PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN MSV: 1401444 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Thị Kim Vân TS Lê Đình Chi Nơi thực hiện: Viện Dược liệu Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế chế biến – Viện Dược liệu, người tận tình hướng dẫn em từ ngày đầu làm nghiên cứu tới hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Đình Chi– GV Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất quan tâm, đóng góp ý kiến hỗ trợ em suốt q trình làm khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Lê Sơn, DS Nguyễn Thị Lê anh chị bạn Khoa Bào chế - Chế biến – Viện Dược liệu tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu khoa Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường toàn thể quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập trường Cuối cùng, với tất tình yêu thương, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân ln âm thầm theo dõi, động viên, chia sẻ, khuyến khích em suốt thời gian học tập trường Đại học Dược Hà Nội Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Phạm Thị Thảo Nguyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất 1.1.1 Tên khoa học, phận dùng phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Công dụng 1.1.4 Tam thất chế biến 1.2 Tổng quan chất nghiên cứu 1.2.1 Tổng quan ginsenoside Rb1 1.2.2 Tổng quan ginsenoside Rg3 1.3 Phương pháp định lượng ginsenoside Rb1 Rg3 11 1.3.1 Các nghiên cứu nước 11 1.3.2 Các nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 16 2.2.1 Chất chuẩn 16 2.2.2 Hóa chất 16 2.2.3 Thiết bị 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 ginsenoside Rg3 bằng HPLC 17 2.3.2 Thẩm định phương pháp 17 2.3.3 Áp dụng phương pháp số mẫu Tam thất chế biến 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 17 2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.4.3 Quy trình xử lý mẫu 18 2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích 18 2.4.5 Áp dụng số mẫu Tam thất chế biến 21 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sắc ký 22 3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh 22 3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát 22 3.1.3 Khảo sát chương trình pha động 23 3.1.4 Điều kiện sắc ký lựa chọn 25 3.2 Nghiên cứu quy trình chuẩn bị mẫu 26 3.2.1 Lựa chọn phương pháp dung môi chiết mẫu 26 3.2.2 Khảo sát thể tích dung môi chiết 26 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết 27 3.2.4 Quy trình chuẩn bị mẫu lựa chọn 28 3.3 Thẩm định phương pháp định lượng HPLC 28 3.3.1 Độ thích hợp hệ thống 28 3.3.2 Độ chọn lọc của phương pháp 28 3.3.3 Đường chuẩn độ tuyến tính 29 3.3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 31 3.3.5 Độ lặp lại 33 3.3.6 Độ 34 3.4 Áp dụng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến 35 3.5 Bàn luận 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học ACN Acetonitril Tiếng Việt Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa học Chemists phân tích thức DAD Diod Array Detector Detector mảng diod EtOH Ethanol AOAC HPLC HPLCELSD HPTLC High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography- evaporative light scattering detection Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao với detector tán xạ bay High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu Chromatography cao Sắc ký lỏng ghép đầu dò LC - Q- Liquid chromatography- Quadrupole- TOF/MS Time of Flight/Mass spectrometry LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Mass spectrometry NMR Nuclear Magnetic Resonance R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi Rb1 Ginsenoside Rb1 Ginsenosid Rb1 Rg3 20S - ginsenoside Rg3 20S – ginsenosid Rg3 RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu đường UPLC Ultra Performance Liquid Chromatoghraphy khối phổ tứ cực thời gian bay Phổ khối Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Sắc ký lỏng siêu hiệu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc số saponin dẫn chất protopanaxadiol, protopanaxatriol phân bố Bảng 1.2 Một số nghiên cứu nước định lượng ginsenoside Rb1, Rg3 12 Bảng 1.3: Chương trình gradient dung môi chuyên luận Tam thất – DĐVN V 14 Bảng 2.1 Danh mục mẫu phân tích 16 Bảng 3.1: Các chương trình khảo sát thành phần pha động 23 Bảng 3.2: Chương trình gradient dung mơi thức 25 Bảng 3.3 Các thông số đánh giá đổi với Rb1 Rg3 26 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 28 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic chất 30 Bảng 3.6 Kết xác định LOD LOQ phương pháp 31 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 33 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ phương pháp 34 Bảng 3.9 Kết hàm lượng Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến 35 Bảng 5.1 Chương trình gradient xây dựng 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa saponin Tam thất hấp Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa saponin Tam thất hấp Hình 1.4 Biểu đồ hàm lượng Saponin rễ Tam thất hấp Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo ginsenoside Rb1 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo 20(S) – ginsenoside Rg3 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV – Vis ginsenoside Rb1 22 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV – Vis ginsenoside Rg3 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử chương trình gradient 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử chuẩn chương trình gradient 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn chương trình gradient lựa chọn 26 Hình 3.7: Biểu đồ kết khảo sát thể tích dung mơi chiết 27 Hình 3.8: Biểu đồ kết khảo sát thời gian chiết 27 Hình 3.9 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp 29 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ ginsenoside Rb1 30 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ ginsenoside Rg3 31 Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOQ Rb1 (S/N = 12,55) 32 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOQ Rg3 (S/N = 9,74) 32 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định LOD Rb1 (S/N = 3,40) 32 Hình 3.15 Sắc ký đồ xác định LOD Rg3 (S/N = 3,03) 32 Hình 3.16: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rb1 mẫu thử 35 Hình 3.17: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rg3 mẫu thử 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, Tam thất (Panax notoginseng) coi vị thuốc quý với tác dụng hành ứ, cầm máu, tiêu thũng dùng để điều trị chứng thổ huyết, chảy máu, lỵ máu, ung thũng, chấn thương Nhiều thành phần hóa học phân lập xác định cấu trúc hóa học từ Tam thất saponin, acid amin, polyacetylene, phytosterol, flavonoide polysaccharide Gần đây, số sản phẩm thị trường có sử dụng Tam thất chế biến với nhiều phương pháp khác hấp, sử dụng pH hay chiết vi sóng để nâng cao giá trị sử dụng Tam thất chế biến có số tác dụng dược lý khác biệt chứng minh tăng sinh tế bào máu chống ung thư Trong trình chế biến, thành phần hóa học Tam thất có thay đổi giảm hàm lượng ginsenoside Rb1, Rg1 hàm lượng ginsenoside Rg3, Rh1, Rg2 lại tăng lên Hai chất ginsenoside Rb1 Rg3 hoạt chất có tác dụng dược lý chứng minh bảo vệ thần kinh, hạ đường huyết, chống ung thư Và đặc biệt, số nghiên cứu rằng, tác dụng tăng khả chống ung thư Tam thất chế biến liên quan tới tăng hàm lượng ginsenoside Rg3 Hiện nay, Dược điển Việt Nam có quy định định lượng ginsenoside Rb1, Rg1 notoginsenoside R1 Tam thất Tam thất chế biến chưa có nhiều cơng bố phân tích định lượng Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Tam thất chế biến” với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 ginsenoside Rg3 Tam thất chế biến phương pháp HPLC Áp dụng phương pháp xây dựng mẫu Tam thất chế biến để định hưỡng xây dựng quy trình chế biến tối ưu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất 1.1.1 Tên khoa học, phận dùng phân bố Tam thất có tên khoa học Panax notoginseng (Burk.) F H Chen, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) [3] Tên gọi khác: Kim bất hoán, nhân sâm Tam thất, sâm Tam thất Bộ phận dùng rễ củ Phần rễ Tam thất gọi củ Tam thất hay Sanchi Phân bố Miền nam Trung Quốc đặc biệt Vân Nam số nơi Việt Nam Hà Giang, Lào Cai, [4] 1.1.2 Thành phần hóa học Thành phần hóa học chủ yếu chứa saponin, ngồi có chất khác acid amin, polyacetylene, phytosterol, flavonoide, polysaccharide, Hiện có 100 saponin phân lập từ phần khác Tam thất Các saponin thuộc phân nhóm protopanaxadiol protopanaxatriol [37] [54] [57] - số saponin thuộc phân nhóm protopanaxadiol: Ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Notoginsenoside A, B, C, D, - số Saponin thuộc phân nhóm protopanaxatriol: Ginsenoside Re, Rg1, Rg2, Rh1, Notoginsenoside R1, R2, R3, R6 [54] Trong Tam thất, ginsenoside Rb1, Rg1, Re, Rd notoginsenoside R1 năm thành phần chính, thành phần khác lại có nồng độ thấp [54] [57] Dược điển Việt Nam V quy định dược liệu phải chứa khơng 0,4% notoginsenoside R1 khơng 5,0% tổng hàm lượng ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 notoginsenoside R1 tính theo dược liệu khơ [54] Dược điển Trung Quốc quy định dược liệu phải chứa khơng 5,0% tổng hàm lượng hàm lượng ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 notoginsenoside R1 tính theo dược liệu khơ [52] Cấu trúc hóa học phân bố số saponin Tam thất thể bảng 1.1 Đường chuẩn Rg3 1200000 Diện tích pic (mAU.s) 1000000 y = 6347,46x + 5265,96 R² = 0.9999 800000 600000 400000 200000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ ginsenoside Rg3 Đường chuẩn đánh giá thông qua hệ số hồi quy tuyến tính R (hoặc giá trị R2) độ chệch ∆ Kết đánh giá đường chuẩn trình bày bảng cho thấy R2 Rb1 Rg3 lớn 0,99, độ chệch điểm nhỏ ±15% (phù hợp với giới hạn cho phép AOAC) cho thấy đường chuẩn xây dựng có độ tuyến tính phù hợp để định lượng Rb1 Rg3 Tam thất chế biến 3.3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Phân tích mẫu chuẩn biết xác nồng độ Rb1 Rg3, sau pha loãng dần đến sắc ký đồ dung dịch chuẩn, thời gian lưu Rb1 Rg3, xác định tỷ lệ S/N = - S/N = 10 - 20 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ Rb1 Rg3 thể hình 3.12 - 3.15 kết LOD, LOQ trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết xác định LOD LOQ phương pháp Rb1 Rg3 LOD (µg/ml) 0,25 0,25 LOQ (µg/ml) 1,00 1,00 31 Rb1 Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOQ Rb1 (S/N = 12,55) Rg3 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOQ Rg3 (S/N = 9,74) Rb1 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định LOD Rb1 (S/N = 3,40) Rg3 Rg3 Hình 3.15 Sắc ký đồ xác định LOD Rg3 (S/N = 3,03) 32 Kết thực nghiệm cho thấy với Rb1, Rg3 LOQ 1,00 µg/ml LOD 0,25 µg/ml, tương ứng với hàm lượng Rb1, Rg3 dược liệu Tam thất chế biến 0,02% 0,005% 3.3.5 Độ lặp lại Để xác định độ lặp lại phương pháp, chúng tơi tiến hành phân tích độc lập lần mẫu dược liệu Tam thất chế biến M6 với quy trình mục 3.2.4 Tiến hành sắc ký ghi lại diện tích pic Rb1 Rg3 mẫu thử Hàm lượng mẫu thử tính tốn theo công thức sau: X (%) = C x 20 x P x 100 x 100% 1000 x 100 x m x (100-B) Trong đó: X : Hàm lượng Rb1 Rg3 tương ứng (%) C : Nồng độ Rb1 Rg3 tính từ phương trình đường chuẩn (µg/ml) P : Độ tinh khiết chất chuẩn (%) M : Khối lượng mẫu thử (mg) B : Độ ẩm mẫu thử (%) Kết đánh giá độ lặp lại trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp TT Độ ẩm Khối S pic (mAU.s) Hàm lượng (%) lượng (g) Rb1 Rg3 Rb1 Rg3 0,1009 586533 323705 2,22 1,10 0,1008 556853 324033 2,10 1,10 0,0992 562489 325972 2,15 1,13 0,1002 586353 324756 2,22 1,11 0,1010 572527 322949 2,15 1,10 0,0995 564683 325753 2,15 1,12 TB 2,17 1,11 SD 0,05 0,01 RSD (%) 2,2 1,1 (%) 11,557 33 Hàm lượng trung bình Rb1, Rg3 mẫu Tam thất chế biến 2,17 % 1,11 % với độ lệch chuẩn tương đối RSD 2,2 % 1,1 % nhỏ 2,7 % (Theo AOAC, với hàm lượng hoạt chất 1% độ lặp lại đạt yêu cầu RSD 2,7 %) cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại đạt yêu cầu 3.3.6 Độ Độ đánh giá thông qua tỷ lệ thu hồi chuẩn Rb1 Rg3 thêm vào mẫu thử Tam thất Mẫu thêm chuẩn: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu M6 Tiến hành thêm chuẩn mức khoảng 80% 100% 120% so với hàm lượng Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến Tiến hành xử lý mẫu mục 3.2.4 Mẫu khơng thêm chuẩn: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu M6 xử lý mẫu mục 3.2.4 Tiến hành định lượng mẫu thêm chuẩn mẫu không thêm chuẩn HPLC, mức thêm chuẩn làm lặp lại lần Kết đánh giá độ được trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ phương pháp TT Nồng độ Nồng độ Nồng độ thử mẫu thử chuẩn thêm thêm chuẩn (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) Rb1 Rg3 Rb1 Rg3 Độ thu hồi (%) Rb1 Rg3 Rb1 180,2 91,0 102,7 101,7 178,2 90,0 100,3 99,2 177,9 90,5 99,9 100,4 198,7 100,0 100,8 101,4 197,8 100,7 99,8 100,8 199,7 100,2 100,7 99,9 217,6 111,7 99,7 102,3 216,7 111,5 98,9 102,0 218,8 110,1 100,7 99,7 80,0 98,0 50,3 100,0 120,0 40,0 50,0 60,0 34 Rg3 Độ thu hồi trung bình (%) Rb1 Rg3 101,0 100,4 100,8 100,7 99,8 101,4 Độ thu hồi trung bình phương pháp định lượng Rb1 Rg3 Tam thất chế biến sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 99,8 -101,0% 100,4 – 101,4 % nằm giới hạn cho phép AOAC (yêu cầu độ thu hồi ứng với hàm lượng hoạt chất % 97 – 103%) Vậy phương pháp xây dựng có độ đạt yêu cầu 3.4 Áp dụng phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến Áp dụng phương pháp xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng Rb1 Rg3 mẫu dược liệu Tam thất chế biến Viện Dược liệu cung cấp Tiến hành xử lý mẫu mục 3.2.4 tiến hành sắc ký với điều kiện khảo sát Kết thu được trình bày bảng 3.9 hai biểu đồ kết hình 3.16 3.17 Bảng 3.9 Kết hàm lượng Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến Kí hiệu mẫu Hàm lượng (%) Rb1 Rg3 M1 2,8 0,4 M2 2,1 M3 Kí hiệu mẫu Hàm lượng (%) Rb1 Rg3 M7 1,1 1,3 1,0 M8 0,6 1,7 1,1 1,2 M9 2,4 0,5 M4 0,6 1,6 M10 1,5 1,2 M5 2,7 0,4 M11 0,9 1,4 M6 2,2 1,1 M12 0,3 1,7 Hàm lượng Rb1 Hàm lượng (%) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 30 phút giờ Thời gian Không xử lý acid Acid citric pH Acid citric pH Hình 3.16: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rb1 mẫu thử 35 Hàm lượng Rg3 Hàm lượng (%) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 30 phút giờ Thời gian Không xử lý acid Acid citric pH Acid citric pH Hình 3.17: Biểu đồ hàm lượng ginsenoside Rg3 mẫu thử Hàm lượng Rb1 Rg3 thay đổi theo điều kiện thời gian chế biến ✓ Thời gian hấp có ảnh hưởng đến thay đổi hàm lượng Rb1 Rg3 theo hướng ngược nhau: tăng thời gian hấp làm tăng hàm lượng Rg3 làm giảm hàm lượng Rb1 ✓ Việc xử lý acid có ảnh hưởng đến hàm lượng Rb1 Rg3 Các mẫu xử lý acid có xu hướng có hàm lượng Rb1 thấp hàm lượng Rg3 cao so với mẫu không xử lý ✓ Các kết phù hợp với nghiên cứu trước 3.5 Bàn luận Về mẫu nghiên cứu, ginsenoside Rb1 Rg3 hai hoạt chất có hoạt tính sinh học nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý Hai thành phần có thay đổi hàm lượng trình hấp Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành định lượng đồng thời thành phần dược liệu Tam thất chế biến mà trước Việt Nam chưa có tác giả tiến hành Phương pháp chiết mẫu siêu âm nhiệt độ thường, phương pháp chiết mẫu phổ biến để phân tích hoạt chất dược liệu Chúng tơi tiến hành lựa chọn thời gian tỷ lệ dung môi phù hợp nhằm đạt hiệu suất chiết cao Quy trình xử lý mẫu xây dựng đơn giản không cần trải qua nhiều công đoạn phức tạp gây thất mẫu phù hợp cơng tác đảm bảo chất lượng dược liệu 36 Về xây dựng chương trình sắc ký thẩm định phương pháp, HPLC, chúng tơi nhận thấy chương trình xây dựng có thời gian phân tích ngắn để định lượng đồng thời chất, giới hạn định lượng giới hạn phát Rb1 Rg3 tương đối thấp so với nghiên cứu trước (LOD=0,25 µg/ml; LOQ=1,00 µg/ml) phù hợp cho việc định lượng Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến điều kiện khác Chương trình dung mơi xây dựng thông qua tham khảo tài liệu trước điều chỉnh thành phần pha động để phù hợp với mẫu nghiên cứu, đảm bảo khả tách Rb1 Rg3 khỏi mẫu, pic thu có tính đối xứng Ngồi ra, phương pháp mà tiến hành thẩm định theo tiêu chí AOAC đáp ứng tiêu chí độ chọn lọc, độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính đường chuẩn, độ lặp lại độ Do đó, chúng tơi cho phương pháp lựa chọn có khả áp dụng rộng rãi việc xác định hàm lượng Rb1 Rg3 mẫu Tam thất chế biến 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT A Kết luận Qua trình thực đề tài, rút kết luận sau: Đã xây dựng phương pháp định lượng Rb1 Rg3 Tam thất chế biến máy HPLC Shimazu với điều kiện cụ thể sau: + Pha tnh: Ct SunfireTM C18 (4.6 mmì150 mm, àm) + Bước sóng phát hiện: 203 nm + Pha động: Kênh A: nước, kênh B: ACN + Chương trình gradient bảng 5.1 Bảng 5.1 Chương trình gradient xây dựng Thời gian (phút) % ACN - 10 35 - 37 10 - 13 37 - 46 13 - 33 46 -53 33 - 53 53 - 100 53 - 54 100 - 35 54 - 64 35 + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl + Nhiệt độ cột: 35oC +Tốc độ dòng: 0,75 ml/phút Đã thẩm định phương pháp theo tiêu chí AOAC về: + Độ thích hợp hệ thống (các giá trị RSD đề nhỏ 2%); + Độ chọn lọc; + Độ lặp lại (RSD nhỏ 2,7 %); + Độ thu hồi (đều nằm khoảng 97 – 103%); + Đường chuẩn khoảng tuyến tính (các giá trị R2 lớn 0,99; độ chệch điểm < ±15%); + Giới hạn phát Rb1 Rg3 0,25 µg/ml, giới hạn định lượng Rb1 Rg3 1,0 µg/ml Đã áp dụng phương pháp 12 mẫu Tam thất chế biến điều kiện khác thu kết trình bày bảng 3.9 38 B Đề xuất Do thời gian có hạn nên nhiều phần dự kiến nghiên cứu chưa hồn thiện mong muốn, chúng tơi đề xuất: Mở rộng nghiên cứu phân tích mẫu Tam thất chế biến điều kiện khác Ngồi Tam thất có nhiều thành phần có hoạt tính sinh học có thay đổi q trình chế biến đề xuất tiến hành định lượng thêm số ginsenoside khác Rh1, Rg2 Đồng thời đánh giá lại tác dụng dược lý Tam thất chế biến để góp phần kiểm sốt, hướng tới đưa vào sản phẩm chăm sóc sức khỏe 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hoàng Hải Anh, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Minh Đức (2011), “Phân tích thành phần saponin sâm Việt Nam ni cấy mơ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, Y Học TP Hồ Chí Minh, 15(1) Bùi Thị Thu Hà, Trần Thanh Hà, Nguyễn Thị Thu, Đỗ Thị Hà, Vũ Mạnh Hùng (2018),“Phân lập số saponin từ rễ củ Tam thất trồng Việt Nam trước sau chế biến”, Tạp chí Dược liệu, 23(1), tr 3–10 Hội đồng dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.1321–1322 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, , tr 289–291 Trần Quang Trung, Phan Thị Thu Hằng, Nguyễn Văn Bạch (2013), “Xác định hàm lượng Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Văn Bạch (2013), “Định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận (2011), “Xây dựng phương pháp định lượng GRb1, G-Rg1 MR2 sâm Việt Nam kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí Dược liệu, 16(1-2) TIẾNG ANH Benishin, C G., et al (1991), “Effects of ginsenoside Rb1 on central cholinergic metabolism”, Pharmacology, 42(4), pp.223-229 Chen, B.,et al (2013), “The apoptosis-inducing effect of ginsenoside F4 from steamed notoginseng on human lymphocytoma JK cells”, Natural product research, 27(24), pp.2351-2354 10 Cheng, L.Q., et al (2008), “Conversion of major ginsenoside Rb1 to 20 (S)ginsenoside Rg3 by Microbacterium sp GS514”, Phytochemistry, 69(1), pp 218- 224 11 Cheng, Y., Shen, L H., Zhang, J T (2005), “Anti‐amnestic and anti‐aging effects of ginsenoside Rg1 and Rb1 and its mechanism of action”, Acta Pharmacologica Sinica, 26(2), pp.143-149 12 Deng, H L., Zhang, J T (1991), “Anti-lipid peroxilative effect of ginsenoside Rb1 and Rg1”, Chinese medical journal, 104(5), 395-398 13 He, B C., et al (2011), "Ginsenoside Rg3 inhibits colorectal tumor growth through the down-regulation of Wnt/ss-catenin signaling", International journal of oncology", 38(2), pp.437-445 14 Hijikata, Y., Kano, T., Xi, L (2009), ''Treatment for intractable anemia with the traditional Chinese medicines Hominis Placenta and Cervi Cornus Colla (deer antler glue)", International journal of general medicine, 2, pp.83 15 Hwang, J., et al., “Antiobesity effect of ginsenoside Rg3 involves the AMPK and PPAR‐γ signal pathways,” Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 23(2), pp.262-266 16 Iishi, H., et al (1997) Inhibition by ginsenoside Rg3 of bombesin-enhanced peritoneal metastasis of intestinal adenocarcinomas induced by azoxymethane in Wistar rats Clinical & experimental metastasis, 15(6), 603-611 17 In, J.G., et al (2006), "Increase of Functional Saponin by Acidic Treatemnt and Temperature of Red Ginseng Extract", Korean Journal of Plant Resources, 19(1), pp.139-143 18 Jiang, J W., Chen, X M., Chen, X H., & Zheng, S S (2011), "Ginsenoside Rg3 inhibit hepatocellular carcinoma growth via intrinsic apoptotic pathway", World journal of gastroenterology: WJG, 17(31), pp.3605 19 Jiang, K.Y., Qian, Z N (1995) “Effects of Panax notoginseng saponins on posthypoxic cell damage of neurons in vitro”, Zhongguo yao li xue bao= Acta Pharmacol Sin., 16(5), pp 399–402 20 Jin, U.H., et al (2007), "Inhibitory effect of Panax notoginseng on nitric oxide synthase, cyclo‐oxygenase‐2 and neutrophil functions", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 21(2), pp.142-148 21 Kang, O J., Kim, J S (2016), "Comparison of ginsenoside contents in different parts of Korean ginseng (Panax ginseng CA Meyer)", Preventive nutrition and food science, 21(4), pp.389 22 Kim, B M., Kim, D H., Park, J H., Na, H K., & Surh, Y J (2013), "Ginsenoside Rg3 induces apoptosis of human breast cancer (MDA-MB-231) cells", Journal of cancer prevention, 18(2), pp.177 23 Kim, H S., et al (2004), "Effects of ginsenosides Rg3 and Rh2 on the proliferation of prostate cancer cells", Archives of pharmacal research, 27(4), pp.429 24 Kim, I., et al (2013), “Characterizing a full spectrum of physico-chemical properties of ( 20 S ) - and ( 20 R ) -ginsenoside Rg3 to be proposed as standard reference materials”, Journal of ginseng research, 37(1), 124 25 Kim, M.H., et al (2010), “Ginsenoside changes in red ginseng manufactured by acid impregnation treatment,” Journal of ginseng research, 34(2), pp.93–97 26 Kim, M.H., et al (2011), “The changes of ginsenoside patterns in red ginseng processed by organic acid impregnation pretreatment”, Journal of ginseng research, 35(4), pp.497 27 Kim, N D.,et al (2003), "Ginsenoside Rg3 inhibits phenylephrine‐induced vascular contraction through induction of nitric oxide synthase", British journal of pharmacology, 140(4), pp.661-670 28 Lam, S.K., Ng, T.B (2002), "A xylanase from roots of sanchi ginseng (Panax notoginseng) with inhibitory effects on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase", Life sciences, 70(25), pp.3049-3058 29 Lau, A.J., et al (2004), “High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng,” Journal of Chromatography A, 1057(1-2), pp.141-149 30 Lau, A.J., Woo, S.O., Koh, H.L (2003), "Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection", Journal of Chromatography A, 1011(1-2), pp.77-87 31 Li, S.H., Chu, Y (1999), “Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax notoginseng”, Zhongguo yao li xue bao= Acta pharmacologica Sinica, 20(6), pp.551-554 32 Li, X.J., Zhang, B.H (1988), "Studies on anti-arrhythmia effects of panaxatriol saponins isolated from Panax notoginseng", Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica, 23(3), pp.168 33 Liang, Y., et al (2013), “Effect of mobile phase additives on qualitative and quantitative analysis of ginsenosides by liquid chromatography hybrid quadrupole-time of flight mass spectrometry,” Journal of Chromatography A, 1297, pp.29-36 34 Liao, B., Newmark, H., Zhou, R (2002), “Neuroprotective effects of ginseng total saponin and ginsenosides Rb1 and Rg1 on spinal cord neurons in vitro”, Experimental neurology, 173(2), pp.224-234 35 Liao, P.Y., et al (2008), “Dammarane-type glycosides from steamed notoginseng”, Journal of agricultural and food chemistry, 56(5), pp.1751-1756 36 Lin, C.F., et al (2003), “Protection by hot water extract of Panax notoginseng on chronic ethanol‐induced hepatotoxicity”, Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 17(9), pp.1119-1122 37 Liu, H., et al (2018), "Production of minor ginenosides from Panax notoginseng by microwave processing method and evaluation of their blood-enriching and hemostatic activity", Molecules, 23(6), pp.1243 38 Mochizuki, M., et al (1995), “Inhibitory effect of tumor metastasis in mice by saponins, ginsenoside-Rb2, 20 (R)-and 20 (S)-ginsenoside-Rg3, of red ginseng”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(9), pp.1197-1202 39 Ng, T.B (2006), "Pharmacological activity of sanchi ginseng (Panax notoginseng)", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58(8), pp.1007-1019 40 Park, M W., Ha, J., Chung, S H (2008), "20 (S)-ginsenoside Rg3 enhances glucose-stimulated insulin secretion and activates AMPK", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 31(4), pp.748-751 41 Qin, F., Ye, Y.P., Sun, H.X (2006), “Haemolytic activity and adjuvant effect of notoginsenoside K from the roots of Panax notoginseng”, Chemistry & biodiversity, 3(10), pp.1144-1152 42 Quan, L.H., et al (2012), "Enzymatic biotransformation of ginsenoside Rb1 to 20 (S)-Rg3 by recombinant β-glucosidase from Microbacterium esteraromaticum", Applied microbiology and biotechnology, 94(2), pp.377-384 43 Rhim, H., et al (2002), "Ginseng and ginsenoside Rg3, a newly identified active ingredient of ginseng, modulate Ca2+ channel currents in rat sensory neurons", European journal of pharmacology, 436(3), pp.151-158 44 Ryu, J., et al (2017,) “Effect of hydrothermal processing on ginseng extract”, Journal of ginseng research, 41(4), pp 572–577 45 Salim, K N., McEwen, B S., Chao, H M (1997), “Ginsenoside Rb1 regulates ChAT, NGF and trkA mRNA expression in the rat brain”, Molecular Brain Research, 47(1-2), pp.177-182 46 Shin, Y M., Jung, H J., Choi, W Y., Lim, C J (2013), "Antioxidative, antiinflammatory, and matrix metalloproteinase inhibitory activities of 20 (S)ginsenoside Rg3 in cultured mammalian cell lines", Molecular biology reports, 40(1), pp.269-279 47 Shinkai, K., et al.(1996), “Inhibition of in vitro tumor cell invasion by ginsenoside Rg3,” Japanese Journal of Cancer Research, 87(4), pp.357-362 48 Sun, B S., et al (2009), "Simultaneous quantification of 19 ginsenosides in black ginseng developed from Panax ginseng by HPLC–ELSD", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 50(1), pp.15-22 49 Sun, S., et al (2010), “Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical composition and anticancer activities”, Food Chem, 118(2), pp 307–314 50 Tian, J.,et al (2005) "Neuroprotective effect of 20 (S)-ginsenoside Rg3 on cerebral ischemia in rats", Neuroscience letters, 374(2), pp.92-97 51 Toh, D.F., et al (2011), “Anti-proliferative effects of raw and steamed extracts of Panax notoginseng and its ginsenoside constituents on human liver cancer cells,” Chinese Medicine, 6(1), pp.4 52 The State Pharmacopoeia Commission of People Republic of China (2005), Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Chemical Industry Press, 1, pp.10-11 53 Vo, H.T., et al (2015), "Kinetic study for the optimization of ginsenoside Rg3 production by heat treatment of ginsenoside Rb1", Journal of ginseng research, 39(4), pp.304-313 54 Wang, C.Z., et al (2006), "Phytochemical and analytical studies of Panax notoginseng (Burk.) FH Chen", Journal of Natural Medicines, 60(2), pp 97-106 55 Wang, D., et al (2012), "The processing of Panax notoginseng and the transformation of its saponin components", Food chemistry, 132(4), pp.18081813 56 Wang, D., et al (2012), “The processing of Panax notoginseng and the transformation of its saponin components”, Food Chem, 132(4), pp 1808–1813 57 Wang, X.Y., et al (2008), "Two New Dammarane‐Type Bisdesmosides from the Fruit Pedicels of Panax notoginseng", Helvetica Chimica Acta, 91(1), pp 60-66 58 Xiong, Y., et al (2010), “Antiobesity and antihyperglycemic effects of ginsenoside Rb1 in rats”, Diabetes, 59(10), pp.2505-2512 59 Xu, T., et al.(2008), “Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis,” Chinese medical journal, 121(15), pp.1394-1397 60 Zhang, C., et al (2012), “Antitumor effects of ginsenoside Rg3 on human hepatocellular carcinoma cells,” Mol Med Rep., vol 5, no 5, pp 1295–1298, 2012 61 Zhang, H M., et al (2012), "Holistic quality evaluation of commercial white and red ginseng using a UPLC-QTOF-MS/MS-based metabolomics approach", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 62, pp.258-273 62 Zhao, H., et al (2010), “Ginsenoside-Rb1 attenuates dilated cardiomyopathy in cTnTR141W Transgenic mouse”, Journal of pharmacological sciences, 112(2), pp.214-222 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THẢO NGUYÊN MSV: 1401444 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GINSENOSIDE TRONG TAM THẤT CHẾ BIẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Thị Kim Vân TS... Rb1 ginsenoside Rg3 Tam thất chế biến phương pháp HPLC Áp dụng phương pháp xây dựng mẫu Tam thất chế biến để định hưỡng xây dựng quy trình chế biến tối ưu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất. .. tích định lượng Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Tam thất chế biến với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời ginsenoside