Nghiên cứu chế tạo cao chiết và ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng của cao chiết lá đắng khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG CỦA CAO CHIẾT LÁ ĐẮNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN ANH 1801037 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG CỦA CAO CHIẾT LÁ ĐẮNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền – Khoa Dược liệu & Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn trân trọng, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo ThS Phạm Thái Hà Văn, người cho em hội thực khóa luận mơn Dược học cổ truyền hướng dẫn bảo tận tình cho em từ ngày em tham gia nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo cán công nhân viên môn Dược học cổ truyền khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, ban Giám hiệu Nhà trường cùng phòng ban tồn thể thầy tạo điều kiện thuận lợi cho em thực khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, em khơng thể hồn thành khóa luận tớt nghiệp khơng có giúp đỡ nhiệt thành từ rất nhiều bạn bè Nguyễn Thị Phương Anh, Lý Phương Linh, Nguyễn Thanh Huyền, Đoàn Cẩm Tú, Hoàng Thu Trang, Lê Phan Khánh Linh, Đặng Thị Vân Anh, Đỗ Trang Ngân cùng bạn thực nghiên cứu môn Dược học cổ truyền Cảm ơn bạn rất nhiều đồng hành tiếp thêm cho rất nhiều động lực śt hành trình vừa qua Ći cùng, cảm ơn mẹ ln niềm cảm hứng bất tận để vượt qua khó khăn đường học tập Cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân cịn hạn chế, khóa luận có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận góp ý từ thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Anh MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Lá đắng 1.1.1 Chi Vernonia 1.1.2 Loài Vernonia amygdalina Del 1.2 Tổng quan Lá đắng 1.2.1 Thành phần hóa học .4 1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2.3 Tri thức sử dụng dân gian 1.3 Tổng quan cao đặc [2] .9 1.3.1 Định nghĩa .9 1.3.2 Phương pháp điều chế cao .9 1.3.3 Yêu cầu chất lượng cao .10 1.4 Các phương pháp định lượng luteolin 10 1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) .10 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .11 1.4.3 Một số phương pháp khác 11 1.5 Tổng quan phương pháp hỏa chế 11 1.5.1 Mục đích chế biến thuốc theo phương pháp cổ truyền .11 1.5.2 Phương pháp hỏa chế 12 1.6 Một số nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của Lá đắng 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử, phần mềm nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng 16 2.3.2 Quy trình chiết xuất định lượng luteolin dịch chiết Lá đắng 18 2.3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dược liệu điều kiện chiết xuất tới hàm lượng luteolin dịch chiết Lá đắng 19 2.3.4 Phương pháp khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình xử lý dược liệu tạo cao giàu luteolin từ Lá đắng 19 2.3.5 Điều chế cao theo thông số quy trình tới ưu hóa 20 2.3.6 Khảo sát số tiêu chất lượng cao Lá đắng 21 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .26 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng 26 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 26 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng 27 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xử lý dược liệu điều kiện chiết xuất tới hàm lượng luteolin dịch chiết Lá đắng 30 3.2.1 Nhiệt độ xử lý dược liệu 30 3.2.2 Thời gian xử lý dược liệu 31 3.2.3 Điều kiện chiết xuất luteolin .32 3.3 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu .34 3.3.1 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm .34 3.3.2 Kết tối ưu hóa điều kiện xử lý dược liệu 35 3.4 Kết điều chế cao đặc giàu luteolin theo thơng sớ quy trình tới ưu 37 3.5 Kết khảo sát số tiêu chất lượng của cao đặc điều chế 38 3.5.1 Tính chất 38 3.5.2 Mất khối lượng làm khô 38 3.5.3 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng 38 3.5.4 Định lượng luteolin .39 3.5.5 Định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần 40 3.5.6 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 41 3.6 Bàn luận 42 3.6.1 Về phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng .42 3.6.2 Về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện xử lý dược liệu tạo cao Lá đắng giàu luteolin 43 3.6.3 Về kết điều chế cao quy mô 50 g dược liệu/ mẻ theo thông số quy trình tới ưu 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số hệ dung môi pha động sử dụng định lượng luteolin bằng phương pháp HPTLC 10 Bảng 1.2 Một số hệ dung môi pha động sử dụng định lượng luteolin bằng phương pháp HPLC 11 Bảng 1.3 Các phương pháp trực tiếp 13 Bảng 1.4 Các phương pháp gián tiếp .13 Bảng 1.5 Các phương pháp hỏa chế khác 14 Bảng 2.1 Cách pha dãy dung dịch chuẩn acid gallic .23 Bảng 3.1 Kết khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 28 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng luteolin 28 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại độ chính xác trung gian 29 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ 30 Bảng 3.5 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 35 Bảng 3.6 Kết phân tích phương sai ANOVA của mô hình biểu thị mới tương quan hàm lượng luteolin dịch chiết biến đầu vào 36 Bảng 3.7 Kết kiểm định mô hình bằng thực nghiệm (n = 3) 37 Bảng 3.8 Kết điều chế cao đặc mẫu dược liệu không xử lý có xử lý .37 Bảng 3.9 Kết khảo sát tiêu mất khối lượng làm khô 38 Bảng 3.10 Kết định lượng luteolin cao đặc điều chế 39 Bảng 3.11 Kết đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn luteolin 40 Bảng 3.12 Kết định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần mẫu cao thử 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của số saponin có V amygdalina Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của số flavonoid có V amygdalina .5 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của sớ sesquiterpen lacton có V amygdalina Hình 2.1 Sơ đồ quy trình điều chế cao đặc Lá đắng giàu luteolin .21 Hình 2.2 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 24 Hình 3.1 Phổ hấp thụ phân tử UV – Vis của luteolin khoảng 190 – 400 nm .26 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu ghi bước sóng 349 nm 27 Hình 3.3 Chồng phổ UV – Vis của pic chất chuẩn luteolin pic tương ứng sắc ký đồ của mẫu thử 27 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ luteolin diện tích pic 29 Hình 3.5 Kết khảo sát nhiệt độ xử lý dược liệu .31 Hình 3.6 Kết khảo sát thời gian xử lý dược liệu 32 Hình 3.7 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 33 Hình 3.8 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 33 Hình 3.9 Kết khảo sát nồng độ EtOH 34 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng luteolin dịch chiết với biến đầu vào 36 Hình 3.11 Hình ảnh cao đặc điều chế 38 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC của cao đặc Lá đắng (chưa xử lý – X, xử lý – 200) chất chuẩn luteolin đối chiếu (C) 39 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn mới tương quan nồng độ acid gallic chuẩn độ hấp thụ quang A 40 Hình 3.14 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH của mẫu chứng dương (chuẩn acid gallic) .41 Hình 3.15 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH của mẫu cao dược liệu nguyên trạng .41 Hình 3.16 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH của mẫu cao dược liệu xử lý .42 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DĐVN V Dược điển Việt Nam V MeOH Methanol EtOH Ethanol BHT Butylated hydroxytoluen DL Dược liệu ERK Extracellular signal – regulated protein kinase (protein kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào) DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl V amygdalina Vernonia amygdalina STZ Streptozotocin OFAT One factor at the time RSD Độ lệch chuẩn tương đối TLC Sắc ký lớp mỏng HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) có nguồn gớc chủ yếu từ châu Phi, với đặc tính dễ thích nghi phát triển nhanh nên có mặt nhiều nơi giới, đó có Việt Nam Dân gian thường quen gọi với nhiều tên khác mật gấu miền Nam, Nam Phi diệp, … Trên giới, có nhiều nghiên cứu tìm hiểu khả chống oxy hóa của chiết xuất từ Lá đắng [27, 56] Tuy nhiên, Việt Nam nay, chưa có nhiều nghiên cứu vào khai thác tiềm của chúng Các nghiên cứu chủ yếu bao gồm phân lập thành phần hướng tác dụng chống oxy hóa hoặc đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro mà chưa vào định lượng thành phần có hoạt tính cụ thể [3, 6] Thành phần hóa học của Lá đắng xác định có chứa 30 hoạt chất với hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm sesquiterpen lacton, steroid saponin, steroid glycosid flavonoid Flavonoid Lá đắng có luteolin 7-O-β-glucurosid, luteolin 7-O-β-glucosid luteolin Trong flavon, luteolin cho thấy khả chống oxy hóa cao nhất lớn đáng kể so với chất chống oxy hóa tổng hợp BHT cùng nồng độ [25] Bên cạnh đó, nay, điều chế cao dược liệu với hàm lượng hoạt chất cao xu hướng phát triển của dược phẩm Trong trình chế biến tạo cao, nhiệt độ xử lý dược liệu hay phương pháp hỏa chế yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến thành phần hóa học có thể dẫn đến thay đổi tác dụng của vị thuốc Do đó, tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ sử dụng cách hợp lý với dược liệu cụ thể yếu tố quan trọng có thể làm tăng tác dụng của vị thuốc Với lý nêu trên, đề tài “Nghiên cứu chế tạo cao chiết ảnh hưởng nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng cao chiết Lá đắng” thực với hai mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa điều kiện xử lý dược liệu tạo cao chiết Lá đắng giàu luteolin Bước đầu điều chế cao đặc giàu luteolin từ Lá đắng quy mô 50 g/mẻ dựa điều kiện xử lý dược liệu khảo sát CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Lá đắng 1.1.1 Chi Vernonia 1.1.1.1 Vị trí phân loại Theo số tài liệu, chi Vernonia xếp vào vị trí phân loại sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae) Chi (Vernonia Schreber) Chi Vernonia gồm khoảng 1000 loài sử dụng rộng rãi vùng nhiệt đới châu Á châu Phi, Bắc Nam Mỹ; 31 loài Trung Quốc [59] Tại Viêt Nam, chi Vernonia có khoảng 28 lồi, đó có sớ lồi sử dụng làm thuốc - Bạch đầu gai, Bạch đầu trung (Vernonia annamica (Gagnep.) Merr.) Trạch lan (Vernonia anthelmintica (L.) Willd) Cúc đại mộc, Bông bạc, Bạc đầu đỏ (Vernonia arborea Buch.-Ham ex D - Don) Bạch đầu nhám (Vernonia aspera [Roxb.] Buch.-Ham) Cúc bạc (Vernonia attenuata (Wall.) DC) Bạch đầu balansa (Vernonia balansae Gagnep) Cúc bạc đầu (Vernonia bonapartei Gagnep) - Dạ hương ngưu, Bạch đầu ông (Vernonia cinrea (L.) Less) Dây chè, Cô sóng, Đỏ (Vernonia cumingiana Benth) Cúc cưa, Bạch đầu rẽ (Vernonia divergens (DC.) Edgew) Dây dọi tên, bạch đầu bầu dục (Vernonia elliptica DC var elaeagnifolia DC) - Bạch đầu râu (Vernonia esculenta Hemsl) - Bạch đầu to (Vernonia macrachaenia Gagnep) 1.1.1.2 Đặc điểm Dạng sống cỏ, bụi hoặc gỗ, dạng dây leo, sống năm hoặc lâu năm Lông đơn giản hoặc dạng chữ T có tuyến hình cầu khơng ćng Lá mọc so le, mọc đối, có cuống hoặc không cuống, thường khơng rõ - ràng; mép ngun hoặc hình cưa, gân hình lơng chim Cụm hoa tạo thành chùy hoặc ngù, đầu hoặc nách lá, hoặc cụm hoa đơn Tổng bao hoa phía hình bát thu dần thành hình trụ hẹp, xếp chồng lên thành hàng, bắc bên ngắn hơn, bắc bên thường rụng sớm Đế hoa phẳng, có gờ nhỏ, hợp chất kém bền với nhiệt độ, bao gồm sớ polyphenol Ngồi ra, nhiệt độ cao gây biến tính, thay đổi độ tan số thành phần chất tan có cấu trúc polyphenol 3.5.6 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH Kết đo độ hấp thụ quang A của mẫu thuốc thử DPPH 1,554 Nồng độ acid gallic chuẩn (µg/mL) Độ hấp thụ quang A Hoạt tính chớng oxy hóa (I%) 6,63 1,382 11,07 13,25 1,132 27,16 26,50 0,609 60,81 Hoạt tính chống oxy hóa (I%) 3.5.6.1 Mẫu chuẩn acid gallic 120 100 80 60 y = 32.8645ln(x) - 50.7905 R² = 0.9307 40 20 50 100 Nồng độ Acid gallic ch̉n 106,00 0,131 92,57 (µg/mL) Hình 3.14 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH của mẫu chứng dương (chuẩn acid gallic) Từ đồ thị trên, tính IC50 của acid gallic chuẩn 21,47 µg/ mL 3.5.6.2 Mẫu cao dược liệu nguyên trạng 0,094 Nồng độ cao (mg/mL) Độ hấp thụ quang A Hoạt tính chống oxy hóa (I%) 0,13 1,462 5,92 0,26 1,279 17,70 0,53 0,976 37,19 1,05 0,586 62,29 2,10 0,163 89,51 93,95 Hoạt tính chống oxy hóa (I%) 53,00 120 100 80 60 40 y = 27.896ln(x) + 59.38 R² = 0.9742 20 0 4,20 0,100 93,56 Nồng độ cao (mg/mL) Hình 3.15 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH của mẫu cao dược liệu nguyên trạng Từ đồ thị, tính IC50 của mẫu cao dược liệu nguyên trạng 0,71 mg/mL 41 Nồng độ cao (mg/mL) Độ hấp thụ quang A Hoạt tính chống oxy hóa (I%) 0,13 0,26 0,53 1,05 2,10 1,384 1,226 1,036 0,477 0,157 5,92 17,70 37,19 62,29 89,51 Hoạt tính chống oxy hóa (I%) 3.5.6.3 Mẫu cao dược liệu xử lý 120 100 80 60 y = 27.204ln(x) + 59.856 R² = 0.9544 40 20 Nồng độ cao (mg/mL) Hình 3.16 Kết quả thử hoạt tính ức chế gớc tự DPPH của mẫu cao dược liệu xử lý 4,20 0,086 93,56 Từ đồ thị, tính IC50 của mẫu cao dược liệu xử lý 0,70 mg/mL Nhận xét: STT Mẫu IC50 Cao dược liệu không xử lý 0,71 mg/mL Cao dược liệu xử lý 0,70 mg/mL Acid gallic chuẩn 21,47 µg/mL Kết cho thấy mẫu cao dược liệu trước sau xử lý có IC50 không chênh lệch nhiều 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng Hiện chưa có nhiều nghiên cứu xác định hoạt chất chính Lá đắng, đồng thời chưa có nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất Lá đắng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) lựa chọn để tiến hành nghiên cứu định lượng luteolin phương pháp phổ biến sử dụng định lượng hợp chất thiên nhiên, có độ nhạy cao kết chính xác Tham khảo tài liệu [50, 63, 64], tiến hành khảo sát kết điều kiện sắc ký lựa chọn sau: ➢ Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; µm) ➢ Pha động: Acetonitril : nước = 30 : 70 ➢ Tốc độ dòng: mL/ phút ➢ Detector DAD với bước sóng 349 nm ➢ Thể tích tiêm mẫu: 20 µL 42 Q trình thẩm định phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đạt giới hạn yêu cầu Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn phù hợp 3.6.2 Về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện xử lý dược liệu tạo cao Lá đắng giàu luteolin ➢ Lựa chọn yếu tố chiết xuất để khảo sát: o Phương pháp chiết xuất: Lựa chọn phương pháp ngâm ấm cách tiến hành thiết bị đơn giản, phù hợp để nâng cấp quy mô công nghiệp o Dung môi chiết xuất: Tiến hành khảo sát sơ bộ, lựa chọn dung môi ethanol – nước để chiết xuất dung mơi an tồn, dễ kiếm, sử dụng phổ biến công nghiệp Khảo sát dung môi ethanol – nước mức nồng độ ethanol 0%, 20%, 40%, 60%, 80% Kết sơ cho thấy dung môi ethanol 40% cho hàm lượng luteolin chiết cao nhất o Nhiệt độ chiết xuất: Trong công nghiệp, thường giới hạn nhiệt độ chiết xuất 80oC nhiệt độ cao làm tăng chi phí sản xuất, làm chuyển dạng cấu trúc hoặc phá hủy hoạt chất, gây nguy hiểm ảnh hưởng lâu dài đến thiết bị sử dụng Do vậy, tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết xuất giá trị nhiệt độ 30 – 80oC Kết sơ cho thấy chiết xuất 60oC cho hàm lượng luteolin chiết cao nhất o Thời gian chiết xuất: Khảo sát thời gian chiết xuất mức 30 – 60 – 90 – 120 – 150 – 180 phút cho kết 120 phút hàm lượng luteolin chiết cao nhất ➢ Lựa chọn nhiệt độ xử lý dược liệu: Đối với mẫu dược liệu xử lý qua nhiệt độ, hàm lượng luteolin có xu hướng tăng tỷ lệ thuận với nhiệt độ xử lý Điều có thể giải thích điều kiện nhiệt độ xử lý, độ bền học của tế bào dược liệu giảm, chất nguyên sinh bị đông vón nên dung môi dễ dàng thấm vào khuếch tán hoạt chất khỏi tế bào thuận lợi Bên cạnh đó, nhiệt độ cao có thể xảy qua trình phân hủy hợp chất luteolin 7-O-βglucurosid, luteolin 7-O-β-glucosid tạo dạng aglycon, luteolin thứ cấp tạo nhiều luteolin sơ cấp bị phân hủy nhiệt độ cao Trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ năm 2003, Khương Thị Mai Lan thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến flavonoid hòe hoa” báo cáo có tượng: sấy nhiệt độ cao, hàm lượng rutin giảm dần hàm lượng quercetin tăng (có thể lên tới 500% so với dược liệu sống) Có tương đồng cấu trúc của luteolin quercetin, rutin dạng glycosid của quercetin Do vậy, có thể 43 sơ kết luận với hàm lượng luteolin Lá đắng tăng dần tăng nhiệt độ sấy bất thường Do điều kiện thực nghiệm không thể tiếp tục tăng nhiệt độ sấy 210oC nên lựa chọn khoảng nhiệt độ 160 – 200oC để tiến hành khảo sát chi tiết thí nghiệm tối ưu hóa Tuy nhiên, thực tế sản xuất, nhiệt độ sấy cao gây tốn kém chi phí điện thiết bị cùng an toàn sản xuất nên ít lựa chọn xử lý dược liệu nhiệt độ cao ➢ Lựa chọn thời gian xử lý dược liệu: Ở cùng nhiệt độ xử lý, khảo sát khoảng thời gian sấy 10 – 15 – 20 – 30 – 45 – 60 – 75 phút cho kết sấy dược liệu 20 phút cho hàm lượng luteolin cao nhất Tuy nhiên, chênh lệch hàm lượng luteolin dược liệu sấy 15 phút 20 phút không lớn nên lựa chọn thời gian xử lý dược liệu khoảng 10 – 20 phút để tiến hành khảo sát chi tiết thí nghiệm tối ưu hóa Khi tăng dần thời gian xử lý dược liệu, hàm lượng luteolin chiết xuất dược liệu tăng lên có thể do: thời gian xử lý kéo dài làm thay đổi cấu trúc, độ bền học của tế bào dược liệu giảm, tăng khả thấm dung môi vào dược liệu; nhiệt phân cắt gốc đường dạng glycosid của luteolin tạo dạng aglycon Tuy nhiên, thời gian xử lý kéo dài có thể làm phân hủy hoạt chất, đặc biệt với chất có hoạt tính chống oxy hóa luteolin 3.6.3 Về kết điều chế cao quy mô 50 g dược liệu/ mẻ theo thông số quy trình đã tối ưu Thực song song điều chế mẫu cao từ dược liệu không xử lý dược liệu xử lý theo thơng sớ quy trình tới ưu Kết định lượng mẫu cao quan sát thấy, nâng quy mơ của quy trình lên 50 lần, hàm lượng luteolin bị ảnh hưởng nhiều Điều có thể giải thích quy mô nhỏ (1 g/mẻ), thể tích dịch chiết nhỏ, thời gian sấy thành cắn nhanh; quy mô lớn (50 g/mẻ), dịch chiết sau cô thu hồi bớt dung môi, cần tiếp tục cho vào tủ sấy tĩnh mức nhiệt độ 50 – 60oC – ngày đạt thể chất cao đặc, thời gian sấy kéo dài gây phân hủy hoạt chất 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian triển khai thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết quả: Xây dựng phương pháp định lượng luteolin cao Lá đắng: Điều kiện sắc ký lựa chọn sau: - Cột: C18 Inertsustain GL Science (250 x 4,6 mm; µm) - Pha động: Acetonitril : nước = 30 : 70 Tốc độ dòng: mL/ phút - Detector DAD với bước sóng 349 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 µL Khảo sát điều kiện xử lý dược liệu Lá đắng, bao gồm: nhiệt độ xử lý thời gian xử lý Từ đó, lựa chọn điều kiện xử lý dược liệu tối ưu để tạo cao chiết Lá đắng giàu luteolin bằng phương pháp bề mặt đáp ứng sau: - Nhiệt độ xử lý: 200oC - Thời gian xử lý: 16 phút Bước đầu điều chế cao đặc giàu luteolin từ Lá đắng quy mô 50 g/mẻ dựa điều kiện xử lý dược liệu khảo sát Hiệu suất chiết cao 19,43 % hàm lượng luteolin cao 4,371 ± 0,341 mg/g Ngồi ra, khảo sát sớ tiêu chất lượng của cao Lá đắng điều chế bao gồm: - Tính chất: Mẫu cao khối đặc quánh đồng nhất màu nâu sẫm đến đen, có mùi đặc trưng, vị đắng Hàm ẩm: 11,68% Định tính luteolin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Lựa chọn hệ dung môi toluen : ethyl acetat : acid formic = : : - Xác định hàm lượng polyphenol tồn phần khả chớng oxy hóa in vitro thông qua khả ức chế gốc tự DPPH 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa thơng sớ quy trình để điều chế cao Lá đắng: điều kiện chiết xuất, loại tạp, cô đặc sấy tạo cao thành phẩm Nghiên cứu nâng quy mô tạo cao - Đừng làm tiếp 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội (2014), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 316-324 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V Tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr PL9-10 Bùi Hồng Minh, et al (2020), "Phân lập thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxi hóa Lá đắng (Vernonia amygdalina Delile, Asteraceae)", Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành 9, tr 44-51 Lê Thị Mi Chi, Kiều Loan, Lê Thị Đại Phương (2016), "Khảo sát sơ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu hình thái của Lá đắng", Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Đà Nẵng 11, tr 78-81 Nguyễn Khoa Hiền, et al (2018), "Cây đắng (Vernonia amygdalina Delile) hoạt tính sinh học", Tạp chí Cơng Thương 14, tr 412-418 Nguyễn Trung Quân, et al (2022), "Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết ethanol từ Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) thu hái Bà Rịa Vũng Tàu", Tạp chí Khoa học - Đại học Thủ Dầu Một 4(59), tr 84-92 Tiếng Anh Abosi A O., Raseroka B H (2003), "In vivo antimalarial activity of Vernonia amygdalina", British Journal of Biomedical Science 60(2), pp 89-91 Adaramoye O A., et al (2008), "Lipid-lowering effects of methanolic extract of Vernonia amygdalina leaves in rats fed on high cholesterol diet", Vasc Health 10 11 12 Risk Manag 4(1), pp 235-241 Ademola I O., Eloff J N (2011), "Anthelminthic activity of acetone extract and fractions of Vernonia amygdalina against Haemonchus contortus eggs and larvae", Trop Anim Health Prod 43(2), pp 521-527 Alara O R., et al (2019), "Effect of drying methods on the free radicals scavenging activity of Vernonia amygdalina growing in Malaysia", Journal of King Saud University - Science 31(4), pp 495-499 AOAC (2023), "Guidelines for standard method performance requirements", Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL 22nd Edition, Oxford University Press Arhoghro M., et al (2009), "Effect of aqueous extract of bitter leaf (Vernonia Amygdalina Del.) on carbon tetrachloride (CCl4) induced liver damage in Albino Wistar rats", European Journal of Scientific Research 26, pp 122-130 13 Asante D B., et al (2019), "Anti-inflammatory, anti-nociceptive and antipyretic activity of young and old leaves of Vernonia amygdalina", Biomedicine & 14 Pharmacotherapy 111, pp 1187-1203 Barnes P., et al (2020), "Ameliorative effect of Vernonia amygdalina plant extract on heavy metal-induced liver and kidney dysfunction in rats", Advances 15 in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences 2020, p 2976905 Bhattacharjee B., et al (2013), "Vernonia amygdalina Delile (Asteraceae) – An African medicinal plant introduced in India", Zoos' Print Journal 28, pp 18 – 20 16 Chukwuemeka N O., et al (2018), "Antibacterial assay and reversion of carbon tetrachloride induced liver damage on wistar mice by Vernonia amygdalina 17 Delile", Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 31(4), pp 1311-1321 Degu A., et al (2020), "Evaluation of the antidiarrheal activity of hydromethanol crude extracts of Ruta chalepensis and Vernonia amygdalina in mice", Evidence- 18 based Complementary and Alternative Medicine 2020, p 8318713 Céu de Madureira M., et al (2002), "Antimalarial activity of medicinal plants used in traditional medicine in S Tomé and Príncipe islands", Journal of 19 20 21 22 23 Ethnopharmacology 81(1), pp 23-29 Dumas N G E., et al (2021), "Secondary metabolite contents and antimicrobial activity of leaf extracts reveal genetic variability of Vernonia amygdalina and Vernonia calvoana morphotypes", Biotechnology and Applied Biochemistry 68(4), pp 938-947 Erukainure O L., et al (2019), "Vernonia amygdalina Del stimulated glucose uptake in brain tissues enhances antioxidative activities; and modulates functional chemistry and dysregulated metabolic pathways", Metabolic Brain Disease 34(3), pp 721-732 Garba Z N., Oviosa S (2019), "The effect of different drying methods on the elemental and nutritional composition of Vernonia amygdalina (bitter leaf)", Journal of Taibah University for Science 13(1), pp 396-401 Hasibuan P A Z., et al (2020), "The anticancer activities of Vernonia amygdalina Delile leaves on 4T1 breast cancer cells through phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway", Heliyon 6(7) Howard C B., Izevbigie E B., Opata M M (2014), "Inhibition of paclitaxelresistant MCF-7 RAg cell growth by Vernonia amygdalina extract", Clinical Cancer Research 12(19_Supplement), p B49 24 Igile G., et al (1995), "Vernonioside D and E, two novel saponins from Vernonia amygdalina Del (Compositae)", Journal of Natural Products 589, pp 1438- 25 1443 Igile G O., et al (1994), "Flavonoids from Vernonia amygdalina and their antioxidant activites", Journal of agricultural and food chemistry 42(11), pp 26 2445-2448 Iwalokun B A (2008), "Enhanced antimalarial effects of chloroquine by aqueous Vernonia amygdalina leaf extract in mice infected with chloroquine resistant and sensitive Plasmodium berghei strains", African Health Sciences 27 8(1), pp 25-35 Iwalokun B A., et al (2006), "Hepatoprotective and antioxidant activities of 28 Vernonia amygdalina on acetaminophen-induced hepatic damage in mice", Journal of Medicinal Food 9(4), pp 524-530 Izevbigie E B (2003), "Discovery of water-soluble anticancer agents (edotides) 29 from a vegetable found in Benin City, Nigeria", Experimental Biology Medicine 228(3), pp 293-298 Izevbigie E B., Bryant J L., Walker A M (2004), "A novel natural inhibitor of 30 31 32 33 34 35 extracellular signal-regulated kinases and human breast cancer cell growth", Experimental Biology Medicine 229, pp 163 - 169 Jisaka M., et al (2010), "Bitter steroid glucosides, vernoniosides A1, A2, and A3, and related B1 from a possible medicinal plant, Vernonia amygdalina, used by wild chimpanzees", Cheminform 23, pp 279-279 Jisaka M., et al (1993), "Steroid glucosides from Vernonia amygdalina, a possible chimpanzee medicinal plant", Phytochemistry 34(2), pp 409-413 Johnson W., Tchounwou P B., Yedjou C G (2017), "Therapeutic mechanisms of Vernonia amygdalina Delile in the treatment of prostate cancer", Molecules 22(10) Lan D., et al (2018), "Determining the contents of rupestonic acid, vitexicarpin, apigenin, and luteolin in Artemisia rupestris L in different growth stages by thinlayer chromatographic scanning", Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 31, pp 190-196 Liu X., et al (2022), "Bisabolane-type sesquiterpenes from Vernonia amygdalina: Absolute configuration and anti-inflammatory activity", Phytochemistry 201, p 113283 Luo X., et al (2011), "Isolation and structure determination of a sesquiterpene lactone (vernodalinol) from Vernonia amygdalina extracts", Pharmaceutical biology 49, pp 464-470 36 Masaba S C (2000), "The antimalarial activity of Vernonia amygdalina Del (Compositae)", Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and 37 Hygiene 94(6), pp 694-695 Mekoya A., et al (2008), "Multipurpose fodder trees in the Ethiopian highlands: Farmers’ preference and relationship of indigenous knowledge of feed value with 38 laboratory indicators", Agricultural Systems 96(1), pp 184-194 Michael U A., et al (2010), "Antidiabetic effect of combined aqueous leaf extract of Vernonia amygdalina and metformin in rats", Journal of Basic Clinical Pharmacy 1(3), p 197 39 Mosisa Gudeta B., et al (2020), "Evaluation of anti-diarrheal activity of 80% methanol extracts of Vernonia amygdalina Delile (Asteraceae) leaves in mice", 40 Journal of Experimental Pharmacology 12, pp 455-462 Musongong G., et al (2004), "In vitro toxicity of ethanolic plant extracts from Adamawa Province, Cameroon to infective larvae of Strongyloides papillosus", 41 Journal of Biological Sciences 4, pp 763-767 Njan A A., et al (2008), "The analgesic and antiplasmodial activities and toxicology of Vernonia amygdalina", Journal of Medicinal Food 11(3), pp 574- 43 81 Nwankwo C (2017), "Effect of drying temperatures on mineral composition and bacterial populations of Vernonia amygdalina (Bitter Leaf)", Research Journal of Food Science and Quality Control 3(2), pp 39-49 Obaseiki-Ebor E E., et al (1993), "Antimutagenic activity of extracts of leaves 44 of four common edible vegetable plants in Nigeria (west Africa)", Mutation Research 302(2), pp 109-117 Ogbebor N O., Adekunle A T., Enobakhare D A (2007), "Inhibition of 42 45 46 47 Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Sac causal organism of rubber (Hevea brasiliensis Muell Arg.) leaf spot using plant extracts", African Journal of Biotechnology 6, pp 213-218 Opata M M., Izevbigie E B (2006), "Aqueous Vernomia amygdalina extracts alter MCF-7 cell membrane permeability and efflux", International Journal of Environmental Research and Public Health 3(2), pp 174-179 Orisajo S B., Dongo L N (2005), "Nematicidal potential of some indigenous plant extracts against root-knot nematode on cacao", African Scientist 6(6), pp 129-134 Owolade O F., Amusa A N., Osikanlu Y O K (2000), "Efficacy of certain indigenous plant extracts against seed-borne infection of Fusarium moniliforme on maize (Zea mays L.) in South Western Nigeria", Cereal Research Communications 28(3), pp 323-327 48 Patel N G., et al (2015), "Validated HPTLC method for quantification of luteolin and apigenin in Premna mucronata Roxb., Verbenaceae", Advances in Pharmacological Sciences 2015, p 682365 49 Satpathy S., Patra A., Ahirwar B (2018), "Development and validation of a novel high-performance thin-layer chromatography method for the simultaneous determination of apigenin and luteolin in Hygrophila spinosa T Anders", JPC Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 31, pp 437-443 50 Shuai W., et al (2007), "Determination of luteolin and quercetin in the capsule of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo by HPLC coupled with weighted least 51 squares linear regression", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 30(13), pp 1991-1999 Suleiman M N., Emua S A., Taiga A (2008), "Effect of aqueous leaf extracts 52 on a spot fungus (Fusarium sp) isolated from Compea", American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture 2, pp 261-263 Tadesse A., et al (1993), "In vitro activity of Vernonia amygdalina on 53 54 55 56 57 58 Leishmania aethopica", Ethiopian medical journal 31, pp 183-189 Tesio A Y., Robledo S N (2021), "Analytical determinations of luteolin", Biofactors 47(2), pp 141-164 Tona L., et al (2004), "In vitro antiplasmodial activity of extracts and fractions from seven medicinal plants used in the Democratic Republic of Congo", Journal of Ethnopharmacology 93(1), pp 27-32 Uduak Akpan O., Idorenyin Udo U (2017), "Comparison of antioxidant activity of insulin, Ocimum gratissimum L., and Vernonia amygdalina L in type diabetic rat model", Journal of Integrative Medicine 15(4), pp 302-309 Ugbaja R N., et al (2021), "Flavonoid-rich fractions from Clerodendrum volubile and Vernonia amygdalina extenuates arsenic-invoked hepato-renal toxicity via augmentation of the antioxidant system in rats", Clinical Nutrition Open Science 35, pp 12-25 Ugueri U., et al (2015), "Phytochemical analysis of Vernonia amygdalina and Ocimum gratissimum extracts and their antibacterial activity on some drug resistant bacteria", American Journal of Research Communication 3, pp 225235 Wang J., et al (2018), "Steroidal saponins from Vernonia amygdalina Del and their biological activity", Molecules 23(3), p 579 59 Wu Z Y., et al (2011), "Vernoniae", Flora of China Volume 20 – 21 (Asteraceae), pp 354–370 60 Yeap S K., et al (2010), "Vernonia amygdalina, an ethnoveterinary and ethnomedical used green vegetable with multiple bioactivities", Journal of Medicinal Plants Research 4, pp 2787-2812 61 62 Yedjou C G., et al (2022), "Vernonia amygdalina Delile induces apoptotic effects of PC3 cells: Implication in the prevention of prostate cancer", Journal of Biomedical Research & Environmental Sciences 3(9), pp 1118-1124 Yusoff S F., et al (2020), "Antifungal activity and phytochemical screening of Vernonia amygdalina extract against Botrytis cinerea causing gray mold disease on tomato fruits", Biology 9(9), p 286 63 Zhu T., Row K H (2011), "Box-Behnken design for optimizing extraction of luteolin from celery leaves", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 34, pp 1036-1049 Tiếng Trung 64 Dolkun P., et al (2022), "HPLC法分别测定大苞荆芥中2种黄酮及其糖苷的含 量", Science and Technology of Food Industry 43, pp 289-297 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC MẪU TIÊU BẢN PHỤ LỤC GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG LUTEOLIN CỦA MỘT SỐ MẪU THỬ