VŨ THỊ HỒNG NGỌC xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROPYLEN GLYCOL TRONG THỨC ăn CHO mèo KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROPYLEN GLYCOL TRONG THỨC ĂN CHO MÈO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG NGỌC MÃ SINH VIÊN: 1701423 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROPYLEN GLYCOL TRONG THỨC ĂN CHO MÈO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS ThS Vũ Ngân Bình ThS Bùi Cao Tiến Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực hoàn thành hướng dẫn dạy nhiệt tình anh chị Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia thầy cô Trường đại học Dược Hà Nội Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Cao Tiến trực tiếp hướng dẫn dạy cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn NCS ThS Vũ Ngân Bình định hướng góp ý cho em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô mơn Hóa phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo đặc biệt chị khoa Độc học – Dị nguyên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt quãng thời gian nghiên cứu đê thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên em sẻ chia khó khăn, động viên giúp đỡ em học tập sống Trong thời gian thực đề tài, nỗ lực cố gắng không tránh khỏi thiếu sót, em kính mong nhận ý kiến góp ý q thầy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, 22 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Vũ Thị Hồng Ngọc i MỤC LỤC ĐẶT VẤT ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Propylen glycol 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Định danh tính chất lý hóa 1.1.3 Độc tính 1.2 Tổng quan phương pháp xác định PG 1.2.1 Một số phương pháp xác định PG giới 1.2.2 Tổng quan etylen glycol 1.2.3 Phương pháp LC-MS/MS 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Lựa chọn chất chuẩn nội 15 2.2.2 Khảo sát điều kiện xác định PG LC – MS/MS 15 2.2.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 15 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 16 2.2.5 Thẩm định phương pháp 16 2.2.6 Ứng dụng phương pháp 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 16 2.3.2 Phương pháp thẩm định quy trình phân tích [2, 6] 18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Lựa chọn chất chuẩn nội 24 ii 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ LC – MS/MS 24 3.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 24 3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 26 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28 3.3.1 Khảo sát quy trình chiết mẫu 28 3.3.2 Khảo sát quy trình dẫn xuất 32 3.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 36 3.5 Thẩm định phương pháp 36 3.5.1 Tính tương thích hệ thống 36 3.5.2 Độ chọn lọc phương pháp 37 3.5.3 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ 38 3.5.4 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 38 3.5.5 Độ chụm độ 39 3.6 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng PG thức ăn cho mèo 41 3.7 Bàn luận 43 KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 48 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Communities The ASPCA Animal poison Hiệp hội cộng đồng phân tích Trung thức tâm kiểm sốt độc động vật control center Mỹ APCI Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa hóa học áp suất CAD ionization Collision gas khí Áp suất khí va chạm CE Collision energy Năng lượng va chạm CNS Central nervous system Hệ thần kinh trung ương CUR Curtain gas Áp suất khí màng CXP Collision cell exit potential Thế khỏi va chạm EC European Communities Cộng đồng châu Âu EG Ethylene glycol Etylen glycol EP Entrance potential Thế cổng vào ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử Food and drug administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ FIA The flow injection analysis Kỹ thuật phân tích dịng chảy GC-FID Gas chromatography – Flame Sắc ký khí với đầu dị ion hóa ionization detector Gas chromatography- Mass spectrometry Ion source gas lửa Sắc ký khí ghép khối phổ High performance liquid chromatography High performance liquid – Refraction index Sắc ký lỏng hiệu cao APCC FDA GC-MS GS HPLC HPLC-RI HPLC-UV HRGC-FID Áp suất khí nguồn Sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò số khúc xạ Sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dị quang phổ tử ngoại Sắc ký khí độ phân giải cao với đầu dị ion hóa lửa High performance liquid – Ultraviolet High resolution gas chromatography – Flame ionization detector iv Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt HRGC-MS Sắc ký khí độ phân giải cao ghép khối phổ IS High resolution gas chromatography – Mass spectrometry Ionspray Voltage LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần Thế ion hóa mass spectrometry LD50 Lethal dose, 50% Liều gây chết 50% LOAEL Lowest-observed-adverse-effect Mức liều/nồng độ tối đa gây tác level dụng bất lợi không xác định LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Metanol MRM Multiple reaction monitoring Chế độ theo dõi đa phản ứng MS Mass spectrometry Khối phổ NOAEL No-observed-advered-effect level Mức liều/nồng độ tối thiểu gây tác dụng bất lợi xác định NP-HPLC Normal-phase high performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao pha thuận PG Propylene glycol Propylen glycol PRSDR Reproducibility predicted relative standard deviation Repeatability predicted relative Độ lệch chuẩn tương đối tái lập ước tính Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại standard deviation ước tính Q Quadrupole Bộ tứ cực RP-HPLC Reversed-phase high performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S/N Signal-to-noise ratio Tỷ số tín hiệu cực đại nhiễu SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn PRSDr Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN TEM Nhiệt độ nguồn ion Temperature Tài liệu tham khảo TLTK v DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1 Định danh hóa học PG Bảng 1-2 Tính chất lý hóa PG Bảng 1-3 Một số tác động PG qua đường miệng mèo Bảng 1-4 Một số phương pháp dùng xác định PG Bảng 1-5 Ưu nhược điểm số phương pháp sử dụng để định lượng PG: Bảng 1-6 Một số tác nhân dẫn xuất PG Bảng 1-7 Một số chất chuẩn nội dùng phương pháp định lượng PG Bảng 1-8 Bảng định danh hóa học EG Bảng 1-9 Tính chất lý hóa EG Bảng 2-1 Danh mục hóa chất thuốc thử 14 Bảng 2-2 Quan hệ kỹ thuật phân tích số điểm IP đạt 18 Bảng 2-3 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 18 Bảng 2-4 Tỷ lệ ion kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 19 Bảng 2-5 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác 22 Bảng 3-1 Các điều kiện phân tích PG, EG ESI (+) - MS/MS 25 Bảng 3-2 Các thông số tối ưu thiết bị MS/MS 25 Bảng 3-3 Chương trình gradient pha động 27 Bảng 3-4 Kết tính tương thích hệ thống 36 Bảng 3-5 Giá trị LOD, LOQ 38 Bảng 3-6 Đường chuẩn PG 39 Bảng 3-7 Kết độ lặp độ thu hồi PG pate đóng hộp 39 Bảng 3-8 Độ tái lặp nội PG pate đóng hộp 40 Bảng 3-9 Bảng kết phân tích mẫu pate đóng hộp 41 vi DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1-1 Phương trình phản ứng Glycols với benzoyl clorid [35] Hình 1-2 Mơ hình hệ thống LC-MS/MS 11 Hình 2-1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 17 Hình 3-1 Sắc ký đồ mẫu thêm không thêm EG 24 Hình 3-2 Phổ khối PG EG 25 Hình 3-3 Sắc ký đồ hệ pha động (1) 26 Hình 3-4 Sắc ký đồ hệ pha động (2) 27 Hình 3-5 Biểu đồ khảo sát nhiệt độ chiết rắn – lỏng 28 Hình 3-6 Biểu đồ khảo sát thời gian chiết rắn - lỏng 29 Hình 3-7 Biểu đồ khảo sát số lần chiết rắn - lỏng 30 Hình 3-8 Sơ đồ quy trình sau khảo sát trình xử lý mẫu 31 Hình 3-9 Biểu đồ kháo sát thể tích NaOH 40% 32 Hình 3-10 Biểu đồ khảo sát lượng benzoyl clorid 33 Hình 3-11 Biểu đồ khảo sát thời gian dẫn xuất 34 Hình 3-12 Biểu đồ khảo sát thời gian chiết lỏng- lỏng 34 Hình 3-13 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu lựa chọn 35 Hình 3-14 Đồ thị đường chuẩn dung môi mẫu thực 36 Hình 3-15 Sắc ký đồ PG mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn mẫu chuẩn 37 Hình 3-16 Sắc ký đồ giá trị LOQ 38 Hình 3-17 Đường chuẩn 39 Hình 3-18 Sắc ký đồ số mẫu pate đóng hộp cho mèo 42 vii ĐẶT VẤT ĐỀ Propylen glycol (PG) sử dụng phổ biến chất “an tồn” với vai trị chất chống đơng, chất giữ ẩm, dung mơi hịa tan, chất bảo quản… mỹ phẩm, dược phẩm, công nghiệp Ngưỡng độc PG người hầu hết loài động vật cao nên PG sử dụng làm chất phụ gia chế biến thực phẩm sử dụng cho người động vật (ở người ngưỡng khuyến cáo thực phẩm 25 mg/kg/ngày, giới hạn phơi nhiễm cho phép hàng ngày với chó 50 mg/kg/ngày chuột 40 – 80 mg/kg/ngày… [4]) Riêng với loài mèo, PG sử dụng thức ăn với nồng độ lớn 10% Nhiều nghiên cứu PG việc sử dụng nhiều, tích lũy lâu dài đem lại tác hại cho sức khỏe vật nuôi nên cần kiểm soát nồng độ chất này, đặc biệt với sản phẩm cho mèo [10] Hiện Mỹ chất khơng cịn sử dụng thức ăn cho mèo chúng đặc biệt nhạy cảm với tác dụng bất lợi PG [10, 32] Việc sử dụng PG mèo tiềm ẩn nhiều nguy cơ, nhiên thực tế Việt Nam cho thấy việc kiểm soát nồng độ PG sản phẩm cho mèo chưa quan tâm Hiện phương pháp sử dụng chủ yếu định lượng nồng độ PG sắc ký khí – ion hóa lửa (GC – FID) sắc ký khí – khối phổ (GC – MS) Tuy nhiên PG bị hấp thụ vào phận thủy tinh hệ thống GC [34], cần có phương pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát nồng độ PG thức ăn cho mèo Xuất phát từ nhu cầu đặc tính ưu việt kỹ thuật LC-MS/MS phân tích, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài: “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Propylen glycol thức ăn cho mèo” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng PG thức ăn cho mèo LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng PG số mẫu thức ăn cho mèo thị trường PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát điều kiện MS/MS Phụ lục Sắc ký đồ ion PG1, EG1, PG2, EG2 PG1 EG1 EG2 PG2 48 Phụ lục Kết khảo sát nhiệt độ chiết rắn – lỏng Phụ lục Kết khảo sát thời gian chiết rắn – lỏng 49 Phụ lục Kết khảo sát số lần chiết rắn – lỏng 50 Phụ lục Kết khảo sát lượng NaOH 40% Phụ lục Kết khảo sát lượng benzoyl clorid 51 Phụ lục Kết khảo sát thời gian dẫn xuất 52 Phụ lục Kết khảo sát thời gian chiết lỏng – lỏng 53 Phụ lục 10 Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu - Sắc ký đồ đường chuẩn dung môi - Sắc ký đồ đường chuẩn mẫu thực: 54 Phụ lục 11 Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống Phụ lục 12 Kết tỷ lệ tín hiệu ion định tính chia cho định lượng 55 Phụ lục 13 Sắc ký đồ đường chuẩn Phụ lục 14 Sắc ký đồ độ lặp lại độ thu hồi 56 57 Phụ lục 15 Sắc ký đồ độ tái lập nội 58 Phụ lục 16 Sắc ký đồ mẫu thực tế Quận Hai Bà Trưng 59 Quận Hoàn Kiếm 60 Quận Hoàng Mai 61 Quận Bắc Từ Liêm 62 ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG NGỌC MÃ SINH VIÊN: 1701423 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROPYLEN GLYCOL TRONG THỨC ĂN CHO MÈO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS ThS Vũ. .. ? ?Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Propylen glycol thức ăn cho mèo? ?? với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng PG thức ăn cho mèo LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để xác định. .. đạt giới hạn cho phép, điều cho thấy phương pháp có độ đúng, độ chụm đáp ứng yêu cầu AOAC 40 3.6 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng PG thức ăn cho mèo Trên sở phương pháp xây dựng, chúng tối