs) có vai trò đặc biệt quan trong trong sự hình thành khối u Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu trước đây, có thể thấy việc nghiên cứu mở rộng, làm rõ cơ chế và thử nghiệm ảnh hưởng của glycyl funtumin trên nhóm IAPs, chỉ dấu sinh học quan trọng trong ung thư cần được tiếp tục tiến hành

Vì những lý do nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474” với mục tiêu: “Đánh giá ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474”

tố hóa học Trong đó, các chất ức chế apoptosis là nhóm các protein chủ yếu hoạt động theo con đường nội sinh, ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào; điển hình bao gồm họ Bcl-2, chất ức chế viral Crma, và họ IAPs

IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins - nhóm các protein ức chế quá trình Apoptosis) được tìm thấy ở hầu hết các tế bào động vật có xương sống từ bậc thấp đến bậc cao Cho đến nay, có 8 protein trong nhóm đã được xác định ở người bao gồm:

NAIP (còn được gọi là BIRC-1), cIAP-1 (hay HIAP-2/MIHB/BIRC-2), cIAP-2 (hay

HIAP-1/MIHC/BIRC-3), XIAP (hILP/MIHA/BIRC-4), survivin (TIAP/BIRC-5),

Apollon (Bruce/BIRC-6), ML-IAP (KIAP/livin/BIRC-7) và ILP-2 (BIRC-8) Các

protein thuộc nhóm IAPs có chức năng sinh lý điều chỉnh sự chết tế bào theo chu trình

và đồng thời giữ vai trò quan trọng quyết định số phận của tế bào trong việc đáp ứng với các tín hiệu bất thường của gen Do đó, các protein này, nếu có rối loạn về mặt chức năng, có thể dẫn tới sự hình thành và phát triển của khối u, phát sinh ung thư hoặc sự kháng thuốc

1.1.1 Cấu trúc phân tử

Ở người, gen XIAP có chiều dài 54256 cặp nucleotid chứa 6 đoạn exon nằm trên

3

nhiễm sắc thể X ở vị trí Xq25 (hình 1.1) mã hóa cho một protein cùng tên – protein

XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) hay còn gọi là IAP3 hay BIRC4 Protein XIAP gồm 497 acid amin, nằm trong tế bào chất và được xem là protein có hoạt tính ức chế caspase mạnh nhất trong số các protein đã biết trong họ IAPs hiện nay [10, 22, 25]

Hình 1.1 Vị trí của gen XIAP trên nhiễm sắc thể X ở người

Dù khác nhau về cấu trúc, tất cả 8 protein thuộc nhóm IAPs hiện nay đều có một phần cấu trúc cơ bản, gọi là chuỗi lặp BIR (baculovirus IAP repeat), chứa khoảng 70 amino acid ở đầu tận cùng N đặc trưng cho nhóm Mỗi IAP, tùy theo cấu trúc, có thể chứa từ một đến ba miền BIR, có vai trò quyết định hoạt tính ức chế apoptosis Miền BIR có phần lõi cấu tạo từ Cystein và Histidin với cấu trúc 3 vòng xoắn alpha nhỏ (CX2 CX16 HX6 C); có vai trò ức chế hoạt động của caspase thông qua một liên kết với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspase Ngoài vùng BIR, một số IAP của virus, động vật có vú và côn trùng còn có một cấu trúc dạng vòng xoắn alpha ở đầu tận cùng C liên quan đến hoạt động ubiquitin-ligase [12, 14, 24]

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc phân tử các protein họ IAPs [22]

Protein XIAP gồm 3 miền BIR (BIR1, BIR2, BIR3) ở đầu tận cùng N, 1 miền

UBA (ubiquitin associated domain) và 1 miền RING (really interesting new genes) ở

đầu tận cùng C (hình 1.2) Trong khi 3 miền BIR quyết định vai trò ức chế trực tiếp

caspase thì miền UBA và miền RING lại liên quan đến chức năng liên kết với ubiquitin [22, 25, 41]

E3-Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein XIAP [41]

1.1.2 Chức năng sinh học của XIAP

XIAP là protein đa chức năng, trong đó, chức năng sinh học quan trọng bao gồm:

ức chế quá trình apoptosis, vận chuyển nhiễm sắc thể trong phân bào, điều hòa cân bằng nội môi và có vai trò trong sự vận chuyển tín hiệu trong tế bào mARN XIAP đã được quan sát thấy ở tất cả các mô ở người trưởng thành và cả ở thai nhi, ngoại trừ bạch cầu máu ngoại biên [14, 18] Điều này cho thấy vai trò đặc biệt quan trọng và có tầm ảnh hưởng rộng trên nhiều tế bào khác nhau

1.1.2.1 Vai trò ức chế sự chết tế bào theo chu trình

Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chu trình đã được lập trình trong gen, là một phần trong hoạt động sống của tế bào đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài hoà trong thời gian phát triển phôi thai, bảo vệ cơ thể và thay thế mô ở những cơ thể trưởng thành [8] Trường hợp bệnh lí, những tế bào không được cung cấp máu sẽ trương lên, nứt, rách màng và gây vỡ tế bào dẫn tới thực bào hoặc tế bào bị teo lại, màng tế bào trở nên sần sùi và nhân thường kết đặc

Apoptosis được khởi đầu bởi cytochrom C thông qua liên kết với cardiolipin ở màng trong ty thể, thông qua một chuỗi phản ứng, kích hoạt các caspase - một nhóm các protease cystein – trong đó, có caspase-3 và caspase-7 làm nhiệm vụ tiêu diệt tế bào bằng cách ức chế và phân hủy những enzym nhân đôi và enzym sửa chữa ADN; hoạt hoá những enzym cắt ADN thành những mảnh nhỏ và phá vỡ cấu trúc protein trong nhân; dẫn tới quá trình thực bào và sự thay thế bằng một tế bào mới sau vài giờ

[9] (hình 1.4)

5

Hình 1.4 Cơ chế ức chế apoptosis của XIAP bằng cách ức chế caspase-3,7,9

IAPs nói chung đều có khả năng ức chế apoptosis, tuy nhiên, XIAP được xem là protein có hoạt tính ức chế caspase mạnh nhất họ IAPs hiện nay và XIAP được chứng minh là ức chế cả con đường nội sinh và ngoại sinh của apoptosis [26, 31, 34]

Cơ chế gây ức chế Apoptosis của XIAP được cho là do XIAP có khả năng ức chế trực tiếp caspase-3,7,9; trong đó, caspase 9 là caspase khơi mào, caspase 3,7 là các caspase phản ứng Caspase có vai trò tối quan trọng đối với sự chết theo chu trình của

tế bào Caspase khơi mào có chức năng “cắt gọt” các caspase phản ứng (đang ở dạng bất hoạt) qua đó hoạt hóa chúng, nhờ đó hàm lượng caspase hoạt hóa trong tế bào tăng lên rất nhanh Khi được hoạt hóa, caspase phản ứng tiếp tục “cắt gọt” các protein khác trong tế bào, khởi đầu cho quá trình Apoptosis Vì vậy, khi XIAP liên kết trực tiếp với caspase-9 tại miền BIR-3 và bất hoạt caspase-9 bằng cách giữ nó ở trạng thái monomer, không hoạt động; đồng thời ức chế caspase-3,7 do liên kết với chúng tại miền BIR-2, từ đó gây ức chế chu trình apoptosis [14, 31, 36]

Ngoài ra, XIAP có miền UBA và miền RING ở đầu tận cùng C cho phép tạo liên kết với E3-ubiquitin Từ đó, phức hợp này thông qua hoạt động của proteasomes, xúc tác cho phản ứng phân hủy caspase 3 và caspase 7, làm ức chế apoptosis [8, 11]

Trong một cơ chế khác, XIAP ức chế apoptosis bằng cách gắn với protein apoptotic được gọi là Secondary Mitochondria - derived Activator of Caspase (SMAC/DIABLO) - là protein được giải phóng từ ty thể để kích hoạt caspase-9 Hoạt tính ubiquitin của XIAP cho phép các lysosom vào trong ty thể và làm thoái hóa SMAC/DIABLO [11] Sida Qin và cộng sự đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của XIAP gây ức chế SMAC/DIABLO thông qua hoạt tính ubiquin dẫn tới ngăn chặn quá trình apoptosis trong ung thư phổi tế bào nhỏ (NSCLC) [32]

pro-1.1.2.2 XIAP trong sự dẫn truyền tín hiệu trong tế bào

Một số IAP đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu Các con đường truyền tín hiệu bị ảnh hưởng bởi IAP bao gồm yếu tố hạt nhân kappa B (NF-kB) và stress kinase (JNK), protein kinase hoạt hóa p38 (MAPK), thụ thể protein BMP như BMP typ I [27] XIAP tham gia hoạt hóa NF-κB và MAPK gián tiếp thông qua yếu tố TGF-β và các thụ thể BMP khi có tương tác trực tiếp giữa miền BIR-1 và protein kinase hoạt hóa TGF-β (TAK) liên kết với TAB-1, dẫn đến hoạt hóa TAK-1, kích hoạt NF-κB và MAPK [27, 38, 44] như hình 1.5 dưới đây

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của XIAP trong dẫn truyền tín hiệu tế bào

Ngoài ra, XIAP còn tham gia vào dẫn truyền tín hiệu NOD-1 và NOD-2 gây cảm ứng NF-κB [33] Mặc dù cơ chế chưa rõ ràng, người ta cho rằng XIAP liên kết với Rip-2, một protein kinase có liên quan đến tương tác giữa CARD-CARD với NOD-1

và NOD-2 cho phép dẫn truyền tín hiệu NOD-1/NOD-2 thông qua hoặc liên kết với trực tiếp TAB/TAK hoặc gián tiếp thông qua xúc tác phức hợp K63-polyubiquitin [22,

28, 30, 33, 35]

1.1.3 Vai trò của XIAP trong ung thư

1.1.3.1 Biểu hiện của XIAP trong ung thư

7

XIAP là chất ức chế quá trình apoptosis, được biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thư và sự có mặt của nó liên quan đến tình trạng kháng với hoá trị liệu, tăng tái phát khối u ảnh hưởng đến sự sống còn của bệnh nhân [13, 15, 41] Một số ung thư đã được chứng minh có sự biểu hiện quá mức của XIAP như ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư bàng quang, ung thư biểu mô tế bào thận, ung thư gan, ung thư nguyên bào thần kinh đệm đa dạng (“glioblastomas”),… [13, 16, 41] Đặc biệt, những đột biến hay khiếm khuyết trong gen XIAP có thể dẫn đến tình trạng bệnh

dù rất hiếm nhưng vô cùng nghiêm trọng, là hội chứng tăng sinh lypho bào liên kết X (“X-linked lymphoproliferative disease”) [41]

1.1.3.2 Ứng dụng

Do có mức độ biểu hiện cao rõ rệt trong nhiều bệnh ung thư và đóng vai trò như nguyên nhân tiến triển ung thư, XIAP đang được nghiên cứu rất nhiều và được xem xét như một chỉ dấu ung thư, mặc dù chưa được công nhận trên thực hành lâm sàng [19, 25] Đánh giá liên tục sự khác biệt về biểu hiện, cơ chế hoạt động của XIAP giữa

tế bào ung thư và tế bào bình thường có thể là minh chứng quan trọng đối với sự phát triển của phương pháp điều trị anti-XIAP chọn lọc và giảm tai biến ở mức tối thiểu

Bảng 1.1 Một số thuốc, hoạt chất tác dụng hướng đích XIAP

Hiện nay, một số chất ức chế XIAP đã và đang dần được nghiên cứu và phát triển trong liệu pháp điều trị ung thư hướng đích XIAP [21, 23] Trong đó, AEG 35156

là một oligonucleotid đang được phát triển trong liệu pháp hướng đích XIAP tại Montreal, Canada, có khả năng làm giảm đáng kể mRNA XIAP và các tế bào ung thư

nhạy cảm với apoptosis Thuốc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I ở bệnh nhân ung thư như một tác nhân duy nhất cũng như kết hợp với docetaxel [6, 31] Ngoài

ra, ngày càng nhiều thuốc, hoạt chất đang đã được nghiên cứu với tác dụng ức chế hướng đích XIAP trong điều trị ung thư, mở ra sự phát triển mạnh mẽ cho phương

pháp điều trị anti-XIAP trong tương lai (bảng 1.1) [6, 21, 23]

1.2 Tổng quan phương pháp đánh giá biểu hiện gen

1.2.1 Quá trình biểu hiện gen

Biểu hiện gen là khái niệm dùng để chỉ các quá trình liên quan đến việc chuyển đổi thông tin di truyền chứa trong gen thành sản phẩm trong tế bào sống, thường là các protein nếu vật chất di truyền nằm trong gen cấu trúc và là ARN mang chức năng nếu thông tin di truyền chứa trong các gen mã hóa không phải protein như ARN vận chuyển (tRNA) hoặc các ARN nhỏ trong nhân (snRNA) Từ đó, tính trạng tương ứng được tạo thành ở kiểu hình có thể quan sát được Những kiểu hình như vậy thường được biểu hiện bằng cách tổng hợp các protein kiểm soát hình dạng của sinh vật, hoặc hoạt động như các enzym xúc tác các con đường trao đổi chất cụ thể, đặc trưng cho sinh vật

Biểu hiện gen là quá trình rất phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn và phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có tác động của các gen khác, tác động của môi trường bên trong (nội môi) và môi trường bên ngoài (ngoại cảnh) Một số gen được biểu hiện liên tục, vì chúng tạo ra các protein liên quan đến các chức năng trao đổi chất cơ bản; một

số gen được biểu hiện như là một phần của quá trình biệt hóa tế bào; và một số gen được biểu hiện như là kết quả của sự biệt hóa tế bào [38].Tuy nhiên, thông thường, quá trình biểu hiện gen gồm 2 giai đoạn chính là phiên mã và dịch mã Sự biểu hiện của gen được điều khiển rất chặt chẽ, và là cơ sở cho sự khác biệt tế bào, hình thái, tính linh hoạt và khả năng thích ứng của bất kỳ sinh vật nào Việc điều hòa gen làm nền cho sự thay đổi tiến hóa, vì việc kiểm soát thời gian, vị trí và số lượng biểu hiện gen có thể ảnh hưởng sâu sắc đến các chức năng (hoạt động) của gen trong tế bào sinh vật Việc đánh giá mức độ biểu hiện của một gen cụ thể được thực hiện thông qua việc phát hiện và đo lường các sản phẩm của gen cần nghiên cứu thông qua 2 giai đoạn phiên mã (ARN) và dịch mã (protein)

1.2.2 Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen

9

Trên thế giới, biểu hiện gen đã được nghiên cứu ở cả giai đoạn phiên mã và dịch

mã Để đánh giá mức độ phiên mã gen người ta sử dụng kỹ thuật PCR và các biến thể của kỹ thuật này để định lượng được số lượng bản sao gen đích thông qua sự khuếch đại gen lên nhiều lần từ mẫu ban đầu Để đánh giá biểu hiện gen ở mức độ dịch mã, các nhà nghiên cứu thường sử dụng kỹ thuật Western blot sử dụng một kháng thể có gắn huỳnh quang hoặc phóng xạ để phát hiện protein đích dựa vào phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

1.2.2.1 Kỹ thuật PCR đánh giá biểu hiện gen ở mức độ phiên mã

PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction) là phương pháp nhân bản nhanh một đoạn ADN trong ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Kỹ thuật PCR

có độ nhạy rất cao mà chỉ yêu cầu một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ PCR được thực hiện trong ống nghiệm chứa dung dịch phản ứng (PCR mix), thể tích từ 10µL đến 50µL, gồm các thành phần sau:

(1) Taq polymerase: enzym polymerase chịu nhiệt, có hoạt tính tối đa ở

72oC Enzym này lần đầu tiên được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus phân lập được

từ bùn đất tại suối nước nóng ở Hoa Kỳ nên polymerase chịu nhiệt thường được gọi

chung với tên gọi Taq polymerase, mặc dù, ngày nay enzym này thường được tách chiết từ các nguồn khác như E.coli hoặc vi khuẩn tái tổ hợp khác

(2) 4 loại dNTP bao gồm dATP, dTTP, dGTP cà dCTP

(3) Đoạn ADN đích cần khuếch đại

(4) Mồi (primer) xuôi và ngược, là đoạn oligonucleotid chứa khoảng 20 đến

30 nucleotid có trình tự bổ sung với trình tự 2 đầu đoạn ADN đích

(5) Ion Mg2+ (MgCl2)

(6) Dung dịch đệm Tris-KCl làm dung môi

Kỹ thuật PCR sử dụng máy luân nhiệt (hay còn gọi là máy PCR) làm cho nhiệt

độ trong buồng ủ thay đổi theo chu kỳ, tùy theo các nhiệt độ khác nhau mà các phản ứng khác nhau xảy ra theo nguyên tắc:

Một chu kỳ nhiệt thường gồm 3 giai đoạn nhiệt:

C, đây là nhiệt độ làm đứt gãy các liên kết hydro giữa 2 mạch của mạch đôi ADN Khi

đó, ADN bị biến tính thành mạch đơn

(2) Giai đoạn bắp cặp: nhiệt độ được hạ xuống đến 55o

C – 56oC, các đoạn mồi bắt cặp bổ sung với 2 đầu đoạn ADN đích

Taq polymerase hoạt động, tổng hợp đoạn ADN đích mới theo nguyên tắc bổ sung với đoạn mạch làm khuôn

Hình 1.6 Nguyên tắc của phản ứng PCR là nhân bản ADN theo chu kỳ nhiệt

Như vậy, cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt, 1 đoạn ADN đích được nhân bản thành 2 đoạn ADN bản sao Nếu chu kỳ nhiệt được lặp đi lặp lại n lần thì từ 1 đoạn ADN đích, sau phản ứng PCR ta thu được đoạn ADN bản sao

Phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược hay gọi tắt là RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) là một trong nhiều biến thể của phản ứng PCR Khi đích cần phát hiện không còn là ADN mà là một đoạn ARN, để thực hiện được phản ứng khuếch đại PCR này, cần quá trình phiên mã ngược (RT – Reverse transcription) chuyển đoạn ARN này thành cADN trước Do vậy, kỹ thuật này được gọi là RT-PCR

Giai đoạn RT là giai đoạn khởi đầu quan trọng, cần có sự tham gia của enzym phiên mã ngược, mồi đặc hiệu bám vào sợi ARN và các dNTP để tổng hợp cADN Nhờ có phản ứng RT, ARN thay vì vẫn ở dạng nhạy cảm, kém bền, dễ bị phân huỷ được chuyển thành cADN bền hơn, thuận lợi hơn cho bảo quản và thực hiện các phép phân tích

11

Hình 1.7 Nguyên tắc tiến hành RT-PCR

Có 2 phương pháp thực hiện kỹ thuật RT-PCR Một phương pháp thực hiện 2 quá trình riêng biệt: tạo cADN từ ARN bằng phản ứng phiên mã ngược và sử dụng cADN để thực hiện phản ứng PCR (RT-PCR hai bước) Phương pháp thứ 2 sử dụng enzym phiên mã ngược ngay trong ống phản ứng PCR, gộp 2 giai đoạn RT-PCR vào 1 bước duy nhất (RT-PCR một bước) Cả 2 phương pháp này đều đang được sử dụng trong nghiên cứu về biểu hiện gen

qRT-PCR (quantitative RT-PCR hay realtime RT-PCR) là biến thể của RT- PCR, trong đó kết quả khuếch đại ADN đích trong ống nghiệm được định lượng ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng thông qua tín hiệu huỳnh quang Thành phần phản ứng được bổ sung thêm các tác nhân phát huỳnh quang và máy chu kì nhiệt được trang bị thiết bị realtime (gồm 1 nguồn phát ánh sáng kích thích và 1 máy cảm biến thu nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang phát ra từ tube chứa hỗn hợp phản ứng) Các tác nhân phát huỳnh quang được sử dụng có thể là chất màu huỳnh quang xen vào sợi đôi ADN (SYBR Green I) hoặc các probe

Các chất màu huỳnh quang như SYBR Green I có ái lực rất cao với ADN sẽ xen vào sợi đôi ADN và phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR, chất huỳnh quang bị khuếch tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tube phản ứng không phát huỳnh quang hoặc tín hiệu huỳnh quang yếu khi nhận được nguồn sáng kích thích Khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR, chất màu huỳnh quang sẽ xen vào và tập trung trên sợi đôi ADN của sản phẩm khuếch đại, tube phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích (Hình 1.8) So với các

chất màu chèn khác, SYBR Green I có ưu điểm vượt trội hơn như màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho các sợi đôi gắn vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy ít ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại PCR

Hình 1.8 Cơ chế phát huỳnh quang của SYBR Green I

Cơ chế phát huỳnh quang của probe phức tạp hơn so với SYBR Green I Có nhiều loại probe được sử dụng như: taqman probe, probe lai hoặc các loại probe khác Người ta cũng có thể sử dụng nhiều probe trong cùng một ống phản ứng để xác định biểu hiện của nhiều gen khác nhau Trong kỹ thuật này, ngoài các thành phần cơ bản của hỗn hợp phản ứng PCR, hai thành phần quan trọng để có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN đích là:

tự đặc hiệu trên DNA đích và trình tự này dài khoảng 24-30 nucleotid với đầu 5’ có gắn chất huỳnh quang gọi là reporter còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter

giải cắt bỏ probe khi probe bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzym kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung

1.2.2.2 Kỹ thuật Western Blot đánh giá biểu hiện gen ở mức độ dịch mã

Western blot hay phương pháp lai thấm protein là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên – kháng thể) Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang

Sau khi xử lý mẫu, các protein kháng nguyên sẽ được phân tách nhau thành các

13

vạch khác nhau bằng phương pháp điện di trên gel, thường dùng nhất là điện di trên gel polyacrylamid và có bổ sung SDS (phương pháp SDS – PAGE) để giữ các polypeptid ở trạng thái biến tính sau khi chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất

đi cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 3 Sau đó, tiến hành chuyển protein gel lên màng lai bằng phương pháp thẩm tách điện - sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel Tiếp đến, ủ với kháng thể sơ cấp tạo phức hợp protein kháng nguyên – kháng thể, sau

đó, ủ với kháng thể thứ cấp tạo phức hợp protein kháng nguyên – kháng thể sơ cấp – kháng thể thứ cấp Kháng thể thứ cấp được gắn huỳnh quang hoặc đánh dấu phóng xạ

và phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm phim X-quang

Nhờ độ phân giải cao của gel và tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch kháng nguyên – kháng thể, kỹ thuật Western blot thường được sử dụng để phân tích biểu hiện protein cũng như đánh giá mức độ dịch mã của gen đích Ngoài ra, kỹ thuật này còn được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh miễn dịch như HIV - AIDS, viêm gan virus…

1.2.2.3 Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen XIAP

Nhìn chung, phần lớn các nghiên cứu về biểu hiện gen XIAP đều dựa trên kỹ thuật khuếch đại gen để định lượng mức độ phiên mã gen XIAP và kỹ thuật Western Blots để phân tích protein XIAP [11, 16, 17] Trong một nghiên cứu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình apoptosis, trong đó có gen XIAP, ở mức độ phiên mã trong tế bào tại mô ung thư nguyên bào thần kinh đệm đa dạng (“glioblastoma”), tác giả Daniela Pretti da Cunha Tirapelli và cộng sự (2017) đã xây dựng mô hình đánh giá biểu hiện cDNA các gen liên quan và thực hiện phản ứng realtime RT-PCR để đánh giá mức độ phiên mã các gen này [17] Nghiên cứu của Doreen Kunze và cộng sự (2008) tại Đức tiến hành phản ứng realtime RT-PCR và đánh giá mức độ phiên mã của gen XIAP, BCL-2, BCL-XL trên các dòng tế bào EJ28, J28 và BCa [16] Tại Việt Nam, tác giả Đỗ Hồng Quảng nghiên cứu ảnh hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào ung thư vú BT474 cũng sử dụng kỹ thuật reatime RT-PCR để đánh giá mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào này Vì vậy, trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật realtime RT-PCR để định lượng mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào ung thư vú BT474 sau khi thử thuốc

1.3 Tổng quan về Glycyl funtumin

1.3.1 Cấu tạo phân tử glycyl funtumin

Glycyl funtumin là một aminosteroid được tìm ra, chiết xuất và phân lập từ năm

1958, tổng hợp toàn phần tại Việt Nam năm 1984 từ pregnenolon qua trung gian phatalimid [1, 2, 3] Glycyl funtumin có tính chất của một amin, dễ bị thủy phân khi đun nóng, có khả năng tham gia phản ứng với acid, phản ứng alkyl hóa và phản ứng oxy hóa khử Phân tử GF có nhóm ceton nên cũng tham gia vào phản ứng cộng hợp vào nhóm carbonyl hoặc phản ứng oxy hóa nhóm carbonyl [2, 3]

Công thức phân tử GF: C23H38O2N2.HCl

Tên khoa học: N-(aminoethanoyl) - 3α – amino - 5α – pregnan – 20 – on

hydroclorid [1]

Hình 1.9 Hình ảnh bao bì thuốc tiêm Aslem [39]

Hiện nay, tại Việt Nam, glycyl funtumin hydroclorid là một hoạt chất được bào chế dưới dạng thuốc tiêm với chế phẩm thuốc có tên thương mại là Aslem có vai trò hỗ trợ kích thích tăng cường miễn dịch Thuốc tiêm Aslem có thành phần hoạt chất chính

15

là glycyl funtumin hydroclorid 0,3 mg và tá dược NaCl 0,9% dưới dạng dung dịch tiêm 1mL, được lưu hành với chỉ định hỗ trợ điều trị trong một số bệnh ung thư và nhiễm khuẩn [39]

1.3.2 Tác dụng dược lý của glycyl funtumin

Ở Việt nam, glycyl funtumin đã được ứng dụng lâm sàng trong hỗ trợ điều trị ung thư nhiều năm qua thông qua tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu Nghiên cứu cho thấy GF có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào Ngoài

ra, GF còn cho thấy tác dụng kích thích sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình in-vitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xạnh kháng kháng sinh [1]

Aslem đã được ghi nhận khả năng phục hồi đáp ứng chuyển dạng lympho bào, kích thích tế bào lympho tăng tiết các cytokin có vài trò kích thích miễn dịch kháng u như IL-2 và IFN-γ, đồng thời giảm tiết các cytokin ức chế miễn dịch như IL-4 và IL-

10 Trên thực tế lâm sàng, phác đồ điều trị kết hợp Fufol-Aslem sau phẫu thuật trên bệnh nhân ung thư đại - trực tràng cho thấy hiệu quả rõ rệt về khả năng phục hồi cả số lượng và chất lượng tế bào miễn dịch ở máu ngoại vi (phục hồi số lượng lympho bào, các dòng CD3, CD4 và CD8, phục hồi đáp ứng chuyển dạng lympho bào); tăng thâm nhiễm tế bào lympho và các nhóm tế bào lympho vào mô ung thư trực tràng so với nhóm chứng dùng Fufol đơn độc Phác đồ kết hợp cho hiệu quả kéo dài hơn 9 đến 11 tháng thời gian sống thêm khi đánh giá tại thời điểm 5 năm sau phẫu thuật so với nhóm đối chiếu [17]

Mặc dù GF đã được chứng minh có tác dụng kích thích miễn dịch và ứng dụng lâm sàng để hỗ trợ điều trị ung thư trong thời gian dài nhưng đến nay, cơ chế gây độc

tế bào ung thư chỉ vừa bước đầu được nghiên cứu Tuy vậy, mức nồng độ 6,0μg/mL

GF đã được nghiên cứu và chứng minh là có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và ức chế 40% mức độ phiên mã gen survivin thử thuốc [4, 5] Do vậy, việc nghiên cứu sự ảnh hưởng của GF lên mức độ phiên mã gen XIAP trên các dòng tế bào ung thư sẽ góp phần nào đó trong công cuộc giải đáp cơ chế phân tử của thuốc và từ

đó, mở ra hướng tổng hợp và phát triển các nhóm thuốc khác trong điều trị ung thư