NGUYỄN BÌNH MINH xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MĂNG cụt KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH MINH Mã sinh viên: 1701372 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MĂNG CỤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Thuận ThS Trần Thị Thu Hiền Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa dược – Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành, hỗ trợ em suốt thời gian làm nghiên cứu Bộ mơn Hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Thuận – giảng viên Bộ mơn Hóa dược, trường Đại học Dược Hà Nội, người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện tối đa suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Đồng thời em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Trần Thị Thu Hiền – Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam thầy cô, cán kỹ thuật viên mơn Hóa dược quan tâm, hỗ trợ giúp đỡ em suốt thời gian làm nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, thầy cô giảng dạy giúp em trau dồi kiến thức kỹ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè động viên, cổ vũ em Đặc biệt, anh Dương Tiến Anh, chị Trần Thị Huyền Trang, chị Đinh Thị Lý, bạn Bùi Văn Sơn, bạn Phạm Thị Thu Trang, em Lã Hải Long em Phạm Thúy Hà giúp đỡ, hỗ trợ em hoàn thành khóa luận Trong q trình thực hồn thành khóa luận, việc thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em mong nhận lời góp ý dẫn thầy để khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Bình Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan măng cụt vỏ măng cụt 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan chất nghiên cứu 1.2.1 Tổng quan nhóm polyphenol 1.2.2 Cấu trúc khung xanthon 1.2.3 Tính chất lý hóa α-mangostin γ-mangostin 1.3 Tác dụng dược lý măng cụt hợp chất xanthon 1.3.1 Theo y học cổ truyền 1.3.2 Theo y học đại .7 1.4 Các phương pháp phân tích bột dược liệu măng cụt hoạt chất mangostin 1.4.1 Phương pháp định tính bột dược liệu măng cụt .8 1.4.2 Phương pháp định lượng hoạt chất mangostin CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị .12 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời α-mangostin γmangostin cao vỏ măng cụt bằng HPLC .12 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng .13 2.3.3 Ứng dụng định lượng mẫu cao chiết xuất phục vụ xác định điều kiện chiết xuất tối ưu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử .13 2.4.2 2.4.3 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 14 Thẩm định phương pháp phân tích 14 2.4.4 Ứng dụng .17 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời α-mangostin γ-mangostin cao vỏ măng cụt bằng HPLC 18 3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát 18 3.1.2 Khảo sát chương trình pha động 18 3.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột .21 3.1.4 Điều kiện sắc ký lựa chọn 22 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC 22 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 22 3.2.2 Độ chọn lọc, đặc hiệu phương pháp 23 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn .24 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 25 3.2.5 Độ 26 3.2.6 Độ chính xác (độ lặp lại độ chính xác trung gian) .27 3.3 Ứng dụng 29 3.4 Bàn luận 32 3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng 32 3.4.2 3.4.3 Về phương pháp phân tích thẩm định phương pháp phân tích 33 Về mẫu định lượng 34 3.4.4 Về cao chiết cao chuẩn .34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 4.1 Kết luận .35 4.2 Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ ACN Acetonitril AcOH Acid acetic AMG α-mangostin AOAC C18 Octadecylsilane DAD Diod Array Detector EtOH Ethanol GMG γ-mangostin HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao 10 LOD Limit Of Detection Giới hạn phát 11 LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng 12 MeOH Methanol 13 N Number of the theory plates Số đĩa lý thuyết 14 Rf Retention Factor Hệ số lưu giữ 15 RP-HPLC Reverse Phase High Performance Sắc ký lỏng hiệu Liquid Chromatography cao pha đảo 16 RS Resolution Độ phân giải 17 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 18 S/N Signal/Noise 19 Tf Tailing factor Hệ số kéo đuôi 20 tR Retention time Thời gian lưu 21 UV Ultraviolet Visible Tiếng Việt Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa Chemists học phân tích chính thức Detector mảng diod Tín hiệu/nhiễu đường Quang phổ tử ngoại khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AMG giới Bảng 2.1 Dãy dung dịch chuẩn cần chuẩn bị 15 Bảng 2.2 Danh mục mẫu thử định lượng .17 Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động lựa chọn 20 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 22 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ tuyến tính .24 Bảng 3.4 Kết xác định LOD, LOQ phương pháp 25 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ GMG 26 Bảng 3.6 Kết thẩm định độ AMG 26 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại độ chính xác trung gian ngày phân tích khác GMG AMG .27 Bảng 3.8 Kết độ chính xác trung gian khác người phân tích GMG AMG 28 Bảng 3.9 Kết khảo sát dung môi chiêt xuất 29 Bảng 3.10 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 30 Bảng 3.11 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 30 Bảng 3.12 Kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi 31 Bảng 3.13 Các thông số pic sắc ký khảo sát nhiệt độ cột 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh măng cụt Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất xanthon vỏ măng cụt Hình 1.3 Sơ đồ phân loại nhóm polyphenol .4 Hình 1.4 Cấu trúc khung xanthon Hình 1.5 Cấu trúc hóa học AMG Hình 1.6 Cấu trúc hóa học GMG Hình 3.1 Phổ hấp thụ GMG (a) AMG (b) 18 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát theo pha động (a) pha động (b) 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát theo pha động (a) pha động (b) 19 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khảo sát theo pha động xuất tạp 20 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy chương trình gradient ở nhiệt độ phòng .20 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch tiêm tự động theo gradient .21 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát mẫu chuẩn chạy chương trình gradient ở hai nhiệt độ: nhiệt độ phòng (a) 35 ℃ (b) 21 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy chương trình gradient ở nhiệt độ 35 ℃ .21 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch .23 Hình 3.10 Kết chồng phổ UV AMG (a) GMG (b) 23 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ GMG (a) AMG (b) .24 Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ GMG 25 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ AMG 25 Hình 3.14 Biểu đồ kết khảo sát dung môi chiết xuất 29 Hình 3.15 Biểu đồ kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 30 Hình 3.16 Biểu đồ kết khảo sát thời gian chiết xuất .31 Hình 3.17 Biểu đồ kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Măng cụt (tên khoa học Garcinia mangostana L [3]) loại nhiệt đới trồng phổ biến ở Đông Nam Á Việt Nam, Malaysia, Indonesia… Không biết đến loại trái thơm ngon, bổ dưỡng mà măng cụt còn ứng dụng nhiều lĩnh vực y khoa, đặc biệt vỏ Từ xa xưa, vỏ sử dụng loại thuốc cổ truyền để điều trị đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, vết thương nhiễm khuẩn loét mãn tính [10] Thành phần vỏ đa dạng, gồm nhiều nhóm chất có hoạt tính xanthon, flavonoid, triterpenoid, tanin… [5] Trong thành phần xanthon thành phần chính coi hoạt chất quý Chất thuộc vào nhóm chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật gọi polyphenol Trong số hợp chất xanthon tìm thấy từ vỏ măng cụt, hoạt chất αmangostin γ-mangostin nghiên cứu nhiều quan tâm nhiều Với khung xanthon, α-mangostin có tác dụng chống oxy hóa mạnh mà còn có tác dụng kháng nấm, kháng dị ứng, kích thích hệ thống miễn dịch ức chế tế bào ung thư [25] Có thể nói, hợp chất tiềm thu hút nhiều quan tâm nhà nghiên cứu Hiện nay, có nhiều nghiên cứu báo tập trung đến chiết xuất polyphenol, song phương pháp định lượng hai thành phần cao vỏ măng cụt chưa trọng nghiên cứu sâu Xuất phát từ thực tế đó, khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol cao măng cụt” thực với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời γ-mangostin α- - mangostin cao măng cụt Ứng dụng định lượng mẫu cao chiết xuất phục vụ xác định điều kiện chiết xuất tối ưu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan măng cụt vỏ măng cụt 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố - Tên khoa học: Garcinia mangostana L - Họ: Bứa - Clusiaceae (Guttiferae) Hình 1.1 Hình ảnh măng cụt - Tên khác: Sơn trúc tử (Trung Quốc), Mangosteen, Brindonia tallow tree, Kokambutter tree (Anh), Mangoustan cultivé, Mangoustanier, Garcinic mangoustan (Pháp), Mangkhut (Thái Lan) [3, 6] - Phân bố, nguồn gốc: Garcinia L chi lớn gồm phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, trừ châu Mỹ Ở Việt Nam, chi có 25 lồi, gỗ lớn Măng cụt có nguồn gốc từ Đơng Nam Á Người ta cho rằng măng cụt nguồn gốc ở đảo ở Malaysia, Indonesia sau nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam Hiện trồng rộng rãi ở Nam Bộ Tây Ninh, Thủ Dầu Một Cây còn trồng ở Philippin, Ấn Độ, Sri Lanka, Mianmar, vùng Trung Mỹ Australia Ở Việt Nam, măng cụt trồng ở miền Nam, đặc biệt tỉnh miền Tây miền Đông Nam Bộ Cây ưa khí hậu nhiệt đới điển hình Ở ngưỡng 20 ℃ 38 ℃, sinh trưởng kém Cây trồng ở tỉnh miền Tây cho từ 2002000 Tùy theo giống măng cụt mà cho số lượng sản lượng khác [3, 6] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây to, cao tới 20-25m, có tán hình tháp Thân phân cành thấp mọc ngang, vỏ màu đen, có chất nhựa mủ màu vàng Lá mọc đối, phiến dày, hình thuẫn hình bầu dục, dài 12-20 cm, rộng 5-7 cm, gốc tròn, đầu thuôn nhọn, mặt màu lục sẫm, khơng có kèm, cuống dày Lá non màu tía Hoa đực hoa lưỡng tính, mọc đơn từng đôi, gốc Cụm hoa đực có 39 hoa, dài, tràng dày, có thùy, mặt màu vàng đỏ, mặt màu đỏ lục nhạt, nhị ngắn, đài 4, cánh hoa 4, nhị nhiều (16-17 nhị), bầu 5-8 ô Hoa lưỡng tính có cuống có đốt Quả hình cầu, có đài tồn dày cứng, vỏ dày xốp, màu đỏ nâu tím Hạt 5-8, có áo màu trắng, vị thơm [6] 1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái Vỏ lấy ở già chín, dùng tươi hay phơi khô [6] Thu hoạch vỏ tốt vỏ chuyển sang màu đỏ nâu tím Quả giữ nhiều 5-7 ngày điều kiện bình thường Ở 9-12 ℃, bảo quản tháng [6] Cây măng cụt cho trái ít năm, cần 12 năm hơn, tùy thuộc vào khí hậu phương pháp canh tác Sản lượng măng cụt thay đổi, tùy thuộc vào khí hậu độ tuổi Nếu non mang lần đầu tiên, tạo 200-300 quả, khi trưởng thành, trung bình 500 mùa Ở độ tuổi 30 đến 45 trưởng thành hồn tồn, 3.000 quả, với có tuổi thọ 100 năm cho [7] 1.1.4 Thành phần hóa học Măng cụt thực vật giàu xanthon phát Trong số 200 dẫn xuất xanthon phát ở thực vật có đến 60 dẫn xuất tìm thấy lồi măng cụt, nhiều chất mangostin tập trung chủ yếu ở phần vỏ [5] Vỏ chứa khoảng 40 xanthon Thành phần chính vỏ α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin, isomangostin, trioxyxanthon, pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydroxy methyl butenyl xanthon, pyrano xanthenon, garcinon A, B, C, D , E, mangostinon, garcimangoson A, B, C, gartanin, egonol, epicatechin, procyanidin [4] Ngoài ra, vỏ còn chứa tới 7-13 % tanin, chất nhựa [3] Một số công thức cấu tạo hoạt chất xanthon vỏ măng cụt [27] α – mangostin β – mangostin Gartanin γ – mangostin Garcinon A Sắc ký đồ chuẩn C2 PL-6 Sắc ký đồ chuẩn C3 PL-7 Sắc ký đồ chuẩn C4 PL-8 Sắc ký đồ chuẩn C5 PL-9 Sắc ký đồ chuẩn C6 PL-10 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU THÊM CHUẨN, MẪU THỬ Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ thấp PL-11 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ trung bình PL-12 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn nồng độ cao PL-13 Sắc ký đồ mẫu thử PL-14 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU ĐỊNH LƯỢNG Mẫu thử DM1 (EtOH 50%) - Mẫu thử DM2 (ETOH 70%) - PL-15 Mẫu thử DM3 (EtOH 90%) - Mẫu thử N1 (nhiệt độ phòng) - PL-16 Mẫu thử N2 (40 ℃) - Mẫu thử N3 (60 ℃) - Mẫu thử N4 (80 ℃) PL-17 Mẫu thử TG1 (30 phút) - Mẫu thử TG2 (1h) - Mẫu thử TG3 (2h) PL-18 Mẫu thử TL1 (1/5) - Mẫu thử TL2 (1/10) - Mẫu thử TL3 (1/15) PL-19 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH MINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TRONG CAO MĂNG CỤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... xuất polyphenol, song phương pháp định lượng hai thành phần cao vỏ măng cụt chưa trọng nghiên cứu sâu Xuất phát từ thực tế đó, khóa luận ? ?Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol cao măng. .. rộng phương pháp để định lượng hai thành phần γ-mangostin α-mangostin dược liệu Trên sở đó, phát triển tối ưu hóa để đưa phương pháp vào làm phương pháp định lượng chuyên luận Măng cụt Dược. .. .7 1.4 Các phương pháp phân tích bột dược liệu măng cụt hoạt chất mangostin 1.4.1 Phương pháp định tính bột dược liệu măng cụt .8 1.4.2 Phương pháp định lượng hoạt chất mangostin