PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Áp dụng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và Rg3 trên các mẫu Tam thất chế biến.. Chuyển hóa trong quá trình chế biến Theo các nghiên cứu của Lau, Aik-Jiang và cộng sự: n

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Lê Thị Kim Vân

2 TS Lê Đình Chi

Nơi thực hiện:

1 Viện Dược liệu

2 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Kim Vân –

Khoa Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu làm nghiên cứu tới khi hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Đình Chi– GV Bộ môn Hóa phân tích –

Độc chất đã quan tâm, đóng góp ý kiến và hỗ trợ em trong suốt quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Lê Sơn, DS Nguyễn Thị Lê cùng các

anh chị và các bạn trong Khoa Bào chế - Chế biến – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu tại khoa

Em cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể quý thầy

cô trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập tại trường

Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè

và những người thân đã luôn luôn âm thầm theo dõi, động viên, chia sẻ, khuyến khích

em trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội

Sinh viên

Phạm Thị Thảo Nguyên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Tam thất 2

1.1.1 Tên khoa học, bộ phận dùng và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Công dụng 3

1.1.4 Tam thất chế biến 4

1.2 Tổng quan về chất nghiên cứu 7

1.2.1 Tổng quan về ginsenoside Rb1 7

1.2.2 Tổng quan về ginsenoside Rg3 8

1.3 Phương pháp định lượng ginsenoside Rb1 và Rg3 11

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 11

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 16

2.2.1 Chất chuẩn 16

2.2.2 Hóa chất 16

2.2.3 Thiết bị 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và ginsenoside Rg3 bằng HPLC 17

2.3.2 Thẩm định phương pháp 17

2.3.3 Áp dụng phương pháp trên một số mẫu Tam thất chế biến 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 17

2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

2.4.3 Quy trình xử lý mẫu 18

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích 18

2.4.5 Áp dụng trên một số mẫu Tam thất chế biến 21

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sắc ký 22

3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh 22

3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện 22

3.1.3 Khảo sát chương trình pha động 23

3.1.4 Điều kiện sắc ký lựa chọn 25

3.2 Nghiên cứu quy trình chuẩn bị mẫu 26

3.2.1 Lựa chọn phương pháp và dung môi chiết mẫu 26

3.2.2 Khảo sát thể tích dung môi chiết 26

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết 27

3.2.4 Quy trình chuẩn bị mẫu lựa chọn 28

3.3 Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC 28

3.3.1 Độ thích hợp hệ thống 28

3.3.2 Độ chọn lọc của phương pháp 28

3.3.3 Đường chuẩn và độ tuyến tính 29

3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 31

3.3.5 Độ lặp lại 33

3.3.6 Độ đúng 34

3.4 Áp dụng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và Rg3 trên các mẫu Tam thất chế biến 35

3.5 Bàn luận 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-

bay

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatoghraphy Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc 1 số saponin dẫn chất của protopanaxadiol, protopanaxatriol và phân

bố trong cây 3

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu ngoài nước về định lượng ginsenoside Rb1, Rg3 12

Bảng 1.3: Chương trình gradient dung môi trong chuyên luận Tam thất – DĐVN V 14

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 16

Bảng 3.1: Các chương trình khảo sát thành phần pha động 23

Bảng 3.2: Chương trình gradient dung môi chính thức 25

Bảng 3.3 Các thông số đánh giá đổi với Rb1 và Rg3 26

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp 28

Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất 30

Bảng 3.6 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp 31

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 33

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 34

Bảng 3.9 Kết quả hàm lượng Rb1 và Rg3 trên các mẫu Tam thất chế biến 35

Bảng 5.1 Chương trình gradient đã xây dựng 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa các saponin trong Tam thất hấp 5

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa các saponin trong Tam thất hấp 5

Hình 1.4 Biểu đồ hàm lượng Saponin trong rễ Tam thất hấp 6

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenoside Rb1 7

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của 20(S) – ginsenoside Rg3 8

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV – Vis của ginsenoside Rb1 22

Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV – Vis của ginsenoside Rg3 22

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 1 24

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 2 24

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử và chuẩn chương trình gradient 3 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chương trình gradient lựa chọn 26

Hình 3.7: Biểu đồ kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết 27

Hình 3.8: Biểu đồ kết quả khảo sát thời gian chiết 27

Hình 3.9 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 29

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ginsenoside Rb1 30

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ginsenoside Rg3 31

Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOQ của Rb1 (S/N = 12,55) 32

Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOQ của Rg3 (S/N = 9,74) 32

Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định LOD của Rb1 (S/N = 3,40) 32

Hình 3.15 Sắc ký đồ xác định LOD của Rg3 (S/N = 3,03) 32

Hình 3.16: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rb1 trong các mẫu thử 35

Hình 3.17: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rg3 trong các mẫu thử 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa, Tam thất (Panax notoginseng) đã được coi là một vị thuốc quý với

các tác dụng hành ứ, cầm máu, tiêu thũng dùng để điều trị các chứng thổ huyết, chảy máu, lỵ ra máu, ung thũng, chấn thương Nhiều thành phần hóa học đã được phân lập

và xác định cấu trúc hóa học từ Tam thất như các saponin, acid amin, polyacetylene, phytosterol, flavonoide và polysaccharide

Gần đây, một số sản phẩm trên thị trường có sử dụng Tam thất chế biến với nhiều phương pháp khác nhau như hấp, sử dụng pH hay chiết vi sóng để nâng cao giá trị sử dụng Tam thất chế biến có một số tác dụng dược lý khác biệt đã được chứng minh như tăng sinh các tế bào máu và chống ung thư Trong quá trình chế biến, thành phần hóa học của Tam thất cũng có sự thay đổi như giảm hàm lượng các ginsenoside Rb1, Rg1 trong khi hàm lượng ginsenoside Rg3, Rh1, Rg2 lại tăng lên Hai chất ginsenoside Rb1

và Rg3 đều là những hoạt chất có tác dụng dược lý đã được chứng minh như bảo vệ thần kinh, hạ đường huyết, chống ung thư Và đặc biệt, một số nghiên cứu chỉ ra rằng, tác dụng tăng khả năng chống ung thư của Tam thất chế biến liên quan tới sự tăng hàm lượng ginsenoside Rg3 Hiện nay, Dược điển Việt Nam mới chỉ có quy định về định lượng các ginsenoside Rb1, Rg1 và notoginsenoside R1 trong Tam thất còn đối với Tam thất chế biến thì chưa có nhiều công bố về phân tích định lượng

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside trong Tam thất chế biến” với hai mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1

và ginsenoside Rg3 trong Tam thất chế biến bằng phương pháp HPLC

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng trên các mẫu Tam thất chế biến để định hưỡng xây dựng quy trình chế biến tối ưu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Tam thất

1.1.1 Tên khoa học, bộ phận dùng và phân bố

Tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk.) F H Chen, thuộc họ

Nhân sâm (Araliaceae) [3]

Tên gọi khác: Kim bất hoán, nhân sâm Tam thất, sâm Tam thất

- 1 số Saponin thuộc phân nhóm protopanaxatriol:

Ginsenoside Re, Rg1, Rg2, Rh1, Notoginsenoside R1, R2, R3, R6 [54]

Trong Tam thất, các ginsenoside Rb1, Rg1, Re, Rd và notoginsenoside R1 là năm thành phần chính, các thành phần khác còn lại có nồng độ rất thấp [54] [57]

Dược điển Việt Nam V quy định dược liệu phải chứa không ít hơn 0,4% notoginsenoside R1 và không ít hơn 5,0% tổng hàm lượng ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 và notoginsenoside R1 tính theo dược liệu khô [54]

Dược điển Trung Quốc cũng quy định dược liệu phải chứa không ít hơn 5,0% tổng hàm lượng hàm lượng ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 và notoginsenoside R1 tính theo dược liệu khô [52]

Cấu trúc hóa học và phân bố trong cây của 1 số saponin trong Tam thất được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Cấu trúc 1 số saponin dẫn chất của protopanaxadiol,

protopanaxatriol và phân bố trong cây [54] (Ghi chú: Glc: glucose; rha: rhamnose, xyl: Xylose)

R1= R3= H: Protopanaxadiol R2= R3= H: Protopanaxatriol

Phân bố trong cây

Phân bố trong cây Rb1 - glc-glc - glc-glc

Rễ, thân,

lá, hoa, quả, hạt

1.1.3 Công dụng

Theo dân gian, Tam thất có tác dụng hành ứ, cầm máu, tiêu thũng dùng để chữa

thổ huyết, chảy máu, lỵ ra máu, đẻ xong máu hôi không sạch, ung thũng, bị đòn tổn

thương, dùng ngoài có tác dụng cầm máu Là 1 vị thuốc bổ như nhân sâm, dùng thay

nhân sâm

Ngoài ra, rễ Tam thất còn có tác dụng tăng sức đề kháng, không gây tăng huyết

áp như nhân sâm, có tác dụng nội tiết tố kiểu estrogen [2]

Tam thất còn có tác dụng trên tim mạch [32]; chống oxy hóa [20][39]; tác dụng

điều hòa miễn dịch [28][39]; tác dụng bảo vệ tế bào não trong trường hợp thiểu năng

tuần hoàn não [19]; hạ lipid máu và phòng chống huyết khối [41]; tác dụng bảo vệ gan

[36][39]; chống viêm và giảm đau [31]

1.1.4 Tam thất chế biến

1.1.4.1 Các phương pháp chế biến Tam thất

Hiện nay có 1 số phương pháp chế biến Tam thất đã được thực hiện:

- Hấp tại các nhiệt độ khác nhau trong nồi áp suất cao: 100 – 1600C [44]

- Tiền xử lý với các acid hữu cơ sau đó hấp ở nhiệt độ cao: acid citric [17] [25] [26], acid ascobic, acid malic [26], acid acetic, acid oxalic, acid lactic [25]

- Xử lý với enzym β-glucosidase tái tổ hợp từ vi sinh vật [10] [42]

Các phương pháp này hoàn toàn có thể áp dụng vào chế biến Tam thất do Tam thất có thành phần hóa học tương tự Nhân sâm, giàu các ginsenoside Rb1 và Rg1

1.1.4.2 Chuyển hóa trong quá trình chế biến

Theo các nghiên cứu của Lau, Aik-Jiang và cộng sự: năm 2003, với phương pháp HPLC – DAD đã xác định được 5 saponin chính trong Tam thất là: ginsenosides Rg1,

Re, Rb1, Rd, notoginsenoside R1, các saponin này có nồng độ cao hơn trong Tam thất

chế biến và nồng độ của chúng giảm dần theo thời gian hấp [30] Năm 2004, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng có 8 saponin mới được tạo thành trong Tam thất hấp là: 20S-

ginsenoside Rh1, 20R-ginsenoside Rh1, 20S-ginsenoside Rg3, 20R-ginsenoside Rg3,

ginsenosides Rk3, Rh4, Rk1, Rg5, các saponin này không được phát hiện hoặc có với lượng rất nhỏ trong các mẫu Tam thất chưa qua chế biến Như vậy quá trình hấp đã gây

ra sự thủy phân và giáng hóa chuyển đổi một số saponin thành các hợp chất mới [29] Một số các nghiên cứu khác cũng chứng minh được 2 kết quả trên [49] [56]

Năm 2018, Bùi Thị Thu Hà và công sự đã nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn n-butanol từ cao chiết 80% methanol rễ củ Tam thất trước và sau chế biến,

đã phân lập được tương ứng 4 hợp chất ginsenoside Rg1, Re, Rd, Rb1 trong Tam thất trước chế biến và 2 hợp chất ginsenoside Rg3 và Rh1 trong Tam thất sau chế biến Cấu

trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên so sánh các phổ NMR, MS với dữ liệu phổ của các hợp chất này trong các tài liệu tham khảo [2]

Các quá trình chuyển hóa trong quá trình chế biến Tam thất được thể hiện trong hình 1.2 và 1.3

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa các saponin trong Tam thất hấp [56]

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa các saponin trong Tam thất hấp [49]

Cơ chế quá trình thủy phân là sự cắt bỏ các gốc đường (glycosyl, xylosyl, rhamnosyl) tại các vị trí C3, C6 và C20 hoặc là khử H2O tại C20 [49] [53] [56]

Thủy phân glycosyl tại C-20

Thủy phân glycosyl tại C-20

Thủy phân glycosyl tại C-20 Thủy phân

Khử nước tại C-20

Thủy phân glycosyl tại C-3

Hình 1.4 Biểu đồ hàm lượng Saponin trong rễ Tam thất hấp [49]

Trong quá trình hấp, hàm lượng 1 số ginsenoside bị thay đổi đáng kể (xem hình 1.4) [49]:

+ Ginsenoside Rb1 và Rg1 là những thành phần chính trong rễ Tam thất Sau khi hấp ở

1200C trong 1 giờ, Rb1 và Rg1 giảm lần lượt 51,1% và 41,4%; sau 6 giờ giảm lần lượt giảm đi 85,3% và 97,6% so với dược liệu ban đầu

+ Các ginsenosides Rh1, 20R-Rg2 và Rg3 tăng đáng kể sau quá trình hấp

+ Đặc biệt, lượng ginsenoside Rg3 tăng theo thời gian hấp và nhiệt độ hấp Cụ thể: tăng 5,23 lần ở rễ hấp trong 2 giờ ở 1200C so với 1000C và tại 1200C lượng ginsenoside Rg3 sau khi hấp 4 giờ gấp 3,22 lần so với mẫu hấp 1 giờ

Ngoài ra lượng ginsenoside Rg3 cũng tăng trong điều kiện được xử lý với acid đặc biệt

là acid citric và acid acetic [17] [25] [26]

1.1.4.3 Tác dụng dược lý của Tam thất chế biến

➢ Tác dụng chống ung thư

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống ung thư của Tam thất hấp thông qua cơ chế ức chế tăng sinh các tế bào khối u và kích hoạt apotosis tế bào cho thấy tác dụng của Tam thất hấp vượt trội hơn hẳn so với Tam thất chưa qua chế biến Tác dụng này phụ thuộc liều và thời gian điều trị Ngoài ra IC50 giảm dần khi tăng dần thời gian hấp (IC50 = nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh tế bào) [9] [49] [51]

➢ Tác dụng trên máu

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Tam thất hấp có tác dụng tăng sản xuất các tế bào máu, dùng trong trường hợp thiếu máu, có mặt trong các bài thuốc điều trị thiếu máu [14] [52]

Thí nghiệm in vivo trên P notoginseng chiết vi sóng cho thấy có tác dụng làm tăng sản xuất các tế bào máu, tương tự như P notoginseng hấp ở chuột bị thiếu máu Số lượng bạch cầu và hemoglobin tăng đáng kể so với nhóm chứng, đồng thời thời gian đông máu prothrombin cũng được rút ngắn đáng kể [37]

1.2 Tổng quan về chất nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về ginsenoside Rb1

1.2.1.1 Tính chất vật lý

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenoside Rb1

Ginenoside Rb1 (công thức cấu tạo xem hình 1.5) có các tính chất vật lý sau:

- Tên đầy đủ: glucopyranosyl) oxy]-12-hydroxydammar-24-en-3-yl-β-D-glucopyranoside

2-O-β-Glucopyranosyl-(3β,12β)-20-[(6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D Tên thường gọi: Ginsenoside Rb1, Rb1

1.2.1.2 Tác dụng dược lý

➢ Tác dụng trên thần kinh

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng trên thần kinh của ginsenoside Rb1 Rb1 có hiệu quả trong cải thiện trí nhớ, tăng hoạt động trí não [8] [11] [45] Cơ chế của các tác dụng này chủ yếu liên quan đến việc tăng giải phóng acetylcholin (ACh)

từ hồi hải mã [8] [11] Rb1 làm tăng biểu hiện của choline acetyltransferase và yếu tố tăng trưởng thần kinh mRNA ở vùng đồi thị [45]

Ngoài ra Rb1 còn là một tác nhân chống stress và bảo vệ thần kinh Tác dụng chống stress có hiệu quả trong cả mô hình stress cấp và mãn tính [11] Rb1 bảo vệ các

tế bào tủy sống khỏi độc tính kích thích thần kinh gây ra bởi glutamat và acid kainic cũng như stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 Các tác dụng bảo vệ thần kinh phụ thuộc vào liều Liều tối ưu của ginsenoside Rb1 là 20 – 40 μM [34]

➢ Tác dụng khác

Rb1 có tác dụng giảm béo do kích hoạt con đường dẫn truyền tín hiệu phosphatidylinositol 3-kinase/ Akt và gây ức chế biểu hiện gen NPY ở vùng dưới đồi,

do đó làm giảm đáng kể lượng thức ăn, trọng lượng cơ thể, hàm lượng chất béo và tăng

sử dụng năng lượng ở chuột béo phì do HFD [58]

Ngoài ra Rb1 còn giảm đáng kể đường huyết đói và cải thiện khả năng dung nạp glucose [58]; ức chế quá trình peroxy hóa lipid [12] và giảm tỷ lệ tử vong do bệnh cơ tim giãn ở chuột [62]

1.2.2 Tổng quan về ginsenoside Rg3

1.2.2.1 Tính chất vật lý

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của 20(S) – ginsenoside Rg3

Ginsenoside Rg3 (công thức cấu tạo xem hình 1.6) có các tính chất vật lý sau [24]:

- Tên đầy đủ: 12β, 20-dihydroxydammar-24-en-3β-yl glucopyranoside

2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D Tên thường gọi: 20(S)-Ginsenoside Rg3, Ginsenoside Rg3, Rg3

- Ung thư phổi

Trong một mô hình di căn thử nghiệm sử dụng khối u ác tính B16-BL6, việc tiêm tĩnh mạch liên tiếp 20(R) hoặc 20(S) -ginsenoside Rg3 với liều 100 μg/chuột trong vòng

4 ngày sau tiêm đã làm giảm đáng kể di căn phổi Tác dụng này cũng được ghi nhận ở liều thấp tiêm tĩnh mạch 10 μg/chuột Uống liều 100-1000 μg/chuột cũng có tác dụng tương tự Ngoài ra Rg3 còn ức chế di căn ung thư biểu mô phổi 26-M3.1 [38]

Ginsenoside Rg3 có tác dụng ức chế di căn phổi thực nghiệm trên mô hình các tế bào

u ác tính B16FE7 di căn ở chuột, ức chế sự xâm lấn do 1‐oleoyl‐lysophosphatidic acid (LPA)[47]

- Ung thư buồng trứng

Ginsenoside Rg3 có thể ức chế đáng kể di căn ung thư buồng trứng, cơ chế một phần

do ức chế hình thành mạch, giảm xâm lấn và giảm biểu hiện gen metallicoproteinase -

9 trong các tế bào SKOV-3 [59]

- Ung thư đại trực tràng

Sử dụng mô hình ghép khối u ung thư đại trực tràng, Rg3 đã được chứng minh có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển các khối u có nguồn gốc từ dòng tế bào ung thư HCT116 của người thông qua ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư, giảm biểu hiện PNCA (1 loại protein có chức năng tăng sinh tế bào) và ức chế quá trình phiên mã β-catein [35]

- Ung thư biểu mô dạ dày di căn phúc mạc

Chuột được tiêm dưới da azoxymethan và bombesin trong vòng 10 tuần để gây mô hình di căn giống như ở người đưa vào nghiên cứu Liệu pháp điều trị là tiêm dưới da ginsenoside Rg3 với liều 2,5 hoặc 5,0 mg/kg/ngày Kết quả cho thấy Rg3 có tác dụng

ức chế sự xâm lấn của một số tế bào khối u mà không làm suy yếu sự phát triển của tế bào trong ống nghiệm [16]

- Ung thư biểu mô tế bào gan

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ginsenoside Rg3 có thể ức chế hiệu quả sự phát triển của các dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư và thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào ung thư, một số mô hình đã được nghiên cứu như: tế bào SMMC-7721 và HepG2 được xử lý với các nồng độ ginsenoside Rg3 khác nhau (0, 25, 50, 75 và 100 µg/ml) và sự tăng sinh tế bào được phát hiện bằng xét nghiệm MTT tại các thời điểm 12, 24, 36 và 48 giờ [60]; tế bào Hep1-6 và HepG2 được điều trị bằng Rg3 ở các nồng độ 0, 50, 100 và 200 µg/ml trong ống nghiệm và ủ với các thời gian 0, 6, 12, 24 và 48 giờ [18] đều cho thấy rằng tác dụng chống ung thư của Rg3 tăng lên khi tăng nồng độ và thời gian điều trị

- Ung thư tuyến tiền liệt

Ginsenosides Rg3 cho thấy tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt cả ở tế bào ung thư tuyến tiền liệt phụ thuộc androgen (LNCaP) và không phụ thuộc androgen (PC3) thông qua cơ chế ức chế sự kết hợp [3H] thymidine phụ thuộc vào liều Giá trị EC50s (nồng độ đạt 50% tác dụng tối đa) của Rg3 trên các tế bào PC3 và LNCaP lần lượt là 8,4 µM và 11,4 µM [23]

- Ung thư vú

Rg3 đã chứng minh được tác dụng ức chế sự tăng sinh và gây ra apoptosis đối với

các tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) Cơ chế: ức chế tín hiệu NF- ĸB (một yếu tố phiên

mã điều chỉnh sự biểu hiện của protein chống apoptosis), thông qua bất hoạt ERK và Akt cũng như giảm mức độ đột biến p53, tác dụng này phụ thuộc vào nồng độ và thời gian điều trị [22]

➢ Tác dụng trên thần kinh

Thông qua cơ chế giảm quá trình peroxy hóa lipid, loại bỏ các gốc tự do và cải thiện quá trình chuyển hóa năng lượng, 20(S)-ginsenoside Rg3 có tác dụng bảo vệ thần kinh hiệu quả đối với thiếu máu não cục bộ ở chuột Ngoài ra Rg3 còn gây ức chế sự kích

hoạt thụ thể NMDA qua trung gian homocystein, một chất chuyển hóa của methionin, gây độc tính kích thích thông qua kích hoạt thụ thể NMDA nên có tác dụng bảo vệ thần kinh Tác dụng này phụ thuộc liều, với giá trị EC50 là 28,7 ± 7,5 μM [50]

Bên cạnh đó, sử dụng nhân sâm toàn phần, đặc biệt là ginsenoside Rg3, có tác dụng

ức chế hoạt hóa kênh Ca2+, ức chế sự khử cực của tế bào nên có tác dụng giảm đau [43]

➢ Tác dụng hạ đường huyết

Thử nghiệm dung nạp glucose đường uống thực hiện trên chuột cho thấy Rg3 đã ngăn tăng đường huyết bằng cách tăng cường tiết insulin 30 phút sau khi dùng Cơ chế có thể liên quan đến kênh K+ nhạy cảm với ATP và phosphoryl hóa protein kinase hoạt hóa bởi AMP (AMPK) Trong đó 20(S)-Rg3 cho thấy tác dụng dược lý cao hơn so với 20(R)-Rg3 [40]

➢ Tác dụng khác

Ginsenoside đã được chứng minh có nhiều tác dụng khác như ức chế co mạch [27], chống viêm do ức chế cyclooxygenase-2 (COX-2) [46], ức chế metalloproteinase-9 chống oxy hóa [46], chống béo phì do ức chế 2 protein chính điều hòa sự biệt hóa tế bào

mỡ [15]

1.3 Phương pháp định lượng ginsenoside Rb1 và Rg3

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và Rg3 Đối tượng nghiên cứu chủ yếu là Hồng sâm, một số nghiên cứu gần đây thực hiện trên đối tượng Tam thất hấp

Phương pháp tiến hành, đối tượng và điều kiện chuẩn bị mẫu, điều kiện phân tích được trình bày ở bảng 1.2

Ngoài các phương pháp định lượng Rb1 và Rg3 bằng HPLC với detector mảng diod, thì còn có một số các phương pháp khác như:

+ HPLC – ELSD [48] định lượng 19 ginsenoside trong nhân sâm đen;

+ LC - Q-TOF/MS [33] sử dụng cột pha đảo Phenomenex Luna C18 (2,1 mm × 150 mm,

5 µm) để định lượng 15 ginsenosides;

+ Hay các phương pháp UPLC-PDA; UPLC-QTOF-MS/MS định lượng các ginsenoside trong nhân sâm và các chế phẩm hồng sâm trên thị trường [61]

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu ngoài nước về định lượng ginsenoside Rb1, Rg3 Phương

+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu bột Tam thất sau khi hấp được sấy khô ở 800C đến khối lượng không đổi

Cân chính xác khoảng 1,0 g bột siêu âm với 10ml MeOH 70% trong 20 phút và lọc, lặp lại hai lần

Gộp dịch lọc, bay hơi dung môi trong chân không, thu cắn Hòa tan cắn trong 5 ml MeOH 70% và lọc qua màng 0,45µm trước khi tiêm sắc

+ Chuẩn bị mẫu:

Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu được chiết siêu âm với 10ml MeOH 70% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, để nguội và bù thể tích bằng MeOH Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm sắc ký

+ Pha tĩnh: Waters Symmetry C18 (3,9 × 150 mm;

5 µm)

[55]

+ Pha động: Acetonitril – Nước

+ Bước sóng phát hiện: 203 nm

HPLC

Các ginsenoside trong nhân sâm Hàn Quốc trong

đó có ginsenoside Rb1 và Rg3

+ Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm, 5 µm)

+ Pha động: Acetonitril – Nước

+ Bước sóng phát hiện: 203 nm

[21]

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Chuyên luận Tam thất (DĐVN V) quy định quy trình định lượng ginsenoside Rb1, Rg1 và notoginsenoside R1 trong Tam thất bằng phương pháp sắc ký lỏng, pha động acetonitril - nước, với chương trình rửa giải gradient được trình bày trong bảng

1.3, pha tĩnh là cột kích thước (4 mm×250 mm, 5 µm), detector quang phổ tử ngoại đặt

tại bước sóng 203 nm với thể tích tiêm: 10 µl và tốc độ dòng: từ 1 đến 1,6 ml/phút [3]

Bảng 1.3: Chương trình gradient dung môi trong chuyên luận Tam thất – DĐVN V

Tác giả Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận cũng đã xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Rg1 và majonoside R2 trong sâm Việt Nam bằng phương pháp HPLC – DAD, pha tĩnh là cột pha đảo C18 [7]

Năm 2013, nhóm tác giả Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Văn Bạch

đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng phương pháp HPTLC trên bản mỏng HPTLC silica gel 60F254 với pha động Chloroform/ Ethyl acetat /MeOH/ H2O (15/ 40/ 22/ 10), bước sóng phát hiện 275nm [6]

Nhóm tác giả Trần Quang Trung, Phan Thị Thu Hằng, Nguyễn Văn Bạch cũng

đã xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh

và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng HPTLC với cùng hệ pha động trên, thuốc thử hiện màu H SO 10%/ Ethanol [5]

Từ kết quả các nghiên cứu có thể thấy, hầu hết các tác giả đều sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực cao như methanol/ nước, ethanol/ nước để chiết xuất các ginsenoside Phương pháp chiết chủ yếu là siêu âm Pha tĩnh được sử dụng là cột sắc ký pha đảo C18 với hệ pha động acetonitril: nước Bước sóng phát hiện tại 203 nm

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và Rg3, tuy nhiên ở trong nước mới chỉ dừng lại định lượng ginsenoside Rb1 Ginsenoside Rb1 và ginsenoside Rg3 đều là các hoạt chất có tác dụng dược lý đã được chứng minh, đồng thời có sự thay đổi hàm lượng đáng kể trong quá trình chế biến, vì vậy chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside trong Tam thất chế biến” để theo dõi sự thay đổi hàm lượng 2 ginsenoside Rb1 và Rg3, đồng

thời xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng các chất này trong quá trình chế biến

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bột Tam thất hấp do Viện Dược liệu cung cấp (đã được chế biến bằng cách có hoặc không tiền xử lý với acid citric sau đó hấp tại 1200C bằng nồi hấp autoclave)

Danh mục và ký hiệu các mẫu phân tích được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích

TT Ký hiệu mẫu Xử lý acid Thời gian hấp

- ACN, MeOH (HPLC grade, Merk)

- MeOH (P.A, Trung Quốc)

- Nước cất hai lần đã được deion hoá

2.2.3 Thiết bị

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (Nhật Bản)

- Bể siêu âm

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm

- Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,0001 g

- Cân phân tích MS105/Mettler Toledo độ chính xác 0,00001 g

- Cân sấy hàm ẩm Precisa XM 60-HR

- Micropipet 2 - 20 µl, 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl

- Ống ly tâm 50ml

- Bình định mức, pipet, vial, giấy lọc…

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và ginsenoside Rg3 bằng HPLC

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

+ Lựa chọn pha tĩnh

+ Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện

+ Khảo sát chương trình pha động

- Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

+ Lựa chọn dung môi và phương pháp chiết

+ Khảo sát thể tích dung môi

+ Khảo sát thời gian chiết mẫu

2.3.2 Thẩm định phương pháp

- Độ thích hợp hệ thống

- Độ chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Độ lặp lại

- Độ đúng

2.3.3 Áp dụng phương pháp trên một số mẫu Tam thất chế biến

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng ginsenoside Rb1 và Rg3 trong các mẫu Tam thất chế biến ở các điều kiện khác nhau

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc Ginsenoside Rb1 640 µg/ml: Cân chính xác 3,2 mg chuẩn

ginsenoside Rb1, hòa tan chính xác trong bình định mức bằng 5 ml methanol

- Dung dịch chuẩn gốc Ginsenoside Rg3 640 µg/ml: Cân chính xác 3,2 mg chuẩn

ginsenoside Rb1, hòa tan chính xác trong bình định mức bằng 5 ml methanol

- Dung dịch chuẩn đơn: Tiến hành pha loãng từng dung dịch chuẩn gốc đến nồng

độ khoảng 50 µg/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng với

methanol thành các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ Rb1 và Rg3 chính xác như mong muốn

2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát chương trình pha động: tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril phối hợp với H2O theo các tỉ lệ khác nhau Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số kéo đuôi (Tf)

Yêu cầu: Độ phân giải Rs của pic Rb1 và Rg3 so với các pic khác phải đạt ít nhất

là 1,5; pic đảm bảo cân xứng; tR của các chất phân tích không quá dài

2.4.3 Quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát điều kiện chiết:

+ Thể tích dung môi chiết: Khảo sát các thể tích dung môi 10ml, 20ml và 25ml + Thời gian chiết: khảo sát ở 30 phút, 60 phút và 90 phút

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 và Rg3 trong Tam thất chế biến bằng HPLC theo hướng dẫn của AOAC

2.4.4.1 Độ thích hợp hệ thống

- Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống

phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

- Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

- Yêu cầu: chênh lệch về thời gian lưu và diện tích pic biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD% không được lớn hơn 2%