Nguyễn thị huyền xây dựng phương pháp định lượng ɣ oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ɣ-ORYZANOL TRONG VIÊN LÀM TRẮNG DA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN MÃ SINH VIÊN: 1801316 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ɣ-ORYZANOL TRONG VIÊN LÀM TRẮNG DA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Thanh Thủy ThS Cao Công Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm quốc gia HÀ NỘI-2023 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới người thầy hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận này: TS Đỗ Thị Thanh Thủy - giảng viên mơn Hóa dược- Khoa Cơng nghệ Hóa học- Trường Đại học Dược Hà Nội, tận tình dẫn, theo dõi đưa lời khun bổ ích giúp tơi giải vấn đề gặp phải trình nghiên cứu hoàn thành đề tài cách tốt ThS Cao Công Khánh công tác khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, người giúp đỡ nhiều trình tìm kiếm thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô mơn Hóa Dược- khoa Cơng nghệ Hóa học - Trường Đại học Dược Hà Nội; ThS Mạc Thị Thanh Hoa, chị Vũ Thị Thanh An, anh Nguyễn Duy Linh tập thể cán bộ, nhân viên khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu tồn thể phịng ban, khoa, mơn, thầy cô giáo kỹ thuật viên Trường Đại học Dược Hà Nội dạy bảo tạo hội cho tơi học tập, rèn luyện, tích lũy kiến thức, kỹ suốt trình năm học tập trường Cuối xin dành biết ơn sâu sắc tới bố mẹ tôi, tất người thân gia đình bạn bè ln bên u thương, ủng hộ để tơi có thêm nghị lực hồn thành tốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thông tin chung ɣ- oryzanol 1.1.1 Nguồn gốc cấu trúc 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.2 Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol có Việt Nam giới 1.2.1 Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol có Việt Nam 1.2.2 Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol có giới 1.3 Thông tin mẫu chứa ɣ- oryzanol 1.3.1 Một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol có thị trường nước ngồi nước 1.3.2 Thông tin sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân dùng nghiên cứu 10 1.4 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 1.4.1 Nguyên tắc 11 1.4.2 Phân loại 11 1.4.3 Các đại lượng đặc trưng 12 1.4.4 Ứng dụng 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Thiết bị, hóa chất, dung mơi 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát điều kiện phù hợp để xây dựng phương pháp định lượng ɣoryzanol 15 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da sắc ký lỏng hiệu cao 15 2.2.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol 15 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol 16 2.3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da Kiều Xuân 18 2.4 Xử lý số liệu 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Thực nghiệm kết 20 3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol 20 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol 28 3.1.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân 36 3.2 Bàn luận 38 3.2.1 Về phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da HPLC 38 3.2.2 Về thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da HPLC 39 3.2.3 Về ứng dụng phương pháp xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da Kiều xuân 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ACN Acetonitril AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) Hiệp hội nhà hóa phân tích thống CH3COOH Acid acetic DHEA Dehydroepiandrosterone EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol GC-MS (Gas chromatography–mass Sắc ký khí khối phổ spectrometry) H2 Hydrogen H2 O Nước HPLC (High performance chromatography) ICH (International Harmonization) IPA liquid Conference Sắc ký lỏng hiệu cao on Hội nghị quốc tế hài hịa hóa thủ tục đăng ký dược phẩm Isopropanol LC-MS (Liquid chromatography–mass Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry) LD50 (Lethal dose 50) Liều gây chết trung bình MeCl2 Diclometan MeOH Methanol MTBE Methyl tert- butyl ete NXB Nhà xuất PA (Pure analysis) Tinh khiết phân tích PA (Purity angle) Độ tinh khiết góc PDA (Photodiode array) Đầu dò mảng đi-ốt Rs (Resolution) Độ phân giải RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối TH (Purity threshold) Độ tinh khiết ngưỡng tR (Rentention time) Thời gian lưu TT Thứ tự UV (Ultraviolet) Tử ngoại VIS (Visible) Ánh sáng nhìn thấy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol Bảng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định ɣ- oryzanol Việt Nam Bảng Phương pháp đo quang để định lượng ɣ- oryzanol giới Bảng Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định ɣ- oryzanol có giới .6 Bảng Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol Bảng Một số phương pháp xác định ɣ- oryzanol sắc ký khí khối phổ Bảng Thơng tin số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol có thị trường 10 Bảng Các thành phần viên làm trắng da Kiều Xuân .11 Bảng Kết khảo sát tỷ lệ dung môi pha động 22 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết mẫu 23 Bảng 3 Thông số pic sắc ký khảo sát dung môi chiết 26 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết mẫu 27 Bảng Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký diện tích pic, thời gian lưu độ phân giải 28 Bảng Số liệu số đĩa lý thuyết hệ số bất đối theo pic sắc ký .29 Bảng Thời gian lưu pic sắc ký mẫu thử, mẫu chuẩn 31 Bảng Độ tinh khiết pic sắc ký mẫu thử mẫu chuẩn 32 Bảng Cách pha chế dung dịch thẩm định độ tuyến tính 33 Bảng 10 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 33 Bảng 11 Kết thẩm định độ lặp lại 34 Bảng 12 Kết thẩm định độ xác trung gian .35 Bảng 13 Kết thẩm định độ 36 Bảng 14 Kết định lượng ɣ-oryzanol mẫu viên Kiều Xuân 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1 Cấu trúc hóa học số chất ɣ-oryzanol .2 Hình Sắc ký đồ phân tích ɣ- oryzanol HPLC tài liệu tham khảo [5] Hình Hình ảnh số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol thị trường Hình Hình ảnh sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân 11 Hình Kết quét phổ dung dịch chuẩn .20 Hình Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 50: 50 21 Hình 3 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 35: 65 21 Hình Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 70: 30 21 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu isopropanol .24 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu n-hexan-ethanol= 5:2 24 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu methanol 24 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu ethanol 25 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết mẫu n-hexan .25 Hình 10 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu n-hexan- isopropanol = 1: 25 Hình 11 Sắc ký đồ mẫu trắng 30 Hình 12 Sắc ký đồ mẫu placebo .30 Hình 13 Sắc ký đồ mẫu thử 30 Hình 14 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 31 Hình 15 Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết pic mẫu thử 32 Hình 16 Đồ thị kiểm tra độ tinh khiết pic mẫu chuẩn .32 Hình 17 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ diện tích pic ɣ-oryzanol .34 Hình 18 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 37 Hình 19 Sắc ký đồ mẫu thử đại diện 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xã hội ngày phát triển, nhu cầu làm đẹp mà tăng lên Khái niệm “làm đẹp” mở rộng nhiều khía cạnh, khơng chăm sóc “sắc đẹp bên ngồi” mà cịn vấn đề sức khỏe bên để bổ trợ cho việc làm đẹp “Nhất dáng, nhì da” câu cửa miệng nhiều phụ nữ, cho thấy tầm quan trọng da với nhan sắc phái đẹp Một da đẹp không tạo nên ngoại hình ưa nhìn, mà cịn mang đến tự tin cho thân Các nước Châu Á đặc biệt Việt Nam, đa số cô gái muốn sở hữu cho da trắng sáng, mịn màng Chính vậy, ngày có nhiều phương pháp làm trắng da đời: sử dụng dược liệu thiên nhiên, dùng mỹ phẩm, dược- mỹ phẩm, hay áp dụng máy móc cơng nghệ cao Trong đó, sản phẩm dược- mỹ phẩm có xu hướng phát triển mạnh ưa chuộng Việt Nam Hiện nay, thị trường dược- mỹ phẩm nước phong phú hấp dẫn với nhãn hàng uy tín, có thương hiệu, đến từ quốc gia tiếng Việt Nam Bên cạnh thành phần bật collagen, vitamin E, glutathion, vitamin C… ɣ-oryzanol thành phần quan trọng công thức sản phẩm dượcmỹ phẩm ưa thích với khả chống oxy hóa mạnh, đem lại hiệu ngạc nhiên Tuy nhiên, lợi dụng vào nhu cầu làm đẹp người, nhiều hàng giả, hàng nhái, hàng chất lượng bán thị trường mang lại nhiều hệ lụy cho sức khỏe đời sống người sử dụng Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng sản phẩm vấn đề cần thiết để đảm bảo an toàn cho người dùng Xuất phát từ vấn đề thực tiễn nêu trên, thực đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da sắc ký lỏng hiệu cao” Đề tài thực với mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da sắc ký lỏng hiệu cao - Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da sắc ký lỏng hiệu cao - Ứng dụng phương pháp vào định lượng ɣ-oryzanol viên làm trắng da CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thông tin chung ɣ- oryzanol 1.1.1 Nguồn gốc cấu trúc ɣ-oryzanol thành phần tìm thấy với số lượng nhiều dầu cám gạo, hàm lượng ɣ- oryzanol có dầu cám gạo khoảng từ % đến % hay 10-20 mg/g Ngoài ra, hoạt chất tìm thấy ngơ, lúa mạch, loại dầu thực vật, lúa mạch đen cám lúa mì ɣ-oryzanol xác định hỗn hợp phytosteryl ferulat, acid ferulic este hóa với sterol (campesterol, sitosterol, stigmasterol) triterpenoid (cycloartenol 24-methylenecycloartenol) Ít 10 phytosteryl ferulat γoryzanol tìm thấy, chẳng hạn campesteryl, campestanyl, cycloartenyl, 24methylenecycloartanyl, sitostanyl, sitosteryl, stigmasteryl, Δ-campestenyl, Δ-sitostenyl Δ-stigmastenyl ferulat Trong số này, chiếm ưu campesteryl, cycloartenyl, 24methylenecycloartanyl sitosteryl ferulat chiếm từ 80% đến 95% γ-oryzanol tùy vào giống lúa [10], [17], [24] 1.1.a) Cycloartenyl ferulat 1.1.b) 24- Methylenecycloartenyl ferulat 1.1.c) Sitosteryl ferulat 1.1.d) Campesteryl ferulat Hình 1 Cấu trúc hóa học số chất ɣ-oryzanol 1.1.2 Tính chất hóa lý - Bột kết tinh khơng vị, màu trắng vàng, khơng có mùi [26] - Nhiệt độ nóng chảy từ 137,5–138,5 °C [26] - Khơng tan nước, tan diethyl ether, ethanol n-heptan, tan cloroform aceton [26] - Bị thủy phân môi trường kiềm 80 oC tạo muối acid ferulic [31] Phụ lục 2.2 Độ đặc hiệu- Mẫu placebo Phụ lục 2.3 Độ đặc hiệu- Mẫu thử Phụ lục 2.4 Độ đặc hiệu -Mẫu chuẩn Phụ lục Phụ lục 3.1 Độ tuyến tính- Dung dịch chuẩn 50% Phụ lục 3.2 Độ tuyến tính- Dung dịch chuẩn 75% Phụ lục 3.3 Độ tuyến tính- Dung dịch chuẩn 100% Phụ lục 3.4 Độ tuyến tính- Dung dịch chuẩn 125% Phụ lục 3.5 Độ tuyến tính- Dung dịch chuẩn 150% Phụ lục 4- Độ lặp lại Phụ lục 5- Độ xác trung gian Phụ lục Phụ lục 6.1 Độ 60% Phụ lục 6.2 Độ 100% Phụ lục 6.3 Độ 140% Phụ lục Định lượng γ-oryzanol viên làm trắng da Kiều Xuân- Mẫu chuẩn Phụ lục Định lượng γ-oryzanol viên làm trắng da Kiều Xuân- Mẫu thử