Nghiên cứu ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã survivin trên dòng tế bào BT474 và a549

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BỘ MƠN HĨA SINH ĐƢỜNG THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ SURVIVIN TRÊN DỊNG TẾ BÀO BT474 VÀ A549 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BỘ MƠN HĨA SINH ĐƢỜNG THỊ HỒNG NHUNG MSV: 1301302 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA GLYCYL FUNTUMIN LÊN MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ SURVIVIN TRÊN DỊNG TẾ BÀO BT474 VÀ A549 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đỗ Hồng Quảng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Sinh – Trƣờng ĐH Dƣợc HN Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài khóa luận này, em nhận nhiều động viên, hỗ trợ giúp đỡ đến từ thầy cô, anh chị, bạn bè người thân thời gian qua Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, mơn, phòng ban, dạy dỗ, truyền đạt tri thức quý báu tạo điều kiện tốt cho em học tập rèn luyện suốt năm học vừa qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị bạn nghiên cứu khoa học Bộ mơn Hóa Sinh, thầy cô, anh chị bạn công tác phòng Cơng nghệ tế bào động vật phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện bảo cho em suốt trình nghiên cứu Với tất kính trọng ngưỡng mộ, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Hồng Quảng - giảng viên Bộ mơn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội Thầy người truyền đạt cho em kiến thức, phương pháp tác phong làm việc nghiêm túc, cẩn thận, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em, tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn - trưởng phòng Cơng nghệ tế bào động vật Viện Công nghệ sinh học, TS Lê Thị Thùy Dƣơng - cán phòng Ứng dụng ADN thuộc Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hỗ trợ nhiều mặt chuyên môn suốt thời gian em nghiên cứu Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn vè động viên, cổ vũ giúp đỡ em suốt thời gian qua Xác nhận GV hướng dẫn Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Đƣờng Thị Hồng Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v DANH MỤC CÁC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan survivin .3 1.1.1 Cấu trúc phân tử 1.1.2 Chức sinh học survivin 1.1.2.1 Vai trò ức chế chết theo chương trình tế bào 1.1.2.2 Survivin phân chia tế bào .8 1.1.2.3 Survivin hình thành mạch 1.1.3 Vai trò survivin ung thư 1.1.3.1 Biểu survivin ung thư .9 1.1.3.2 Cơ chế phân tử survivin ung thư 1.1.3.3 Ứng dụng survivin chuẩn đoán điều trị ung thư 10 1.2 Tổng quan phƣơng pháp đánh giá biểu gen survivin 10 1.2.1 Quá trình biểu gen .10 1.2.2 Các phương pháp đánh giá mức độ biểu gen survivin 11 1.2.2.1 Kỹ thuật PCR 12 1.3 Tổng quan Glycyl funtumin 16 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu .17 1.3.2 Tác dụng dược lí Glycyl funtumin 18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu, trang thiết bị nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .21 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 21 2.2.2 Tách chiết ARN .22 2.2.3 Xác định độ tinh đo phổ hấp thụ máy NanoDrop .22 2.2.4 Phản ứng Real-time RT-PCR phát gen survivin 22 2.2.5 Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR đánh giá biểu gen 24 survivin 24 2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin 24 2.2.7 Xử lý thống kê 25 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết 26 3.1.1 Kết tách chiết xác định độ tinh quang phổ hấp thụ .26 3.1.1.1 Kết quét phổ hấp thụ mẫu sau tách chiết 26 3.1.1.2 Kết đo nồng độ số OD260/280 27 3.1.2 Kết xây dựng đường chuẩn định lượng realtime RT-PCR 28 3.1.3 Kết đánh giá tác dụng Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin 29 3.1.3.1 Tại nồng độ 1,5 3,0 μg/ml .29 3.1.3.2 Tại nồng độ 6,0 μg/ml 31 3.2 Bàn luận .33 3.2.1 Về kết nuôi cấy tách chiết xác định độ tinh quang phổ hấp thụ 33 3.2.2 Về xây dựng đường chuẩn đánh giá hiệu PCR 34 3.2.3 Về đánh giá tác dụng thuốc GF nồng độ khác lên mức độ phiên mã gen survivin sau 24 hai dòng tế bào 35 KẾT LUẬN 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt ADN ARN BIR BIRC5 Bps CARD CC cDNA CP F FBS GF IAP IARC mARN NST NTC OD P/S PBS PCR qRT-PCR R RT-PCR snARN TAE tARN Tên đầy đủ Tiếng Anh Tên Tiếng Việt Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic Baculoviral IAP repeat Chuỗi lặp IAP Baculoviral IAP repeat-containing protein Base pairs Cặp base nitơ Caspase Recruitment Domain Vực trưng tập capase Coiled Coil Vùng CC đầu tận C Complementary ADN ADN bổ sung Crossing Point Chu kì ngưỡng Forward primer Mồi xuôi Fetal bovine serum Huyết bào thai bò glycyl funtumin Inhibitors of Apoptosis Chất ức chế chết theo chương trình tế bào The International Agency Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc for Research on Cancer tế Message ARN ARN thông tin Nhiễm sắc thể Non - template Control Mẫu đối chứng Optical Density Mật độ quang Penicillin/Streptomycine Phosphate buffer saline Dung dịch đệm phosphat Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp quantitative RT-PCR hay Phản ứng PCR phiên mã ngược real-time RT-PCR định lượng Reverse primer Mồi ngược Reverse transcription Phản ứng PCR phiên mã ngược polymerase chain reaction Small Nuclear ARN ARN nhỏ nhân Đệm Tris - Acetate - EDTA Transfer RNA ARN vận chuyển DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein survivin [36] Hình 1.2 Sơ đồ NST 17 vị trí gen survivin [7] Hình 1.3 Cơ chế ức chế apoptosis survivin cách ức chế caspase-9 [49] Hình 1.4 Cơ chế ức chế apoptosis cách gắn với SMAC/DIABLO [49] Hình 1.5 Cơ chế phát huỳnh quang SYBR Green ………………………………15 Hình 1.6 Cơ chế phát huỳnh quang taqman probe …………………………… 16 Hình 1.7 Hình ảnh bao bì thuốc tiêm Aslem [27] 17 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV mẫu ARN chiết từ hai dòng tế bào BT474 A549 26 Hình 3.2 Đường biểu diễn chuẩn dòng tế bào BT474 28 Hình 3.3 Đường biểu diễn chuẩn dòng tế bào A549 28 Hình 3.4 Đồ thị Realtime RT-PCR mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml 29 Hình 3.5 Đồ thị Realtime RT-PCR mức nồng độ 6,0 μg/ml 31 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp mix 23 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi probe 23 Bảng 3.1 Kết nồng độ tinh mẫu ARN dòng tế bào BT474 27 Bảng 3.2 Kết nồng độ tinh mẫu ARN dòng tế bào A549 27 Bảng 3.3 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào BT474 mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc 30 Bảng 3.4 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào A549 mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc 30 Bảng 3.5 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào BT474 mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc 31 Bảng 3.6 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào A549 mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Survivin protein thuộc họ protein có khả ức chế chết theo chương trình tế bào - (IAP’s), gồm 142 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng 16,5 kDa phát từ thư viện gen người năm 1977 [7, 9, 18, 20] Survivin có vai trò quan trọng q trình apoptosis, hình thành mạch phân chia tế bào, biểu gen tế bào u liên quan chặt chẽ tới tiên lượng mức độ kháng trị liệu khối u [7, 20, 36] Có thể thấy việc đánh giá mức độ phiên mã survivin giúp dự đoán tốc độ phát triển đáp ứng với điều trị khối u có ý nghĩa lâm sàng Từ giúp xây dựng phương pháp in-vitro nhằm sàng lọc thuốc có tác dụng chống ung thư theo chế ức chế gen survivin, tạo tiền đề cho nghiên cứu sau Glycyl funtumin dẫn xuất funtumin (3α-amino-5α-pregnan-20-on) aminosteroid chiết xuất phân lập lần năm 1958 từ Funtumia latifolia-staff (Apocynaceae) - loại cỏ có miền Đơng châu Phi [4, 6]; có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào theo chế hoạt hóa chức thực bào đại thực bào tăng chuyển hóa dạng lympho bào [1] Năm 1981, nhóm nghiên cứu Giesen nuôi cấy tế bào ung thư gan mơi trường có glycyl funtumin nồng độ từ 3,3 – 106 µg/ml khoảng thời gian 7h, 24h, 48h Kết nghiên cứu cho thấy: nồng độ µg/ml, sau 7h số lượng tế bào bắt đầu giảm toàn tế bào ung thư gan chết hết sau 48 [13] Tại Việt Nam, nghiên cứu Đào Kim Chi (1984) glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml ức chế phát triển tế bào ung thư [3] Một số nghiên cứu trước nhóm tác giả tác dụng ức chế phiên mã gen survivin glycyl funtumin thực cho kết khả quan: nghiên cứu Lê Hà Phương (2016) cho thấy sau 48 nồng độ 6,0 μg/ml GF ức chế 40% phiên mã gen survivin dòng tế bào ung thư vú BT474 [5], nghiên cứu TS Đỗ Hồng Quảng (2017) cho kết luận glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml làm giảm phiên mã gen survivin dòng tế bào A549 sau 24 Do việc tiếp tục nghiên cứu, làm rõ chế thử nghiệm ảnh hưởng glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin nồng độ khác điều cần thiết Từ xác định mức liều cụ thể có tác dụng để hướng tới thử nghiệm lâm sàng pha xây dựng phác đồ điều trị khoa học hiệu Do chúng tơi tiếp tục thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng glycylfuntumin lên mức độ phiên mã survivin dòng tế bào BT474 A549” với mục tiêu: “ Đánh giá ảnh hưởng glycyl funtumin nồng độ khác lên mức độ phiên mã gen survivin hai dòng tế bào BT474 A549 sau 24 thử thuốc” Nhận xét: Kết cho thấy tất mẫu có tỷ lệ OD260/280 nằm khoảng 1,8 đến 2,0 Như vậy, mẫu ARN tách chiết thu tinh chứng tỏ trình tách chiết tốt để sử dụng cho kỹ thuật 3.1.2 Kết xây dựng đường chuẩn định lượng realtime RT-PCR Từ lượng ARN tổng số đầu vào biết trước mẫu chuẩn, pha loãng theo hệ số 10 tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR Với mẫu phản ứng, giá trị CP số chu kỳ nhiệt mà số lượng đủ để ống phản ứng cho tín hiệu huyenhf quang vượt ngưỡng phát máy, Dựa vào giá trị CP mẫu chuẩn, xây dựng đường biểu diễn chuẩn định lượng mARN/cADN survivin hàm số tương quan đại lượng, từ tính số lượng gen survivin ban đầu có ống phản ứng từ tế bào ung thư BT474 A549 sau nuôi cấy thử thuốc mức nồng độ khác 24 Đường biểu diễn chuẩn với dòng tế bào thể hình 3.2 3.3 Hình 3.2 Đƣờng biểu diễn chuẩn dòng tế bào BT474 y = -1.542x + 26.523 R² = 0.9913 Std curve of A549 30 25 Crossing Point 20 15 Samples Linear (Samples) 10 0 0.5 1.5 2.5 Log concentration Hình 3.3 Đƣờng biểu diễn chuẩn dòng tế bào A549 3.5 Nhận xét: Từ đường biểu diễn hình 3.2 3.3, thấy tương quan số lượng copy tác nhân đích ban đầu đưa vào tín hiệu huỳnh quang thu Cả hai mẫu đối chứng âm khơng chứa ARN hai dòng tế bào khơng phát thấy tín hiệu huỳnh quang 3.1.3 Kết đánh giá tác dụng Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin 3.1.3.1 Tại nồng độ 1,5 3,0 μg/ml Thực phản ứng Realtime RT-PCR với mẫu thử thuốc nồng độ GF 1,5 3,0 μg/ml mẫu đối chứng hai dòng tế bào, thu đồ thị hình 3.4 Hình 3.4 Đồ thị Realtime RT-PCR mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml Nhận thấy, tín hiệu huỳnh quang tất mẫu vượt ngưỡng phát Như gen survivin biểu tất mẫu nhóm chứng nhóm thử hai dòng tế bào hai mức nồng độ Từ giá trị CP - chu kỳ ngưỡng mẫu tính số lượng copies ban đầu gen survivin sau thử thuốc mức nồng độ khác dựa vào đường biểu diễn chuẩn xây dựng Kết phân tích thống kê so sánh tương đối phát khác biệt hai nhóm chứng thử hai dòng tế bào thể bảng 3.3 3.4 Bảng 3.3 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào BT474 mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Nồng độ mARN survivin BT474 ĐC 314,48 379,44 490,16 394,69 ± 88,83 AS 1.5 342,50 81,65 173,03 199,06 ± 108,07 >0,05 AS 533,84 231,29 223,52 329,54 ± 144,49 >0,05 trung bình (ng/μl) p Nhận xét: Đối với dòng tế bào BT474, sau thử thuốc hai mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml, kết cho thấy với p > 0,05 hai mức nồng độ khơng có khác biệt lượng mARN survivin ban đầu ống thử ống chứng Do kết luận Glycyl funtumin hai mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc không ảnh hưởng tới mức độ phiên mã gen survivin đối dòng tế bào Tiến hành tương tự với mẫu dòng tế bào A549 mức nồng độ thu kết bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào A549 mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Nồng độ mARN survivin A549 ĐC 49,49 102,88 43,27 65,21 ± 32,77 AS 1.5 22,10 132,61 32,58 62,43 ± 49,81 >0,05 AS 27,24 43,92 10,63 27,26 ± 13,59 >0,05 trung bình (ng/μl) p Nhận xét: Đối với dòng tế bào A549, sau thử thuốc hai mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml, kết cho thấy với p > 0,05 hai mức nồng độ khác biệt lượng mARN survivin ban đầu ống thử ống chứng Do kết luận Glycyl funtumin hai mức nồng độ 1,5 3,0 μg/ml sau 24 thử thuốc không ảnh hưởng tới mức độ phiên mã gen survivin đối dòng tế bào 3.1.3.2 Tại nồng độ 6,0 μg/ml Phản ứng Realtime RT-PCR tiến hành tương tự với mẫu thử thuốc mẫu đối chứng mức nồng độ 6,0 μg/ml Kết đồ thị realtime RT-PCR hai dòng tế bào biểu diễn hình 3.5 Hình 3.5 Đồ thị Realtime RT-PCR mức nồng độ 6,0 μg/ml Nhận thấy, tín hiệu huỳnh quang tất mẫu vượt ngưỡng phát Như gen survivin biểu tất mẫu nhóm chứng nhóm thử hai dòng tế bào mức nồng độ 6,0 μg/ml Kết phân tích thống kê so sánh tương đối phát khác biệt hai nhóm chứng thử hai dòng tế bào thể bảng 3.5 3.6 với mức nồng độ thuốc thử 6,0 μg/ml Bảng 3.5 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào BT474 mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Nồng độ mARN survivin BT474 ĐC AS trung bình (ng/μl) 4827,72 6343,92 9556,09 6909,24± 2414,34 194,99 406,25 105,47 235,57 ± 126,10 p 95% hay dòng tế bào ung thư vú BT474 Glycyl funtumin ức chế phiên mã gen mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Tiến hành tương tự với mẫu dòng tế bào A549 mức nồng độ thu kết bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết định lượng mức độ phiên mã gen survivin dòng tế bào A549 mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Nồng độ mARN survivin A549 ĐC 738,50 1605,38 772,34 1038,74 ± 400,91 AS6 18,47 25,66 16,39 20,17 ± 3,97 trung bình (ng/μl) p 95% hay dòng tế bào ung thư phổi A549 Glycyl funtumin ức chế phiên mã gen mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 thử thuốc Như kết luận Glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml ức chế phiên mã gen survivin sau 24 thử thuốc hai dòng tế bào BT474 A549 Từ kết luận trên, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 hai dòng tế bào công thức (**) mục 2.2.6 kết thu bảng 3.7 Bảng 3.7 Đánh giá ảnh hưởng GF nồng độ 6,0 μg/ml lên mức độ phiên mã gen survivin sau 24 Mẫu Thông số CP ĐC 20.77 20.61 20.37 AS 22.65 22.22 23.01 5,86 4,55 11,97 ĐC 22,10 21.58 22.07 AS 24,57 24,35 24,65 50,22 80,80 59,78 TB ± SD BT474 Tỷ lệ biểu gen nhóm chứng/thử CP 7,46 ± 3,23 A549 Tỷ lệ biểu gen nhóm chứng/thử 63,60 ± 15,65 Nhận xét: kết thu cho thấy giá trị Tỷ lệ biểu gen nhóm Chứng /Thử tất mẫu lớn 1, GF làm giảm phiên mã gen survivin nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 hai dòng tế bào BT474 A549 Với dòng tế bào ung thưu vú BT474, Glycyl funtumin ức chế phiên mã gen survivin 7,46 ± 3,23 lần, với dòng tế bào A549, Glycyl funtumin ức chế phiên mã gen survivin 63,60 ± 15,65 lần 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về kết nuôi cấy tách chiết xác định độ tinh quang phổ hấp thụ Lựa chọn hai dòng tế bào BT474 A549 dòng tế bào ung thư thường sử dụng để nghiên cứu mức độ biểu gen ung thư vú ung thư phổi, tiếp tục tiến hành nuôi cấy, thử thuốc, tách chiết ARN tổng số chạy phản ứng Realtime RT-PCR định lượng mức độ phiên mã gen survivin ảnh hưởng Glycyl funtumin mức nồng độ sau 24 Có vấn đề hay gặp q trình tách chiết ARN từ mẫu mơ hay tế bào bao gồm ARN nhiễm ADN tổng số, ARN bị phân hủy hay không nguyên vẹn, chất ức chế ARN lượng ARN thu thấp Các vấn đề ảnh hưởng đến số lượng chất lượng ARN tổng số cho bước tiến hành Khi sử dụng dung môi Trizol tách chiết, đứt gãy khơng hồn tồn ADN tổng số q trình nghiền đồng thể nguyên nhân nhiễm ADN vào ARN Cần khắc phục cách làm đồng hoàn toàn ADN tổng số việc sử dụng thiết bị chuyên dụng máy đập hạt gia tốc cao hay polytron rotor stator để phá vỡ cấu trúc ADN Hoặc sử dụng DNase cách tốt để loại bỏ hoàn toàn AND Đảm bảo ARN sau tách giữ nitơ lỏng -80 oC; mẫu mô động vật, sử dụng RNALater giữ -20 oC để giảm thiểu phân hủy ARN, rửa nhiều lần để loại bỏ chất ức chế ARN thao tác cẩn thẩn để nâng cao hiệu suất tách chiết Để khắc phục vấn đề trên, khn khổ thí nghiệm chúng tơi cố gắng chuẩn hóa thao tác, rửa sản phẩm nhiều lần bảo quản sản phẩm tủ lạnh sâu để nâng cao hiểu tách chiết chất lượng mẫu So với tách chiết kit, tách chiết TRIzol đơn giản tốn Sau tách chiết ARN tổng số, tiến hành quét phổ phấp thụ, xác định nồng độ đo OD260, OD280 để xác định độ tinh mẫu chiết Tỷ lệ OD260/280 biểu thị mức độ protein sót lại dịch chiết, mẫu đạt độ tinh trị số xấp xỉ Dựa vào kết quét phổ trị số OD260/280 cho thấy ARN tách chiết tất mẫu tinh chứng tỏ q trình tách chiết tốt, dùng cho bước 3.2.2 Về xây dựng đường chuẩn đánh giá hiệu PCR Đường biểu diễn chuẩn biểu thị mối tương quan nồng độ/số tác nhân đích ban đầu có mẫu chuẩn với giá trị chu kỳ ngưỡng Cp tương ứng Từ đường biểu diễn chuẩn tính số copies ban đầu gen survivin, so sánh mức độ phiên mã gen ống thử so với ống chứng, từ đưa kết luận tác dụng thuốc Một phản ứng PCR đạt lý tưởng phản ứng mà sau chu kỳ nhiệt cường độ huỳnh quang ống phản ứng phải tăng gấp đôi, tức hiệu khuếch đại lý tưởng E = Vậy đường biểu diễn chuẩn lý tưởng phải có độ dốc -3,32 hay slope = 3,32 Phản ứng PCR đạt lý tưởng với E = tương ứng với E% = 100% nhiên thực tế E% = 90%-105% chấp nhận E% > 105% thường pha lỗng mẫu chưa xác từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp mà đầu pipet dính mẫu làm cho nồng độ mẫu có nồng độ thấp cao dự kiến Còn E% < 90% pha loãng mẫu từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp không hút đủ mẫu làm cho mẫu có nồng độ thấp dự kiến Đối với kết xây dựng đường chuẩn hai dòng tế bào này, giá trị R2(BT474) = 0,8356 R2(A549) = 0,9913 gần với 0,99 cho thấy thao tác pipetting đạt độ xác cao Hiệu khuếch đại gen PCR E(BT474) = 2,561 E(A549) = 4,882 cho thấy hiệu khuếch đại gen PCR tiến hành dòng tế bào ung thư vú BT474 xác so với A549 Trong điều kiện thí nghiệm hạn chế, kết nhóm nghiên cứu khơng tránh khỏi sai số, chúng tơi kiến nghị nâng cao chất lượng thí nghiệm để tăng hiệu khuếch đại PCR nghiên cứu 3.2.3 Về đánh giá tác dụng thuốc GF nồng độ khác lên mức độ phiên mã gen survivin sau 24 hai dòng tế bào Survivin, năm gần xem maker ung thư biểu mức tế bào ung thư có giá trị tiên lượng [21,45] Nghiên cứu tăng biểu mạnh mẽ survivin liên qua đế việc hình thành khối u làm tăng ác tính tế bào ung thư phổi [36] Nghiên cứu khác cho thấy lượng lớn protein survivin ảnh hưởng tới tăng sinh tế bào, giảm mức độ apoptosis, tăng sức đề kháng hóa trị liệu, tăng tái phát khối u, rút ngắn thời gian sống bệnh nhân [36] Với vai trò gen ung thư nằm vị trí giao thoa nhiều mạng lưới tín hiệu khác tế bào, liệu pháp điều trị ung thư hướng đích survivin đề xuất nhằm mục đích ức chế khả phát triển khối u tăng cường đáp ứng tế bào ung thư với thuốc chống ung thư, phương pháp đánh giá khả quan liệu pháp điều trị ung thư khác Với kết tách chiết đo quang phổ, khẳng định mẫu ARN tổng số thu tinh để tiếp tục tiến hành thử nghiệm Trong khuôn khổ nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng thuốc lên mức độ phiên mã gen surviving, nên sử dụng kỹ thuật Realtime RT- PCR để đánh giá mức độ phiên mã gen survivin Kỹ thuật sử dụng rộng rãi việc đánh giá biểu gen độ đặc hiệu cao độ xác cao phản ứng PCR thông thường, tránh nhiễm sản phẩm sản phẩm định lượng trực tiếp máy sau chu kỳ nhiệt Nghiên cứu sử dụng probe làm chất màu phát huỳnh quang để tăng hiệu phản ứng nhờ tính đặc hiệu probe cao so với chất màu SYBR Green Trong phương pháp đánh giá biểu gen, ngồi việc đánh giá biểu gen đích người ta đánh giá cách so sánh biểu gen với gen tham chiếu – gen có biểu như mẫu tế bào, cách có độ xác cao tốn phải tiến hành nhiều mẫu lúc Do vậy, khuôn khổ nghiên cứu, đánh giá mức độ phiên mã gen survivin cách so sánh lượng mARN survivin ban đầu có mẫu nhóm chứng nhóm thử Tiếp nối nghiên cứu trước TS Nguyễn Minh Hiền mức độ biểu gen mARN survivin dòng tế bào ung thư vú BT474, nghiên cứu LeeHaf Phương ảnh hưởng Glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml ức chế 40% phiên mã gen survivin dòng tế bào [5], chúng tơi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng GF lên mức độ phiên mã gen survivin nồng độ khác 24 hai dòng tế bào BT4747 A549 Kết cho thấy nồng độ 1,5 3,0 μg/ml Glycyl funtumin làm giảm lượng mARN survivin nhóm thử so với nhóm chứng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Còn với nồng độ 6,0 μg/ml, GF làm giảm mức độ phiên mã gen survivin (p < 0,05) hai dòng tế bào Cụ thể với nồng độ 6,0 μg/ml gen survivin giảm biểu mức độ phiên mã 7,46 ± 3,23 lần dòng tế bào BT474 63,60 ± 15,65 dòng tế bào A549 sau 24 thử thuốc Như vậy, nghiên cứu bước đầu xác lập mức liều cụ thể có tác dụng phiên mã gen survivin hai dòng tế bào ung thư vú BT474 ung thư phổi A549, tạo tiền đề cho nghiên cứu in vitro in vivo Nhiều nghiên cứu nhiều hợp chất khác ngồi GF có tác dụng anti-survivin [21, 37] Ngoài dấu ấn ung thư survivin, nhà nghiên cứu sàng lọc thử nghiệm chất ức chế dấu ấn ung thư khác protein họ Bcl-2, tương tác Survivin Borealin [32]…Có thể thấy việc nghiên cứu chất có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư quan tâm Trong giới hạn nghiên cứu dừng lại xét ảnh hưởng hợp chất cụ thể Glycyl funtumin đích gen survivin, mức nồng độ khởi điểm 24 Vì vậy, kết nghiên cứu này, giúp xác định mức liều cụ thể hỗ trợ cho nghiên cứu mức độ sâu Tuy nhiên, cần khắc phục điểm hạn chế mặt kỹ thuật, điều kiện thí nghiệm chất lượng phản ứng realtime PCR, tiến hành đồng thời nhiều mẫu hơn, nhiều mức nồng độ thời gian lúc có kết khả quan KẾT LUẬN Qua q trình thực nghiệm, chúng tơi rút kết luận sau: - Tại nồng độ 1,5 3,0 μg/ml nồng độ mARN survivin có mẫu sau phơi nhiễm GF (AS 1,5 - BT474) = 199,06 ± 108,07, (AS 3,0 - BT474) = 329,54 ± 144,49, (ĐC BT474) = 394,69 ± 88,83; (AS 1,5 - A549) = 62,43 ± 49,81, (AS 3,0 - A549) = 27,26 ± 13,59, (ĐC A549) = 65,21 ± 32,77 với p