PHẠM THẾ ANH ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG của hệ PHÂN tán rắn đa cấu tử tới KHẢ NĂNG KHUẾCH tán và SINH KHẢ DỤNG của ITRACONAZOL KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THẾ ANH ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ PHÂN TÁN RẮN ĐA CẤU TỬ TỚI KHẢ NĂNG KHUẾCH TÁN VÀ SINH KHẢ DỤNG CỦA ITRACONAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THẾ ANH MÃ SINH VIÊN: 1501027 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ PHÂN TÁN RẮN ĐA CẤU TỬ TỚI KHẢ NĂNG KHUẾCH TÁN VÀ SINH KHẢ DỤNG CỦA ITRACONAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thạch Tùng DS Bùi Quang Đông Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế VKNATVSTPQG HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thạch Tùng, TS Trần Cao Sơn, DS Bùi Quang Đông động viên, hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Bào chế, anh chị công tác Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hết lòng quan tâm, hỗ trợ tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tâm huyết truyền đạt cho em kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn anh, chị, em, bạn bên ủng hộ, quan tâm, động viên, giúp đỡ em sống học tập, cho em thêm động lực để học tập, rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2020 Sinh viên Phạm Thế Anh MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan itraconazol 1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Đặc điểm dược động học 1.1.4 Tác dụng dược lý, định 1.1.5 Một số chế phẩm thị trường 1.2 Một số phương pháp đánh giá khả giải phóng dược chất từ hệ phân tán rắn 1.2.1 Phương pháp thử hòa tan 1.2.2 Phương pháp thử khuếch tán 1.3 Khái niệm hệ phân tán rắn 1.4 Các phương pháp xử lý mẫu phân tích huyết tương 1.4.1 Mục đích xử lý mẫu phân tích dịch sinh học 1.4.2 Một số loại dịch sinh học 1.4.3 Các phương pháp xử lý mẫu phân tích huyết tương CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp bào chế 19 2.3.2 Phương pháp đánh giá 20 2.3.3 Công cụ xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu phương pháp định lượng 27 3.1.1 Phương pháp định lượng itraconazol sắc ký lỏng hiệu cao 27 3.1.2 Phương pháp định lượng itraconazol huyết tương phương pháp LC-MS/MS 28 3.2 Ảnh hưởng thành phần hệ phân tán rắn tới khả khuếch tán dược chất 34 3.2.1 Ảnh hưởng polyme 35 3.2.3 Ảnh hưởng hỗn hợp polyme 37 3.2.4 Ảnh hưởng tá dược acid: acid fumaric maleic 39 3.3 Kết thử hòa tan chuyển pH 42 3.4 Kết theo dõi độ ổn định vật lý hệ phân tán rắn nhiễu xạ tia X 43 3.4.1 Ảnh hưởng polyme 43 3.4.2 Ảnh hưởng tá dược acid 43 3.5 Kết đánh giá sinh khả dụng động vật thí nghiệm 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 Kết luận 48 Đề xuất 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO CR DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Controlled release - Giải phóng kiểm sốt DC Dược chất DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose HPMCP Hydroxy propyl methyl cellulose phthalat HPTR Hệ phân tán rắn ITZ Itraconazol OH-ITZ Hydroxyitraconazol MeOH Methanol TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TLTK Tài liệu tham khảo VĐH Vơ định hình XRD Nhiễu xạ tia X SE Standard error – Sai số chuẩn AUC Diện tích đường cong Tmax Thời điểm đạt nồng độ thuốc tối đa Cmax Nồng độ thuốc tối đa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất làm nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 18 Bảng 2.3 Chương trình pha động LC-MS/MS 25 Bảng 3.1 Điều kiện kiểm soát đa phản ứng phân tích ITZ OH-ITZ 28 Bảng 3.2 Kết khảo sát phương pháp chiết 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát nội chuẩn 30 Bảng 3.4 Kết khảo sát điều kiện kiềm hóa 30 Bảng 3.5 Kết khảo sát muối chiết 31 Bảng 3.6 Thông số dược động học ITZ OH-ITZ mơ hình thỏ 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo phân tử itraconazol Hình 1.2 Nồng độ felodipin để đạt thơng lượng tối đa có mặt Vit E TPGS 0,04% Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ diện tích pic ITZ phương pháp HPLC 27 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ dung dịch chuẩn ITZ với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn diện tích pic nội chuẩn phương pháp LC – MS/MS 33 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ dung dịch chuẩn OH-ITZ với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn diện tích pic nội chuẩn phương pháp LC – MS/MS 33 Hình 3.4 Kết thử khuếch tán ITZ HPTR thành phần ITZ nguyên liệu môi trường pH 1,2 35 Hình 3.5 Kết thử khuếch tán ITZ HPTR thành phần ITZ nguyên liệu môi trường pH 6,8 35 Hình 3.6 Kết thử hịa tan dược chất HPTR thành phần môi trường pH 1,2 36 Hình 3.7 Kết thử khuếch tán ITZ HPTR thành phần, thành phần ITZ nguyên liệu môi trường pH 1,2 37 Hình 3.8 Kết thử khuếch tán ITZ HPTR thành phần, thành phần ITZ nguyên liệu môi trường pH 6,8 38 Hình 3.9 Kết thử hịa tan dược chất từ HPTR thành phần môi trường pH 1,2 38 Hình 3.10 Kết thử khuếch tán ITZ HPTR thành phần ITZ-HPMC-HPMCP (1,5:3:1) mơi trường pH 1,2 có khơng có mặt natri lauryl sulfat nồng độ 0,5% 39 Hình 3.11 Kết thử khuếch tán HPTR thành phần F3, HPTR thành phần F4, mẫu trộn vật lý F3 với acid, ITZ nguyên liệu chế phẩm đối chiếu môi trường pH 1,2 40 Hình 3.12 Kết thử khuếch tán HPTR thành phần F3, HPTR thành phần F4, mẫu trộn vật lý F3 với acid, ITZ nguyên liệu chế phẩm đối chiếu môi trường pH 6,8 41 Hình 3.13 Kết thử hòa tan chuyển pH 42 Hình 3.14: Kết X-ray của: A (Itraconazol nguyên liệu); B (F4 sau tháng); C (F4 bào chế) 44 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ ITZ huyết tương thỏ theo thời gian chế phẩm đối chiếu mẫu trộn vật lý HPTR thành phần với acid 45 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ OH-ITZ huyết tương thỏ theo thời gian chế phẩm đối chiếu mẫu trộn vật lý HPTR thành phần với acid 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Itraconazol thuốc chống nấm phổ rộng nhóm triazol sử dụng để điều trị nhiều loại nấm xâm lấn nấm hội [34] Itraconazol có tính base yếu, độ tan nên khả hấp thu phụ thuộc nhiều vào pH đường tiêu hóa sinh khả dụng thay đổi lớn cá thể Do đó, nhóm nghiên cứu sử dụng hệ phân tán rắn để cải thiện đặc điểm itraconazol Trong hai nghiên cứu trước [3], [5], thành phần hệ phân tán rắn lựa chọn sau: hỗn hợp polyme HPMC E606 – HPMCP 55 (3:1) để đưa vào hệ phân tán rắn chứa itraconazol làm chất mang đồng thời lựa chọn hỗn hợp hai tá dược acid acid maleic – acid fumaric (2:1) để tăng khả hòa tan dược chất Tuy nhiên tồn số vấn đề chưa đánh giá khả khuếch tán, độ ổn định sinh khả dụng hệ phân tán rắn để thấy ưu điểm hệ Để tiếp tục hoàn thiện bào chế HPTR chứa itraconazol, nghiên cứu thực đề tài khóa luận mang tên: “Đánh giá ảnh hưởng hệ phân tán rắn đa cấu tử tới khả khuếch tán hấp thu itraconazol” với mục tiêu cụ thể sau: Đánh giá ảnh hưởng thành phần hệ phân tán rắn tới khả khuếch tán độ ổn định vật lý itraconazol Xây dựng thẩm định số tiêu phương pháp định lượng nồng độ itraconazol hydroxyitraconazol huyết tương thỏ kỹ thuật LCMS/MS, ứng dụng đánh giá sinh khả dụng chế phẩm chứa itraconazol PHỤ LỤC 6: Thông số thiết bị sắc ký khối phổ Thông số Nguồn ion Giá trị ESI Chế độ ion hóa Dương Chế độ ghi phổ MRM Khí nguồn GS1 (psi) 30 Khí nguồn GS2 (psi) 30 Nhiệt độ nguồn (độ C) 450 Thế ion hóa (ion spray voltage) (V) 5500 Khí màng (curtain gas) (psi) 25 Khí va chạm Q2 (psi) PHỤ LỤC 7: Hình ảnh sắc ký đồ phương pháp định lượng LC-MS/MS Hình phụ lục 7.1 Sắc ký đồ chất Hình phụ lục 7.2 Sắc ký đồ chất chuẩn ITZ pha acetonitril chuẩn OH-ITZ pha acetonitril Hình phụ lục 7.3 Sắc ký đồ chất chuẩn nội ketoconazol pha acetonitril PHỤ LỤC 8: Đánh giá điểm nhận dạng (IP) kỹ thuật phân tích khối phổ Bảng PL 8.1 Quan hệ kỹ thuật khối phổ số điểm IP đạt Kỹ thuật khối phổ Số điểm IP đạt với ion MS phân giải thấp (LR-MS) 1,0 LR-MS (ion mẹ) 1,0 LR-MS (ion con) 1,5 MS phân giải cao (HR-MS) 2,0 HR-MS (ion mẹ) 2,0 HR-MS (ion con) 2,5 Bảng PL 8.2 Số điểm IP đạt kỹ thuật khối phổ khác Kỹ thuật Số ion Số điểm IP GCMS (EI CI) n n GCMS (EI CI) (EI) + (CI) GCMS (EI CI) hai dẫn xuất (dc A) + (dc B) LC – MS n n GC – MS – MS ion mẹ, ion LC – MS – MS ion mẹ, ion GC – MS – MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC – MS – MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC – MS – MS - MS ion mẹ, ion ion cháu 5,5 HR-MS n 2n GC – MS LC – MS 2+2 GC – MS HR – MS 2+1 PHỤ LỤC 9: Sắc ký đồ thẩm định tính chọn lọc phương pháp phân tích LCMS/MS Hình phụ lục 9.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình phụ lục 9.2 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn ITZ acetonitil Hình phụ lục 9.3 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn ITZ huyết tương trắng Hình phụ lục 9.4 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn OH-ITZ acetonitril Hình phụ lục 9.5 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn OH-ITZ huyết tương trắng PHỤ LỤC 10: Sắc ký đồ chất chuẩn ITZ nồng độ LOD nồng độ LOQ phương pháp xác định nồng độ ITZ huyết tương thiết bị LC-MS/MS Hình phụ lục 10.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn ITZ nồng độ LOD 0,5 ng/ml Hình phụ lục 10.2 Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn ITZ nồng độ LOQ ng/ml PHỤ LỤC 11: Sắc ký đồ chất chuẩn OH-ITZ nồng độ LOD nồng độ LOQ phương pháp xác định nồng độ OH-ITZ huyết tương thiết bị LC-MS/MS Hình phụ lục 11.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn OH-ITZ nồng độ LOD 0,5 ng/ml Hình phụ lục 11.2 Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn OH-ITZ nồng độ LOQ ng/ml PHỤ LỤC 12: Thời gian lưu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính độ chệch phương pháp định lượng nồng độ ITZ OH-ITZ huyết tương hệ thống LC – MS/MS Bảng phụ lục 12.1 Thời gian lưu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính Nồng độ Chất chuẩn nội ketoconazol Thời gian Diện tích Thời gian Diện tích Thời gian Diện tích lưu pic lưu pic lưu pic 10 ng/ml 5,15 4,97 117000 4,67 418000 105000 50 ng/ml 5,15 341000 4,98 470000 4,67 436000 100 ng/ml 5,16 430000 4,97 656000 4,67 317000 250 ng/ml 5,15 1060000 4,97 1560000 4,67 317000 500 ng/ml 5,16 1530000 4,98 2340000 4,67 228000 Bảng phụ lục 12.2 Khoảng làm việc độ chệch phương pháp LC – MS/MS Nồng độ 10 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml 250 ng/ml 500 ng/ml Chất chuẩn ITZ Chất chuẩn OH-ITZ Chất chuẩn ITZ Nồng độ tính lại Độ chênh theo đường chuẩn (%) (ng/ml) 11,3 13 52,5 5,1 96,1 4,9 246,6 1.3 501,7 0,3 Chất chuẩn OH-ITZ Nồng độ tính lại Độ chênh theo đường chuẩn (%) (ng/ml) 11,4 14 52,0 100,8 0,8 241,3 3,5 504,5 0,9 PHỤ LỤC 13: Kết tính tốn độ lặp lại độ thu hồi, sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại phương pháp định lượng nồng độ ITZ OH-ITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Bảng phụ lục 13.1 Độ thu hồi lặp lại phương pháp với ITZ Mẫu Spk-10-1 Spk-10-2 Spk-10-3 Spk-10-4 Spk-10-5 Spk-10-6 Spk-250-1 Spk-250-2 Spk-250-3 Spk-250-4 Spk-250-5 Spk-250-6 Spk-500-1 Spk-500-2 Spk-500-3 Spk-500-4 Spk-500-5 Spk-500-6 Nồng độ lý thuyết (ng/ml) 10 10 10 10 10 10 250 250 250 250 250 250 500 500 500 500 500 500 Nồng độ tính lại (ng/ml) 12,9 11,5 9,13 10,2 9,58 11,1 270 286 274 270 274 260 480 490 487 489 495 480 Nồng độ Độ thu hồi trung bình (%) (ng/ml) 129% 115% 91,3% 10,735 102% 95,8% 111% 108% 114% 110% 272,3 108% 110% 104% 96% 98% 97,4% 486,83 97,8% 99% 96% SD RSD (%) 1,38 12,9 8,43 3,09 5,9 1,21 Bảng phụ lục 13.2 Độ thu hổi lặp lại phương pháp với OH-ITZ Mẫu Spk-10-1 Spk-10-2 Spk-10-3 Spk-10-4 Spk-10-5 Spk-10-6 Spk-250-1 Spk-250-2 Nồng độ lý thuyết (ng/ml) 10 10 10 10 10 10 250 250 Nồng độ tính lại (ng/ml) 9,91 8,99 9,46 9,57 9,32 9,89 276 254 Nồng độ Độ thu hồi trung bình (%) (ng/ml) 99,1 89,9 94,6 9,52 95,7 93,2 98,9 110,4 256,6 101,6 SD RSD (%) 0,35 3,6 11,5 4,5 Spk-250-3 Spk-250-4 Spk-250-5 Spk-250-6 Spk-500-1 Spk-500-2 Spk-500-3 Spk-500-4 Spk-500-5 Spk-500-6 250 250 250 250 500 500 500 500 500 500 245 263 256 246 496 480 490 486 497 512 98 105,2 102,4 98,4 99,2 96 98 97,2 99,4 102,4 Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn ITZ 10 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ ITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS 493,5 11,05 2,2 Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn OH-ITZ 10 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ OHITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn ITZ 250 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ ITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn OH-ITZ 250 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ OHITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn ITZ 500 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ ITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn OH-ITZ 500 ng/ml phương pháp định lượng nồng độ OHITZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS PHỤ LỤC 14: Độ lặp lại tối đa độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (AOAC) Bảng PL 14.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (AOAC) TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD % 100 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 µg/ml 5,3 0,001 10-5 10 µg/ml 7,3 0,0001 10-6 µg/ml 11 0,00001 10-7 100 ng/ml 15 0,000001 10-8 10 ng/ml 21 10 0,0000001 10-9 ng/ml 30 Bảng PL 14.2 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (AOAC) TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi % 100 100% 98 – 102 ≥ 10 10-1 10% 98 – 102 ≥1 10-2 1% 97 – 103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95 – 105 0,01 10-4 100 µg/ml 90 – 107 0,001 10-5 10 µg/ml 80 – 110 0,0001 10-6 µg/ml 80 – 110 0,00001 10-7 100 ng/ml 80 – 110 0,000001 10-8 10 ng/ml 60 – 115 10 0,0000001 10-9 ng/ml 40 – 120 PHỤ LỤC 15: Kết theo dõi độ ổn định nhiễu xạ tia X 3500 A 3000 Lin (Cps) 2500 2000 B 1500 C 1000 D 500 E 0 10 20 30 40 50 60 2-Theta (degree) Hình phụ lục 15.1 Kết X-ray của: A (Itraconazol nguyên liệu); B (F1 sau tháng); C (F1 sau tháng); D (F1 sau tháng); E (F1 bào chế) 3500 A 3000 Lin (Cps) 2500 2000 B 1500 C 1000 D 500 E 0 10 20 30 40 50 60 2-Theta (degree) Hình phụ lục 15.2 Kết X-ray của: A (Itraconazol nguyên liệu); B (F2 sau tháng); C (F2 sau tháng); D (F2 sau tháng); E (F2 bào chế) 2200 2000 A 1800 1600 B Lin (Cps) 1400 1200 C 1000 800 600 D 400 200 E 0 10 20 30 40 50 60 2-Theta (degree) Hình phụ lục 15.3 Kết X-ray của: A (Itraconazol nguyên liệu); B (F3 sau tháng); C (F3 sau tháng); D (F3 sau tháng); E (F3 bào chế) ... ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THẾ ANH MÃ SINH VIÊN: 1501027 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ PHÂN TÁN RẮN ĐA CẤU TỬ TỚI KHẢ NĂNG KHUẾCH TÁN VÀ SINH KHẢ DỤNG CỦA ITRACONAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... giá ảnh hưởng hệ phân tán rắn đa cấu tử tới khả khuếch tán hấp thu itraconazol? ?? với mục tiêu cụ thể sau: Đánh giá ảnh hưởng thành phần hệ phân tán rắn tới khả khuếch tán độ ổn định vật lý itraconazol. .. Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần hệ phân tán rắn tới khả khuếch tán độ ổn định vật lý hệ phân tán rắn chứa ITZ • Xây dựng phương pháp định lượng ITZ huyết tương ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng động