Xây dựng phương pháp định lượng l tetrahydropalmatin trong huyết tương chó ứng dụng trong đánh giá sinh khả dụng các chế phẩm thử tương quan in vitro – in vivo khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ QUANG LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG l-TETRAHYDROPALMATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CÁC CHẾ PHẨM THỬ TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ QUANG LINH MÃ SINH VIÊN: 1801412 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG l-TETRAHYDROPALMATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CÁC CHẾ PHẨM THỬ TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Trần Linh ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện: Khoa Bào Chế Công nghệ dược phẩm Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Trần Linh - giảng viên Khoa Bào Chế Công nghệ dược phẩm ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc – viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, người thầy, cô vượt qua khó khăn, ân cần quan tâm, tận tình hướng dẫn, bảo cho từ bước chập chững đường nghiên cứu khoa học suốt qng thời gian tơi thực khóa luận Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thạch Tùng, NCS Phạm Thị Phương Dung thầy cô Khoa Bào chế Công nghệ dược phẩm quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ, động viên cho tơi góp ý q báu q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, Ban lãnh đạo toàn thể anh chị công tác Tầng - Độc Học Dị Nguyên tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Viện thời gian qua để hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, muốn gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè, người bên tôi, động viên, ủng hộ học tập sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng năm 2023 Sinh viên Vũ Quang Linh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan l-tetrahydropalmatin 1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất lý hóa .2 1.1.3 Nguồn gốc 1.1.4 Các nghiên cứu đặc điểm sinh khả dụng l-tetrahydropalmatin 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Chỉ định tác dụng không mong muốn 1.1.7 Một số chế phẩm chứa l-tetrahydropalmatin thị trường .4 1.1.8 Nghiên cứu dạng bào chế giải phóng kéo dài chứa l-THP 1.2 Sắc ký lỏng khối phổ 1.2.1 Nguyên lý 1.2.2 Cấu tạo máy 1.3 Tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Vai trò tương quan in vitro – in vivo 10 1.3.3 Đánh giá sinh khả dụng in vivo 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu .17 2.1.1 Hóa chất, chất chuẩn 17 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng l-THP huyết tương chó LC-MS/MS .18 2.3.2 Thẩm định phần phương pháp định lượng l-THP huyết tương chó LC-MS/MS 19 2.4 Phương pháp bào chế 21 2.4.1 Bào chế chế phẩm xây dựng tương quan 22 2.4.2 Bào chế chế phẩm đối chiếu 23 2.5 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng .23 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu .23 2.5.2 Đối tượng thử 23 2.5.3 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu .23 2.5.4 Xử lý mẫu 24 2.6 Phương pháp phân tích dược động học 24 2.6.1 Tiêu chuẩn loại trừ .24 2.6.2 Phân tích dược động học không ngăn (NCA) .25 2.6.3 Xác định thông số dược động học 25 2.6.4 Phương pháp tính tốc độ mức độ hấp thu in vivo qua giải chập .27 2.6.5 Phương pháp tính tốn xử lý kết 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng 28 3.1.1 Tối ưu hóa lựa chọn điều kiện sắc ký 28 3.2 Kết thẩm định phần phương pháp phân tích 28 3.2.1 Tính chọn lọc .28 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống .30 3.2.3 Đường chuẩn định lượng l-THP phương pháp LC-MS 31 3.2.4 Giới hạn định lượng (LLOQ) 32 3.2.5 Độ lặp lại độ thu hồi .32 3.3 Kết đánh giá sinh khả dụng in vivo 33 3.3.1 Kết định lượng nồng độ l-THP mẫu huyết tương chó Error! Bookmark not defined 3.3.2 Các thông số dược động học thuốc .38 3.4 Kết giải chập hấp thu thuốc in vivo 42 3.4.1 Đánh giá mức độ hấp thu in vivo 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT l-THP l-Tetrahydropalmatin ACN Acetonitril AIC Tiêu chuẩn thông tin Akaike (the Akaike’s information criterion) APCI Ion hóa hóa học áp suất khí (Atmospheric Chemical Ionization) APPI Ion hóa photon áp suất khí (Atmospheric Pressure Photonization) AUC Diện tích đường cong nồng độ theo thời gian (Area under curve) AUC0-t Diện tích đường cong từ thời điểm đến thời điểm t AUC0-∞ Diện tích đường cong từ thời điểm đến thời điểm vô BSA Diện tích bề mặt thể (Body surface area) Cmax Nồng độ dược chất cực đại huyết tương DĐVN Dược điển Việt Nam ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization) GPKD Giải phóng kéo dài HED Liều tương đương người (Human equivalent dose) IS Nội chuẩn (Internal standard) IV Tĩnh mạch (Intravenous) IVIVC Tương quan in vivo – in vitro LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry) m/z Tỷ số khối lượng/điện tích (Mass to charge ratio) MRM Theo dõi đa phản ứng (Multi reaction monitoring) MRT Thời gian lưu trú trung bình (Mean residence time) NCA Phân tích dược động học không ngăn NOAELs Mức liều không xuất tác dụng không mong muốn (The no observed adverse effect levels) SKD Sinh khả dụng Tmax Thời điểm dược chất đạt nồng độ tối đa huyết tương (Time to peak drug concentration) US FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (United States Food and Drug Administration) Viên - FR Dạng bào chế có tốc độ hịa tan nhanh Viên - MR Dạng bào chế có tốc độ hịa tan trung bình Viên - SR Dạng bào chế có tốc độ hịa tan chậm DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hướng dẫn chuyển đổi liều người động vật [40] 13 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu làm nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Chương trình pha động 18 Bảng 2.3 Quan hệ kỹ thuật khối phổ số điểm IP đạt 20 Bảng 2.4 Ví dụ số điểm IP đạt kỹ thuật khối phổ khác 20 Bảng 2.5 Công thức chế phẩm xây dựng tương quan 22 Bảng 2.6 Công thức thuốc tiêm tĩnh mạch IV liều 30mg 23 Bảng 2.7 Thời điểm lấy mẫu máu 24 Bảng 3.1 Kết điều kiện tối ưu cho mảnh chất phân tích .28 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS .28 Bảng 3.3 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống LC-MS/MS 30 Bảng 3.4 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp LC-MS/MS (n=6) .32 Bảng 3.5 Nồng độ l-THP huyết tương (ng/mL) theo thời gian (h) sau tiêm tĩnh mạch liều 30mg .34 Bảng 3.6 Nồng độ l-THP huyết tương (ng/mL) theo thời gian (h) sau uống viên FR liều 30mg 36 Bảng 3.7 Nồng độ l-THP huyết tương (ng/mL) theo thời gian (h) sau uống viên MR liều 30mg 36 Bảng 3.8 Nồng độ l-THP huyết tương (ng/mL) theo thời gian (h) sau uống viên SR liều 30mg 37 Bảng 3.9 Dữ liệu đối chiếu tiêu chuẩn chấp nhận Ke chế phẩm đối chiếu thuốc tiêm tĩnh mạch .38 Bảng 3.10 Dữ liệu đối chiếu tiêu chuẩn chấp nhận Lambda_z chế phẩm tương quan viên FR 39 Bảng 3.11 Dữ liệu đối chiếu tiêu chuẩn chấp nhận Lambda_z chế phẩm tương quan viên MR 39 Bảng 3.12 Dữ liệu đối chiếu tiêu chuẩn chấp nhận Lambda_z chế phẩm tương quan viên SR 39 Bảng 3.13 Các thơng số dược động học tính tốn nhờ phần mềm Certara PhoenixTM 40 Bảng 3.14 Tính tốn giá trị AIC với trọng số khác 42 Bảng 3.15 Thơng số ước tính phương trình hồi quy khơng tuyến tính biểu diễn 42 HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo phân tử l-tetrahydropalmatin .2 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng khối phổ Hình 1.3 Đầu dị tứ cực (Triple quadrupole mass spectrometer) Hình 1.4 Các đối tượng thử nghiệm in vivo nghiên cứu IVIVC 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn huyết tương trắng 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn .30 Hình 3.4 Đường chuẩn l-THP huyết tương trắng LC-MS/MS 31 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn nồng độ l-THP huyết tương chó với chế phẩm đối chiếu IV theo thời gian 35 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn nồng độ l-THP huyết tương thỏ công thức bào chế theo thời gian 38 Hình 3.7 Đường cong hấp thu in vivo 43 ĐẶT VẤN ĐỀ l-Tetrahydropalmatin (l-THP) thường sử dụng điều trị ngủ, an thần, giảm đau hai dạng bào chế viên nén thuốc tiêm tĩnh mạch Tuy nhiên, l-THP có tác dụng ngắn, chuyển hóa nhanh, sinh khả dụng thấp [39] nên phải sử dụng nhiều lần để mang lại hiệu điều trị Theo hệ thống phân loại sinh dược học Biopharmaceutics Classification System), l-THP xếp vào nhóm II: Kém tan dễ thấm, dạng thuốc viên nén giải phóng kéo dài chứa dược chất l-THP giúp trì nồng độ thuốc máu định, tăng sinh khả dụng thuận tiện cho người sử dụng Tuy nhiên dạng thuốc giải phóng kéo dài chứa l-THP chưa xuất thị trường, với kiến thức tương quan in vitro – in vivo, việc nghiên cứu dạng bào chế có nhiều tiềm hướng phát triển phù hợp Tương quan in vitro – in vivo (in vitro - in vivo correlation - IVIVC) giúp dự đốn xác đặc tính sinh khả dụng in vivo dựa liệu giải phóng in vitro Trong việc xác định sinh khả dụng in vivo bước đầu quan trọng, xác định thông qua định lượng nồng độ thuốc mẫu dịch sinh học Trong động vật thử chó mơ hình tốt để đánh giá sinh khả dụng thuốc uống đường tiêu hóa chó gần giống với người Tuy nhiên, mẫu huyết tương chó thường thể tích mẫu nhỏ, mẫu phức tạp dẫn đến việc phải xây dựng phương pháp phân tích có độ đặc hiệu độ nhạy phù hợp Mặc dù vậy, chưa có cơng bố phương pháp định lượng l-THP huyết tương chó Việt Nam Những lý làm sở cho nhóm nghiên cứu thực đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng l-Tetrahydropalmatin huyết tương chó ứng dụng đánh giá sinh khả dụng chế phẩm thử tương quan In Vitro – In Vivo.” với mục tiêu sau: Xây dựng ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng l-THP huyết tương chó Đánh giá sinh khả dụng chế phẩm giải phóng kéo dài chứa l-THP CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan l-tetrahydropalmatin 1.1.1 Cơng thức cấu tạo Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử l-tetrahydropalmatin - Công thức phân tử: C21H25NO4; khối lượng phân tử: 355,4 g/mol - Tên khoa học: 5, 8, 13, 13a-tetrahydro-2, 3, 9, 10-tetramethoxy-6H-dibenzo [a, g] quinolizin [2] - Tên khác: rotundin, gindarin, caseanin, hyndarin 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.2.1 Tính chất vật lý - Cảm quan: tinh thể màu trắng hay vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng tiếp xúc với ánh sáng nhiệt [2] - Độ tan: tan tốt cloroform, tan ethanol ether, không tan nước, dễ tan acid sulfuric lỗng [2] - Nhiệt độ nóng chảy: 141-144°C [2] - Log P = 3,09 – 3,2 - pKa = 5,34 [45] 1.1.2.2 Tính chất hóa học - Tính base yếu: l-tetrahydropalmatin chứa N bậc phân tử, dễ dàng tạo muối với acid vô [6] - Tính chất hóa học alkaloid: l-tetrahydropalmatin tạo phản ứng với thuốc thử alkaloid thuốc thử Dragendorff, acid picric…[2] 1.1.3 Nguồn gốc - l-Tetrahydropalmatin hoạt chất chiết xuất từ củ số dược liệu thuộc họ Stephania spp Coridalis spp đưa vào dược điển Trung Quốc từ năm 1977 với tác dụng giảm đau, an thần Cây Bình vơi (Stephania rotunda) tìm thấy nhiều khu vực Đông Nam Châu Á (Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Campuchia) [17] - Trong tự nhiên, l-tetrahydropalmatin tồn đồng thời dạng đồng phân đối quang d l l-Tetrahydropalmatin chứng minh có tác dụng mạnh so với đồng phân d đối kháng receptor dopamin, từ có tác dụng dược lý an thần, giảm đau, giãn trơn mạnh so với đồng phân d Hệ số hồi quy hiệu chỉnh  0.80 AUC ngoại suy  20 Span  2.0 half-lives Viên SR Số điểm xác định  sau Tmax 1.00 0.99 0.98 0.99 1.00 1.76 2.28 4.94 8.37 4.53 2.68 3.22 3.97 2.63 3.60 3 4 Đối với chế phẩm đối chiếu dung dịch thuốc tiêm IV; chế phẩm xây dựng tương quan Viên-FR, Viên-MR, có đầy đủ thơng số liệu thời điểm cuối đồ thị nồng độ dược chất huyết tương sử dụng để tính tốn xác định pha thải trừ cuối Đối với chế phẩm xây dựng tương quan Viên – SR, đối tượng thử M7 khơng có liệu nồng độ thời điểm từ 12-48h dẫn tới không phản ánh pha thải trừ thuốc, loại khỏi mẫu đánh giá (phụ lục 9-12) 3.3.2.2 Các thông số dược động học - Từ kết định lượng nồng độ l-THP huyết tương chó bảng mục 3.3.1.2, sử dụng công cụ NCA phần mềm Certara PhoenixTM, thông số dược động học sử dụng dạng bào chế chó tính tốn trình bảng 3.13: Bảng 3.14 Các thơng số dược động học tính tốn nhờ phần mềm Certara PhoenixTM Dung dịch tiêm (n=6) Viên-FR Viên-MR Viên-SR (n=6) (n=6) (n=6) λz (h-1) 0,0584 ± 0,0102 0,0890 ± 0,0186 0,0813 ± 0,0153 0,1119 ± 0,0257 T1/2 12,25 ± 2,70 8,08 ± 1,63 8,77 ± 1,60 6,45 ± 1,41 Cmax(ng/mL) 557,67 435,45 221,54 1565 ± 331,08 ± 235,51 ± 133,69 ± 171,20 Tmax (h) 3,33 ± 1,63 3,13 ± 1,90 5,00 ± 3,32 0,1389 ± 0,0861 AUC0-48h (ng/mL.h) 4993,48 ± 3268,08 5192,10 ± 3756,31 3099,37 ± 2156,71 4431,86 ± 1410,91 AUC0-∞ (ng/mL.h) 5345,55 ± 3526,00 5340,05 ± 3973,25 3233,98 ± 2250,52 4912,51 ± 1906,00 Thông số 40 7,35 7,55 16,73 6,88 ± 3,31 ± 3,50 ± 17,04 ± 2,06 Vz/F (L) 134,16 ± 84,75 82,09 ± 30,56 227,24 ± 272,62 63,20 ± 20,82 MRT (h) 14,64 ± 1,85 11,73 ± 2,71 14,65 ± 1,5 7,48 ± 2,51 CL/F (L/h) - Từ hình 3.7 bảng 3.14 thấy thời gian đạt nồng độ đỉnh dạng bào chế Viên-FR Viên-MR xuất vòng khoảng giờ, Viên-SR có Tmax khoảng Viên-FR có thời gian bán thải dài (12,25 giờ) giảm dần Viên-SR, Viên-MR chế phẩm tiêm (lần lượt 8,77; 8,08 6,45 giờ) Theo đề tài “Nghiên cứu tương quan in vivo-in vitro l-tetrahydropalmatin” dược sĩ Bùi Quang Đơng [4], q trình dược động học l-THP, chế phẩm giải phóng diễn thỏ có Tmax dao động từ đến 10 phút T1/2 từ 0,67 đến Có thể thấy, Tmax T1/2 chế phẩm Viên-FR, Viên-MR, Viên-SR dài so với chế phẩm giải phóng Ngồi ra, cấu trúc đường tiêu hóa đặc điểm chuyển hóa l-THP chó thỏ khác nhau, ảnh hưởng tới đặc điểm dược động học thuốc, dẫn đến kết có khác biệt Ngoài ra, Tmax T1/2 thu từ phân tích nghiên cứu dài so sánh với nghiên cứu Hong cộng (2005) (Tmax 1,5 thời gian bán thải T1/2 6,77 giờ) [21], qua bước đầu thấy bào chế nén giải phóng kéo dài chứa l-THP làm tăng thời gian thuốc lưu huyết tương - Thời gian lưu trú trung bình MRT sau tiêm tĩnh mạch 7,48 ngắn so với chế phẩm Viên-FR, MR, SR, 14,64 giờ; 11,73 giờ; 14,65 Do phân tử thuốc dạng tiêm tĩnh mạch xảy động học chuyển vận pha phân bố mà khơng có q trình hịa tan hay hấp thu, chế phẩm giải phóng kéo dài có thời gian lưu trú thuốc dịch tiêu hóa thời gian lưu trú thuốc khơng gian phân bố [7] - AUC0-48h Viên-FR Viên-MR (4993,48 ng/ml.h 5192,10 ng/ml.h tương ứng) gần tương đương với giá trị AUC0-24h chế phẩm đối chiếu dạng dung dịch tiêm (4431,86 ng/ml.h) cho thấy chế phẩm xây dựng tương quan có sinh khả dụng cao Nguyên nhân l-THP có tính thấm tốt, nhiên nhược điểm dược chất độ tan nước bị chuyển hóa bước nhiều gan [23] Như việc bào chế dạng viên giải phóng kéo dài khắc phục nhược điểm cải thiện sinh khả dụng thuốc Trong AUC0-48h Viên-SR thấp khoảng 1,5 lần so với dạng bào chế lại (3099,37 ng/ml.h), bị ảnh hưởng 41 tỷ lệ loại polymer viên làm chậm trình giải phóng dược chất, khiến viên khơng kịp giải phóng toàn lượng thuốc trước qua vùng hấp thu tối ưu - Để tiến hành phép giải chập trình xây dựng đường cong hấp thu hịa tan in vivo, tiến hành mơ hình hóa liệu dược động học chế phẩm đối chiếu tổng hàm số mũ 3.4 Kết giải chập hấp thu thuốc in vivo - Với tập liệu giải phóng, mơ hình có giá trị AIC nhỏ xem mơ hình phù hợp Tiêu chuẩn AIC công cụ chuẩn đánh giá tính phù hợp mơ hình đưa vào nhiều phần mềm thống kê AIC tính theo công thức: 𝑛 𝐴𝐼𝐶 = 𝑊𝑆𝑆𝑅 + 2𝑝 = 𝑛 𝑙𝑛 ∑ [𝑤𝑗 (𝑦𝑗 − 𝑦 𝑗 ) ] + 2𝑝 𝑗 - Với n số điểm liệu, p số tham số mơ hình, yj liệu thứ j, ŷj liệu dự đốn mơ hình ứng với yj, wj trọng số điểm liệu thứ j - Nồng độ huyết tương chó sử dụng dung dịch tiêm mơ hình hóa với phương trình hồi quy khơng tuyến tính có dạng 𝑛 𝑦=∑ 𝐴𝑖 𝑒^ − 𝑎𝑖 𝑖=1 với trọng số khác Tiến hành xử lý liệu với trọng số khác phần mềm Certara PhoenixTM, trọng số cho giá trị AIC thấp lựa chọn Bảng 3.15 Tính tốn giá trị AIC với trọng số khác Trọng số AIC Uniform weighting 143.9006 1/y 130.81938 1/ŷ 65.68235 116.40677 -5.19874 1/(y ) 1/(ŷ ) Từ bảng 3.14, nhận thấy dung dịch tiêm tĩnh mạch đơn liều, mơ hình với trọng số 1/(ŷ2) cho kết AIC bé lựa chọn để mơ hình hóa phương trình Kết giá trị Ai αi trình bày bảng 3.15: Bảng 3.16 Thơng số ước tính phương trình hồi quy khơng tuyến tính biểu diễn nồng độ l-THP huyết tương thỏ dạng thuốc đối chiếu Thơng số ước tính Đơn vị Thuốc tiêm tĩnh mạch A1 ng/ml 41.315117 42 α1 - 0.81574177 A2 ng/ml 7.700991 α2 - 0.064518254 A3 ng/ml - α3 - - R2 - AIC - -5.19874 Với phương trình mơ hình hóa nồng độ l-THP huyết tương sau sử dụng thuốc tiêm, phương trình thể rõ hai pha rõ rệt gồm pha phân bố pha thải trừ Hệ số α1 (0,8157) gấp khoảng 13 lần hệ số α2 (0,0645) cho thấy pha phân bố diễn mạnh, chiếm ưu thời gian đầu sau diễn pha thải trừ chung 3.4.1 Đánh giá mức độ hấp thu in vivo Sau có đường cong nồng độ l-THP huyết tương chó hàm số biểu diễn dược động học chế phẩm đối chiếu, tiến hành phép giải chập để thu đường cong hấp thu in vivo Tiến hành giải chập với dung dịch tiêm làm chế phẩm đối chiếu theo phương pháp mô tả phần 2.6.4, đường cong hấp thu in vivo chế phẩm bào chế xây dựng tương quan Viên-FR, Viên-MR Viên-SR thể hình 3.8: Hình 3.7 Đường cong hấp thu in vivo Qua mơ hình hấp thu in vivo, l-THP từ chế phẩm hấp thu từ từ vào tuần hồn chung vịng 10 đầu Viên-MR hấp thu với tốc độ mức độ cao 43 đạt khoảng lần với liều đưa vào sau 48h l-THP từ dạng bào chế Viên-FR ViênSR hấp thu hơn, khoảng 0,75 0,5 lần sau 48h so với liều sử dụng Tỷ lệ hấp thu chế phẩm giải phóng kéo dài thử nghiệm chó cao so sánh với tỷ lệ chế phẩm giải phóng ngay, thử nghiệm thỏ nghiên cứu trước dược sĩ Bùi Quang Đông (tỷ lệ hấp thu từ 0.01 đến 0.04 lần sau 24 so với liều sử dụng) Qua đó, nhận xét cách định tính tỷ lệ hấp thu l-THP dạng giải phóng kéo dài cải thiện Kết đánh giá sinh khả dụng in vivo đề tài tiếp tục sử dụng để xây dựng tương quan in vitro – in vivo nghiên cứu sau 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Đề tài thực mục tiêu đề ra: - Thẩm tra ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng l-THP huyết tương chó - Đánh giá sinh khả dụng chế phẩm giải phóng kéo dài chứa l-THP Với kết thu sau: Đã xây dựng phương pháp phân tích định lượng l-THP huyết tương chó phương pháp với thông số: Chuẩn nội: Berberin Điều kiện khối phổ: Khối phổ lần MS/MS; nguồn ion hóa ESI(+)  Cột sắc ký: C18 (150 mm x mm × 3,5 μm) tiền cột C18 Waters  Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng  Pha động: ACN: dung dịch acid formic 0,1%  Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút  Thể tích tiêm mẫu: µl  Nhiệt độ Autosampler (buồng tiêm mẫu): nhiệt độ phòng  Thời gian phân tích: 10 phút/ mẫu + Chọn ion mẹ hai mảnh ion tương ứng cho chất phân tích Phương pháp thẩm tra đạt tiêu: độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại độ thu hồi, mối quan hệ tuyến tính tỉ lệ diện tích pic chất phân tích nội chuẩn nồng độ chất phân tích khoảng 2-200ng/ml Đánh giá sinh khả dụng viên nén GPKD chứa l-THP: - Dạng viên nén GPKD có Tmax, T1/2 thời gian lưu trung bình dài so với chế phẩm đối chiếu dung dịch thuốc tiêm tĩnh mạch - AUC0-∞ (ng/mL.h) chế phẩm viên FR Viên MR gần tương đương với chế phẩm thuốc tiêm tĩnh mạch (theo kiểm định Paired – Sample t-Test, với giá trị P_value cặp 0,28 0,39 (>0,05)) ĐỀ XUẤT Do thời gian nghiên cứu có hạn, đồng thời gặp khó khăn mặt máy móc trang thiết bị dẫn tới số tiêu chưa thực kế hoạch Để đề tài hồn thiện hơn, nhóm nghiên cứu xin đưa số đề xuất: - Thẩm tra phương pháp định lượng xây dựng với tiêu: độ ổn định lTHP huyết tương động vật thí nghiệm - Đánh giá độ hịa tan in vitro chế phẩm thiết lập tương quan in vitro in vivo 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Văn Bạch (2016), "Tối ưu hóa công thức bào chế viên nén Rotundin sulfat giải phóng kéo dài ", Tạp chí Y-Dược học qn sự, tr 61-67 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2015), "Hướng dẫn chẩn đoán xử trí ngộ độc", tr 17-19 Bùi Quang Đơng (2018), Nghiên cứu tương quan in vitro-in vivo ltetrahydropalmatin, Trường Đại học Dược Hà Nội 10 11 Phạm Thị Minh Huệ (2019),Nghiên cứu số giải pháp nhằm cải thiện sinh khả dụng tác dụng dược lý cho thuốc từ dược liệu áp dụng với silymarin ltetrahydropalmati, Trường Đại học Dược Hà Nội Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Bộ Y tế Nguyễn Trần Linh (2005), Mơ hình hóa so sánh đồ thị giải phóng dược chất từ dạng bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Trần Linh (2005), Phương pháp phân tích dược động học khơng dựa mơ hình ngăn, Trường đại học Dược Hà Nội Phạm Luật (2014), Phương pháp phân tích sắc ký chiết tách, Nhà xuất bách khoa Hà Nội Nguyễn Như Nam (2021), Ứng dụng tương quan in vitro - in vivo bào chế pellet l-tetrahydropalmatin giải phóng kéo dài, Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Cao Sơn, Thẩm định phương pháp phân tích hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 1-84 Tài liệu Tiếng Anh 12 Chavda Vivek, Shah Dhaval, et al (2016), "In Vitro–In Vivo Correlation (IVIVC): A Strategic Tool in Drug Product Development", Research & Reviews: A Journal of Drug Formulation, Development and Production, 3, pp 24 13 Arndt Marcel, Chokshi Hitesh, et al (2013), "Dissolution media simulating the 14 15 proximal canine gastrointestinal tract in the fasted state", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 84(3), pp 633-641 Binhashim Nada, Alvi Syed, et al (2021), "LC-MS/MS Method for Determination of Colistin in Human Plasma: Validation and Stability Studies", International Journal of Analytical Mass Spectrometry and Chromatography, 9, pp 1-11 Chao-Wu Li, Shuo Zhang, et al (2011), "Determination of Ltetrahydropalmatine in human plasma by HPLC and pharmacokinetics of its disintegrating tablets in healthy Chinese", European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 36, pp 257-62 16 De Thaye E., Vervaeck A., et al "Pharmacokinetic analysis of modified-release metoprolol formulations: (Electronic)) 17 18 An interspecies comparison", (1879-0720 Desgrouas C., Taudon N., et al (2014), "Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Stephania rotunda Lour", J Ethnopharmacol, 154(3), pp 53763 Dobson Clair L., Hinchcliffe Mike, et al (1998), "Is the Pig a Good Animal Model for Studying the Human Ileal Brake?", Journal of Pharmaceutical 19 Sciences, 87(5), pp 565-568 Gaynor C., Dunne A Fau - Davis John, et al "A comparison of the prediction accuracy of two IVIVC modelling techniques", (1520-6017 (Electronic)) 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Harvey David J (2018), "Mass Spectrometry: Overview ☆", Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering, pp 337-344 Hong Z Y., Fan Gr Fau - Chai Y F., et al "Chiral liquid chromatography resolution and stereoselective pharmacokinetic study of tetrahydropalmatine enantiomers in dogs", (1570-0232 (Print)) Horowitz Rivka S., Feldhaus Kim, et al (1996), "The Clinical Spectrum of Jin Bu Huan Toxicity", Archives of Internal Medicine, 156(8), pp 899-903 Hou J., He X Fau - Xu Xuefang, et al "Application of an in vitro DDASS to evaluate oral absorption of two chemicals simultaneously: establishment of a level A in vitro-in vivo correlation", (1520-5762 (Electronic)) ICH (2019), "ICH guideline M10 on bioanalytical method validation" International Conference on Harmonisation (2005), 'Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH harmonised tripartite guideline, pp 113 Ishibashi T., Hatano H Fau - Kobayashi M., et al "In vivo drug release behavior in dogs from a new colon-targeted delivery system", (0168-3659 (Print)) J Pitt J (2009), "Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry", Clin Biochem Rev, pp 19-34 Jiang Wei-Ning, Jing Xiao, et al (2020), "Corydaline and l-tetrahydropalmatine attenuate morphine-induced conditioned place preference and the changes in dopamine D2 and GluA1 AMPA receptor expression in rats", European Journal of Pharmacology, 884, pp 173-397 Kang B K., Lee Js Fau - Chon Se Kang, et al "Development of selfmicroemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) for oral bioavailability enhancement of simvastatin in beagle dogs", (0378-5173 (Print)) 30 Lui Cy Fau - Amidon G L., Amidon Gl Fau - Berardi R R., et al "Comparison of gastrointestinal pH in dogs and humans: implications on the use of the beagle dog as a model for oral absorption in humans", (0022-3549 (Print)) 31 Margolskee A., Darwich A S., et al "Deconvolution and IVIVC: Exploring the Role of Rate-Limiting Conditions", (1550-7416 (Electronic)) 32 McInnes Fiona, Clear Nicola, et al (2008), "In Vivo Performance of an Oral MR Matrix Tablet Formulation in the Beagle Dog in the Fed and Fasted State: Assessment of Mechanical Weakness", Pharmaceutical Research, 25(5), pp 33 34 35 36 37 1075-1084 McMaster Marvin C (2005), "LC/MS: A Practical User's Guide", John Wiley & Sons, Inc, pp 103-105 Medhe Sharad (2018), "Mass Spectrometry: Analysers an Important Tool", International Journal of Chemical Sciences, 16, pp 1-8 Ofori-Asenso Richard (2015), "Understanding Cross Over and Parallel group studies in Drug Research", Precision Medicine, 2015, pp 1046 Park E S., Chang Sj Fau - Rhee Y S., et al "Effects of adhesives and permeation enhancers on the skin permeation of captopril", (0363-9045 (Print)) Proost J H (1987), Critical evaluation of the determination of bioavailability by 39 numerical deconvolution, pp 1746-1751 Tran S C., Duc N D., et al "Pharmacokinetic analysis of levotetrahydropalmatine in rabbit plasma by rapid sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry", (1873-376X (Electronic)) Tung Nguyen-Thach, Tran Son, et al (2017), "Development of solidified self- 40 microemulsifying drug delivery systems containing L-tetrahydropalmatine: Design of experiment approach and bioavailability comparison", International Journal of Pharmaceutics, pp 537 U.S Department of Health and Human Services Food and Drug Administration 38 41 42 Center for Drug Evaluation and Research (CDER) (2005), "Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" U.S Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) (2002), "Food-Effect Bioavailability and Fed Bioequivalence Studies" U.S Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) (1997), "Extended Release Oral Dosage Forms: Development, Evaluation, and Application of In Vitro/In Vivo Correlations" 43 Veng-Pedersen P "Noncompartmentally-based pharmacokinetic modeling", 44 (0169-409X (Print)) Wang J B., Mantsch J R "l-tetrahydropalamatine: a potential new medication 45 for the treatment of cocaine addiction", (1756-8927 (Electronic)) National Center for Biotechnology Information (2021), "PubChem Compound Summary for CID 5417, Rotundine", https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Rotundine Retrieved, from PHỤ LỤC Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát thông số hệ thống LC – MS/MS (Sắc ký đồ chất chuẩn l-THP nội chuẩn Berberin) Phụ lục Thời gian lưu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính Chất chuẩn l-THP Nồng độ (ng/ml) Nội chuẩn Berberin Thời gian lưu (phút) Diện tích pic lTHP Thời gian lưu (phút) Diện tích pic Berberin 5,16 330000 5,34 7910000 5,16 537000 5,33 7770000 20 5,16 1490000 5,34 6950000 50 5,16 3870000 5,33 7760000 100 5,17 7730000 5,34 7600000 200 5,16 15000000 5,33 7640000 Phụ lục Khoảng làm việc độ chệch phương pháp LC – MS/MS Nồng độ l-THP lý thuyết (ng/ml) Nồng độ l-THP tìm lại theo đường chuẩn (ng/ml) Độ chệch (%) 2,07 4,89 2,2 20 19,9 0,7 50 48,9 2,2 100 102 200 199 0,3 Phụ lục Độ thu hồi độ lặp lại phương pháp định lượng huyết tương chó LC-MS/MS Nồng độ Nồng độ Mẫu lý thuyết (ng/ml) tính lại (ng/ml) Độ thu Nồng độ trung hồi (R%) bình (ng/ml) Spk2-1 1,74 86,9 Spk2-2 1,64 82,2 Spk2-3 1,70 85,2 Spk2-4 1,73 86,3 Spk2-5 1,72 86 Spk2-6 1,73 86,3 Spk20-1 20 17,4 86,8 Spk20-2 20 16,8 84,0 Spk20-3 20 17,9 89,3 Spk20-4 20 16,9 84,5 Spk20-5 20 17,5 87,7 Spk20-6 20 17,1 85,5 Spk100-1 100 91,1 91,1 Spk100-2 100 90,4 90,4 Spk100-3 100 90,9 90,9 Spk100-4 100 94 94 Spk100-5 100 95,5 95,5 Spk100-6 100 94 94 RSD SD % 1,71 0,04 2,16 17,27 0,41 2,39 92,65 2,11 2,28 Phụ lục Độ tái lặp phương pháp định lượng huyết tương chó LC-MS/MS Mẫu Spk2-1 Spk2-2 Spk2-3 Spk2-4 Spk2-5 Spk2-6 Nồng độ lý thuyết (ng/ml) 2 2 2 Nồng độ tính lại (ng/ml) 1,64 1,92 1,66 1,72 1,77 1,69 Độ thu hồi (R%) Nồng độ trung bình (ng/ml) SD RSD % 82,1 96,1 83,2 86,0 88,4 84,5 1,73 0,10 5,9% Phụ lục Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn l-THP ng/ml phương pháp định lượng nồng độ EMZ huyết tương thiết bị LC – MS/MS Phụ lục Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD % 100 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1 % 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21 10 0,0000001 10-9 ppb 30 Phụ lục Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Hàm lượng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%] 100 100% 98-102 >=10 10-1 10% 98-102 >=1 10-2 1% 97-103 >=0,1 10-3 0,1 % 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 TT Phụ lục Thời điểm lựa chọn để tính tốn Lamda_z cho chế phẩm thuốc tiêm tĩnh mạch Thời điểm M1 - - M2 - M3 M5 0.083 0.17 0.25 0.5 0.75 12 24 - - - - - - - Y Y Y Y - - - - - - - Y Y Y Y Y - - - - - - - - - - Y Y Y - - - - - - - - - - Y Y Y M6 - - - - - - - Y Y E Y Y Y M7 - - - - - - Y Y Y E Y Y E Phụ lục 10 Thời điểm lựa chọn để tính tốn Lamda_z cho chế phẩm Viên-FR Thời điểm 0.25 0.5 0.75 12 24 36 48 M1 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M2 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M3 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M5 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M8 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M9 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y Phụ lục 11 Thời điểm lựa chọn để tính tốn Lamda_z cho chế phẩm Viên-MR Thời điểm 0.25 0.5 0.75 12 24 36 48 M1 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M2 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M3 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M5 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M6 - - - - - - - - Y Y Y Y Y M7 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y Phụ lục 12 Thời điểm lựa chọn để tính tốn Lamda_z cho chế phẩm Viên-SR Thời điểm 0.25 0.5 0.75 M1 - - - - - - - - - - Y Y Y M2 - - - - - - - - - - Y Y Y M3 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M5 - - - - - - - Y Y Y Y E E M6 - - - - - - - Y Y Y Y Y Y M7 - - - - - - - - - - - - - 12 24 36 48