xây dựng phương pháp định lượng gluataraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y

Mục tiêu của đề tài này là xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y, b ng phương pháp quang phổ UV-vis.. Phần II: Tổng quan Chư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLUATARALDEHYDE TRONG NGUYÊN LIỆU

VÀ THÀNH PHẨM THUỐC THÚ Y

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ths NGUYỄN PHƯƠNG HẢI ĐẶNG MINH THÀNH

MSSV: 2082237 LỚP CÔNG NGHỆ HÓA K34

Cần Thơ, tháng 5 năm 2012

LỜI CẢM ƠN



Qua quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và những kỹ năng thực hành rất bổ ích Đó chính là nhờ sự giúp đỡ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Chú Nguyễn Phương Hải đã động viên, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt

nhất cả về vật chất lẫn tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn này

Các anh chị phòng thí nghiệm hoá lý, Công ty Vemedim đã luôn động viên,

giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống cũng như trong học tập

Tất cả quý thầy cô bộ môn Công nghệ Hoá, khoa Công nghệ đã truyền đạt

cho tôi những kiến thức vô cùng bổ ích trong học tập và nghiên cứu

Gia đình đã luôn ủng hộ, động viên và chăm lo cho tôi cả về vật chất lẫn tinh

thần

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Hóa Học K34

đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cần Thơ, tháng 5 năm 2012

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Cần Thơ, Ngày …Tháng … Năm… Giáo Viên Hướng Dẫn

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Cần Thơ, Ngày …Tháng … Năm…

Giáo Viên Phản Biện

TÓM TẮT ĐỀ TÀI



Glutaraldehyde được rất nhiều công ty về lĩnh vực chăn nuôi thú y sử dụng cho các chế phẩm thuốc sát trùng, đặc biệt là dùng vệ sinh chuồng trại và tiêu diệt vi khuẩn Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bào rất nhanh, có khả năng diệt khuẩn phổ rộng Vì vậy việc định lượng glutaraldehyde là rất cần thiết Có nhiều phương pháp định lượng glutaraldehyde, trong đó phương pháp quang phổ với ưu điểm đơn giản, chi phí thấp phù hợp với phòng thí nghiệm sẽ là việc lựa chọn thích hợp

Mục tiêu của đề tài này là xây dựng phương pháp xác định hàm lượng

Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y, b ng phương pháp

quang phổ UV-vis Đánh giá và so sánh với các phương pháp định lượng khác đã được công bố

Sau một thời gian thực hiện đề tài kết quả thu được như sau:

 Xây dựng được phương pháp định lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu

và trong thành phẩm b ng phương pháp quang phổ UV-Vis Đáp ứng được yêu cầu: đối với nguyên liệu có sai số 5,0 , Đối với thành phẩm có sai số 10

 Nội dung phương pháp đã xây dựng

 Chuẩn bị dung dịch :

- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml

- DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98

- Ethanol nguyên chất

- DD đ c Glu 0,04 : Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 100 ethanol

vđ 50ml Pha loãng 1 50 với cùng dung môi 400mg L

So sánh Abs tại max của DD thử với DD đ c để suy ra hàm lượng Glutaraldehyde có trong mẫu thử

 Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng:

 Độ chọn lọc:

Trung bình Pp ch thực hiện được trên những mẫu ch có

Glutaraldehyde hay ch có các chất không tham gia phản ứng với h n hợp Phenol + acid H2SO4đđ

 Độ lặp lại: Rất cao RSD = 0.562939%

 Độ đúng: đạt yêu cầu Hệ số tìm lại: RC = 95,37%

 Độ tuyến tính: rất cao

Hệ số tương quan tuyến tính: R= 0,9999 ;

Phương trình tương quan tuyến tính: Abs = 0.2014*C Glu + 0.0269

(CGlu : nồng độ Glutaraldehyde tính theo mol l

- Giới hạn phát hiện: rất thấp Pp rất nhạy

LOD = 0,45178.10 -5 mol/L hay 0,45mg/L Glutaraldehyde

- Giới hạn định lượng: rất thấp Pp rất tinh

LLOQ = 0,53047.10 -5 mol/L  0,53mg/L Glutaraldehyde

HLOQ = 12.10 -5 mol/L hay  12mg/L Glutaraldehyde

MỤC LỤC



Trang

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI TÓM TẮT v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU xii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶC VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU YÊU CẦU 2

1.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN CHƯƠNG 2: KHÁI QUÁT VỀ GLUTARALDEHYDE 3

2.1 GIỚI THIỆU 3

2.2 ĐẶC ĐIỂM 5

2.3 TÍNH CHẤT 6

2.3.1 Tính chất vật lý 6

2.3.2 Tính chất hóa học 6

2.4 ĐIỀU CHẾ GLUTARALDEHYDE 10

2.5 ỨNG DỤNG 11

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GLUTARALDEHYDE 13

3.1.1 Phân tích thành phần 13

3.1.2 Phản ứng hóa học 14

3.1.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV UV-HPLC) 15

3.1.4 Sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang 16

3.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 17

3.2.1 Phương pháp Chuẩn độ 17

3.2.2 Phương pháp Quang phổ 18

3.2.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV-Vis 19

CHƯƠNG 4: THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 21

4.1 GIỚI THIỆU 21

4.1.1 Mục đích 21

4.1.2 Nội dung 21

4.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 22

4.2.1 Tính đặc hiệu 22

4.2.2 Độ đúng 23

4.2.3 Độ chụm 24

4.2.4 Độ tuyến tính 26

4.2.5 Giới hạn phân tích – Khoảng áp dụng 27

4.2.5.1 Giới hạn phân tích 27

4.2.5.2 Khoảng áp dụng 27

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM CHƯƠNG 5: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM 28

5.1 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 28

5.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 28

5.2.1 Hóa chất, thuốc thử 28

5.3.1 Thí nghiệm về phương pháp quang phổ 29

5.3.2 Thí nghiệm về nội dung thẩm định 33

5.3.3 Thí nghiệm về đánh giá so sánh phương pháp 36

CHƯƠNG 6: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 39

6.1 THÍ NGHIỆM VỀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 39

6.2 THÍ NGHIỆM VỀ NỘI DUNG THẨM ĐỊNH 49

6.3 THÍ NGHIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ 55

PHẦN 4: KẾT LUẬN 62

A-KẾT LUẬN 62

B-KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 1 66

PHỤ LỤC 2 68

DANH MỤC HÌNH ẢNH



Trang

Hình 2.1: Glutaraldehyde trong thùng 250kg 3

Hình 2.2 : chế phẩm VIME-PROTEX của công ty Vemedim 4

Hình 2.3: Glutaraldehyde trên thị trường 6

Hình 2.4 :Chế phẩm VIME-PROTEX của Vemedim-Việt Nam 11

Hình 2.5 :Chế phẩm VBK của công ty ViBo-Việt Nam 12

Hình 4.1: So sánh độ nhạy của phương pháp b ng đồ thị 26

Hình 6.1: Sự phụ thuộc của độ hấp thu Abs theo bước sóng ) 39

Hình 6.2: Sự phụ thuộc của Abs mẫu trắng theo bước sóng ) 40

Hình 6.3: Sự phụ thuộc của Abs phức Glu-Phe theo  41

Hình 6.4: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ acid H2SO4 43

Hình 6.5: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ Phenol 44

Hình 6.6: Sự phụ thuộc của Abs phức theo thời gian đo phổ 45

Hình 6.7: Sự phụ thuộc của Abs phức theo nồng độ Glutaraldehyde 47

Hình 6.8 : Khoảng tuyến tính của nồng độ Glutaraldehyde 52

Hình 6.9: LLOQ của Glutaraldehyde trong pp Quang phổ 54

Hình 6.10: Kết quả khảo sát mẫu 1 nguyên liệu 56

Hình 6.11: Thành phẩm Vime-Protex của công ty vemedim 58

Hình 6.12: Kết quả đo mẫu 1 thành phẩm 59

DANH MỤC BẢNG



Trang

Bảng 6.1: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nồng độ acid H2SO4 42

Bảng 6.2: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nồng độ Phenol 44

Bảng 6.3: Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo thời gian 45

Bảng 6.4 : Kết quả khảo sát Abs của phức Glu-Phe theo nồng độ Glu 46

Bảng 6.5: Kết quả sự khảo sát độ chọn lọc của phức Glu-Phe 49

Bảng 6.6: Kết quả sự khảo sát độ lặp lại của phức Glu-Phe 50

Bảng 6.7: Kết quả sự khảo sát độ đúng của phức Glu-Phe 51

Bảng 6.8: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phức Glu-Phe 52

Bảng 6.9: Kết quả sự khảo sát độ lặp lại của phức Glu-Phe 53

Bảng 6.10: Kết quả định lượng Glu b ng phương pháp quang phổ 56

Bảng 6.11: Kết quả định lượng nguyên liệu b ng phương pháp chuẩn độ 57

Bảng 6.12: Kết quả định lượng thành phẩm b ng phương pháp quang phổ 60

Bảng 6.13: Kết quả định lượng thành phẩm b ng phương pháp chuẩn độ 60

Bảng 6.14: So sánh kết quả của 2 pp trên nguyên liệu và thành phẩm 61

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT & KÝ HIỆU



LLOQ Giới hạn định lượng dưới – LLOQ (Low Limit of Quantitation)i

Phần I: Mở Đầu Chương 1: Mở Đầu

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, thuốc sát trùng được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực chăn nuôi thú y Đặc biệt với khí hậu nhiệt đới gió mùa ở Việt Nam thì đây là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển Khi thời tiết mưa nắng thất thường thì các trang trại luôn đối mặt với nguy cơ dịch bệnh bộc phát

Để ngăn ngừa dịch bệnh, một trong những biện pháp đơn giản nhưng hiệu quả và ít tốn k m là sát trùng chuồng trại Mục đích của sát trùng chuồng trại là làm giảm số lượng tác nhân gây bệnh tới mức không còn là mối đe dọa bệnh tật đối với vật nuôi, từ đó giảm chi phí điều trị, giúp cải thiện sức khỏe cho thú, gia tăng hiệu quả thức ăn, thú tăng trọng nhanh và tăng lợi nhuận cho nhà chăn nuôi

Nhưng hiện nay trên thị trường Việt Nam có rất nhiều loại thuốc sát trùng,

m i loại có tính năng khác nhau, có loại công hiệu với vi sinh vật này mà thuốc khác thì không Một trong những thành phần chính của thuốc sát trùng là Glutaraldehyde

Glutaraldehyde (C5H8O2 , với công thức cấu tạo là OHC-CH2-CH2-CH2CHO, một hợp chất di-dehyde 5 carbon bão hòa, không màu, có mùi cay nồng, tan trong dung môi như là nước, ether, cồn, benzen Glutaraldehyde có nhiều tên gọi khác nhau như: 1,5-pentanedial, glutaral, glutardialdehyde

-Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bào rất nhanh, có khả năng diệt khuẩn phổ rộng Trong lĩnh vực chăn nuôi thú y, glutaraldehyde được sử dụng làm thuốc sát trùng phổ rộng, tiêu diệt virus, vi khuẩn nấm gây bệnh cho gia súc, gia cầm.Dung dịch glutaraldehyde 10–15% được sử dụng trong xử lý nước, khống chế

sự phát triển của vi khuẩn gram âm - và gram dương , tảo, nấm và cả vi-rút trong nước Ngoài ra, nó còn được sử dụng như là chất cố định bộ phận trong phân tích tế bào dưới kính hiển vi điện tử Nó cũng thường được sử dụng trong ứng dụng sinh hóa thông qua liên kết ch o crosslinking và alkyl hoá alkylating làm bất hoạt tế bào

Từ những ứng dụng nêu trên, việc định lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc thú y là rất quan trọng Nó giúp cho chúng ta có một cách

sử dụng hợp lý hơn về glutaraldehyde Chính vì vậy, đề tài “ Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và thành phẩm

1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU

Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Glutaraldehyde trong nguyên

liệu và thành phẩm thuốc thú y, b ng phương pháp quang phổ UV-vis Đánh giá và

so sánh với các phương pháp định lượng khác đã được công bố

1.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN

Địa điểm: Phòng thí nghiệm QC thuộc công ty Vemedim, số 7 đường 30 4, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

Thời gian thực hiện: Từ ngày 13/01/2012 – 13/04/2012

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khái quát về Glutaraldehyde

CHƯƠNG 2: KHÁI QUÁT VỀ GLUTARALDEHYDE

2.1 GIỚI THIỆU [18], [19], [21]

 Nguồn gốc

Glutaraldehyde được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1908 do các nhà bác học Harries và Tank Đến 1950, Glutaraldehyde dược sử dụng làm thuốc sát trùng trong nhiều lĩnh vực

Glutaraldehyde sau đó được rất nhiều công ty sử dụng cho các chế phẩm thuốc

sát trùng Đặc biệt là dùng vệ sinh chuồng trại và tiêu diệt vi khuẩn

 Sản lượng, quy mô sản xuất

Glutaraldehyde được sản xuất trong nhiều ngành

công nghiệp như:chăn nuôi, thú y, công nghệ ướp xác…

Nước sản xuất Glutaraldehyde nhiều nhất là Trung Quốc

với trên 50.000 tấn Ch tính riêng sản lượng của Công ty

TNHH Hóa LAOHEKOU Jinghong đã là 5.000 tấn năm

 Tầm quan trọng

Gluataraldehyde có khả năng giết chết tế bào rất

nhanh, có khả năng diệt khuẩn phổ rộng Trong lĩnh vực

chăn nuôi thú y, glutaraldehyde được sử dụng làm thuốc sát trùng phổ rộng, tiêu diệt virus, vi khuẩn nấm gây bệnh cho gia súc, gia cầm Dung dịch glutaraldehyde 10–15 được sử dụng trong xử lý nước, khống chế sự phát triển của vi khuẩn gram

âm - và gram dương , tảo, nấm và cả vi-rút trong nước

Glutaraldehyde còn được sử dụng như là chất cố định bộ phận trong phân tích

tế bào dưới kính hiển vi điện tử Nó cũng thường được sử dụng trong ứng dụng sinh hóa thông qua liên kết ch o crosslinking và alkyl hoá alkylating làm bất hoạt tế bào

Trong công nghệ làm phim x-ray, glutaraldehyde được sử dụng làm chất làm cứng để rút ngắn chu kỳ làm khô của phim

Trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, glutaraldehyde 10-50 được sử dụng làm giảm hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật trong bột giấy

Hình 2.1:

Glutaraldehyde trong thùng 250kg

Hình 2.2 : chế phẩm VIME-PROTEX của công ty Vemedim

Trong công nghiệp thuộc da, gluataraldehyde được sử dụng để làm mềm da và tăng cường khả năng chịu kiềm, nước và nấm mốc Da được ngâm trong dung dịch chứa glutaraldehyde 0,5-2%

Trong công nghiệp mỹ phẩm, glutaraldehyde được sử dụng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm ở châu Âu ở nồng độ lên đến 0,1 Nó không được sử dụng trong các bĩnh xịt và thuốc xịt

Trong lĩnh vực y tế, kết quả nghiên cứu cho thấy r ng virus HIV, viên gan B HBV sẽ dị tiêu diệt hoặc bất hoạt khi bị xử lý glutarldehyde 2 trong 5 phút

Trong xử lý nước sinh hoạt, sau nửa giờ xử lý, 99 vi khuẩn Legionella bị tiêu diệt

ở nồng độ 100 mg L

Công ty Vemedim Vietnam đã sử dụng

Alkyldimethylbenzylammonium chloride để tạo thành

chế phẩm dạng dung dịch VIME-PROTEX rất hiệu quả

trong chăn nuôi gia súc gia cầm

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khái quát về Glutaraldehyde

 Danh pháp IUPAC 1,5-pentanedial

 Tên khác: 1,5-pentanedial, glutaral,

2.3 TÍNH CHẤT [7], [8], [12], [19], [20], [23]

2.3.1 Tính chất vật lý

- Chất lỏng màu vàng

- Mùi đặc trưng

- Tan nhiều trong nước

- Điểm sôi: 187OC - 189C phân hủy

2/ Tác dụng với O 2 tạo thành acid tương ứng

3/ Tác dụng với Cu(OH) 2 /NaOH tạo thành muối dạng Natri

8 Thuốc thử : 3-methylbenzonthiazolin-2-one hydrazone

9 Thuốc thử Hantzsch: diethyl acetonedicarboxylate and ammonia

10 Thuốc thử : 3,5-diaminobenzonic acid.

11 Thuốc thử : p-aminopheno

12 thuốc thử : phenol và acid sunfuric.

Hình 2.3: Glutaraldehyde trên thị trường

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khái quát về Glutaraldehyde

Cụ thể các phản ứng như sau:

1) Tác dụng với AgNO 3 /NH 3 tạo thành muối dạng Amoni.(phản ứng tráng gương)

R-CHO + 2[Ag(NH3)2]OH → R-COONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O

2) Tác dụng với O 2 tạo thành acid tương ứng :

R-CHO ½ O2 → R-COOH

3) Tác dụng với Cu(OH) 2 /NaOH tạo thành muối dạng Natri :

Phản ứng xảy ra trong moi trường kiềm, tạo thành muối Natri

RCHO + 2Cu(OH)2 + NaOH = RCOONa + Cu2O + 3H2O

7) Tác dụng với thuốc thử2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH)

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid, tạo thành hợp chất glutaral dinitrophenylhydrazone, có màu vàng cam Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp so màu Colorimetry, max = 412 nm)

2,4-8) Tác dụng với Thuốc thử : 3-methylbenzonthiazolin-2-one hydrazone :

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid ở nhiệt độ phòng trong 10  30 phút, tạo thành hợp chất có màu xanh

Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp so màu Colorimetry, max =

Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp đo phổ huỳnh quang (Fluorimetry, ex = 344nm)

10) Tác dụng với thuốc thử : 3,5-diaminobenzonic acid :

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid, đun 500C trong 30 phút, tạo thành dẫn xuất với 3,5-diaminobenzonic acid có vàng- xanh

Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp so màu Colorimetry, max = 405- 495 nm)

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khái quát về Glutaraldehyde

12) Tác dụng thuốc thử : phenol và acid sunfuric

Phản ứng xảy ra trong môi trường acid mạnh, tạo thành dẫn xuất có màu vàng

Có thể sử dụng phản ứng này cho phương pháp so màu

(Colorimetry, max = 482)

Giai đoạn 1

Giai đoạn 2:

C C

O

H H

O + 2

OH

H+

C

C H OH

OH

H O O

C

C H OH

OH

H O

H++ 2

C C

H O

H OO O

+ 2H2O

Phần II: Tổng quan Chương 2: Khái quát về Glutaraldehyde

- VIME-PROTEX là dung dịch thuốc sát trùng phổ

rộng, tiêu diệt vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh cho gia súc

- Trại chăn nuôi trâu bò, heo, gà, vịt

- Dụng cụ chuyên chở gia súc, lò giết mổ

- Tẩy trùng thiết bị, dụng cụ dùng trong chăn nuôi

 CÁCH DÙNG:

Liều chung : 1lít pha với 200-500 lít nước

Chai 250ml pha với 50 - 125 lít nước

- Sát trùng trại chăn nuôi : 1:200, phun sương khắp trại hay phương tiện chuyên

chở

- Tẩy trùng thiết bị : 1:500, ngâm dụng cụ

Làm sạch dụng cụ, sau đó dùng thuốc đã pha loãng phun, xịt hoặc ngâm dụng cụ

Hình 2.4 : Chế phẩm VIME-PROTEX của Vemedim-Việt Nam

 Chế phẩm VBK Công ty ViBo – Việt Nam

Thành phần: Trong 1000ml có:

-Glutaraldehyde ….……… 200g

-Alkyldimethylbenzylammonium chloride 150g

 Công dụng:

Tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh : Đỏ thân, phát

sáng, mòn đuôi, cụt râu, đốm đen …

Diệt nấm và các nguyên sinh động vật gây bệnh

cho tôm

Ngăn ngừa sự phát triển của các virus gây bệnh:

Đốm trắng, đầu vàng, teo gan

 Cách dùng:

Sử dụng: 1 lít VBK 5.000-6.000 m3

nước Dùng tốt nhất khoảng 8- 10 giờ sáng

Hình 2.5 : Chế phẩm VBK của công ty ViBo-Việt Nam

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1 Nung một khối lượng chính xác a gam hợp chất hữu cơ chứa các nguyên

tố C,H,N,O đã được trộn đều với bột CuO

2 Hấp thụ hơi H2O và khí CO2 sinh ra lần lượt b ng H2SO4 đặc và KOH Độ tăng khối lượng của m i bình chính là khối lượng H2O và CO2 tương ứng

2 Tác dụng với O2 tạo thành acid tương ứng

3 Tác dụng với Cu OH 2 NaOH tạo thành muối dạng Natri

8 Thuốc thử : 3-methylbenzonthiazolin-2-one hydrazone

9 Thuốc thử Hantzsch: diethyl acetonedicarboxylate and ammonia

10 Thuốc thử : 3,5-diaminobenzonic acid

11 Thuốc thử : p-aminophenol

12 Thuốc thử : phenol và acid sunfuric

Điều kiện thực hiện và phương trình phản ứng đã được trình bày ở chương 1

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

3.1.3 Sắc ký lỏng đầu dò UV (HPLC-UV)

 Nguyên tắc:

Xem chi tiết ở : Lý thuyết HPLC

- HPLC-UV dựa trên các nguyên tắc sau:

i Các chất trong mẫu thử hấp phụ lên cột và giải hấp phụ khỏi cột b ng pha động có tính chọn lọc nên thứ tự các chất đi ra khỏi cột khác nhau tách rời nhau

ii Đầu dò UV phát hiện các chất có nối đôi liên hợp, vẽ thành các peak theo thứ tự ra khỏi cột và độ lớn của peak diện tích peak tỷ lệ thuận với nồng độ các chất

- Glutaraldehyde không có nối đôi liên hợp nên không thể phát hiện bởi đầu

dò UV Do đó phải tạo dẫn xuất với chất có nối đôi liên hợp Việc tạo dẫn xuất dựa trên phản ứng của nhóm aldehyde với các thuốc thử đặc hiệu

 Các chất tạo dẫn xuất với Glutaraldehyde để chạy được HPLC-UV là:

3.1.4 Sắc ký lỏng đầu dò Huỳnh quang

 Nguyên tắc:

Xem chi tiết ở : Lý thuyết HPLC

- HPLC-FL dựa trên các nguyên tắc sau:

1 Các chất trong mẫu thử hấp phụ lên cột và giải hấp phụ khỏi cột b ng pha động có tính chọn lọc nên thứ tự các chất đi ra khỏi cột khác nhau tách rời nhau

2 Đầu dò FL phát hiện các chất có tính phát huỳnh quang, vẽ thành các peak theo thứ tự ra khỏi cột và độ lớn của peak diện tích peak tỷ lệ thuận với nồng độ các chất

- Glutaraldehyde không có tính phát huỳnh quang, do đó phải tạo dẫn xuất với chất có tính phát huỳnh quang

 Các chất có tính phát huỳnh quang tạo dẫn xuất đƣợc với Glutaraldehyde để có thể chạy HPLC-FL là:

Diethyl acetonedicarboxylate and ammonia

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

N OHH

1ml dd NaOH 1M  50,05mg Glutaraldehyde (C 5 H 8 O 2 )

3.2.2 Phương pháp Quang phổ

Trong công thức phân tử Glutaraldehyde không có nối đôi liên hợp nên không

có hấp thu cực đại trong vùng bước sóng UV-Vis hay phát huỳnh quang

Để có thể định lượng được b ng phương pháp quang phổ cần phải tạo dẫn xuất của Glutaraldehyde với các chất có nhiều nối đôi liên hợp Tùy theo tính chất của các dẫn xuất này mà ta có phương pháp quang phổ UV-Vis hay phương pháp quang phổ huỳnh quang

Đại lượng đặc trưng cho phương pháp này là độ hấp thu A Độ hấp thu A được tính b ng logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền suốt T khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua Nó được biểu thị b ng phương trình:

A =

I

I T

I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch

Io: cường độ ánh sáng đơn sắc tới

T : đô truyền quang

Độ hấp thu A tỷ lệ với độ dài quang trình l cm của ánh sáng truyền qua dung dịch bề dày lớp dung dịch và nồng độ C mol l của dung dịch Sự phụ thuộc này được biểu thị b ng phương trình dưới đây Trong đó ε là độ hấp thu mol đặc trưng cho m i chất

A = ɛ.l.C Trong đó

Phần II: Tổng quan Chương 3: Phương pháp phân tích Glutaraldehyde

Glutaraldehyde được tạo phức với DNPH trước khi chạy HPLC

Do sử dụng lượng dư DNPH nên trong SK đồ của mẫu ngoài peak chính là phức Glu-DNPH còn có peak phụ của DNPH

Thực hiện đồng thời mẫu thử và chất chuẩn Butafosfan để có thể định tính và định lượng dựa trên nguyên tắc sau:

- Định tính: là dương tính khi trong SK đồ DD thử có peak có thời gian lưu 

thời gian lưu của peak trong SK đồ DD chuẩn

Cho ph p sai lệch 3,0 giá trị thời gian lưu

- Định lượng:

Lập dãy nồng độ chuẩn Glutaraldehyde từ chất chuẩn có hàm lượng xác định Ph p định lượng ch được chấp nhận khi hệ số tương quan tuyến tính ≥ 0,999 Vẽ đồ thị hàm số: Speak = a.CGlu + b

Chạy HPLC đối với DD mẫu thử Ghi nhận trị số diện tích peak tương ứng với peak trong SK đồ DD chuẩn

Sử dụng phương trình Speak = a.CBu b để tính nồng độ Glutaraldehyde có trong DD mẫu thử Từ đó suy ra hàm lượng Glutaraldehyde có trong mẫu thử

 Thực hiện:

- Chuẩn bị mẫu: 1ml dd Glu 10ml DNPH Ethanol vđ 100ml

( dd Glu = 1ml Glu + 100ml H2O)

- Chương trình HPLC cơ bản là:

Cột: 250-4,6 mm, loại RP-18 hạt 5m cột pha đảo

Pha động: 50p Acetonitril : 50 dd đệm acetate pH 5

Đầu dò: UV ở  = 365nm

Triển khai: Bơm đẳng dòng, tốc độ bơm: 0,5  1,0ml phút;

Thể tích tiêm: 20l

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

CHƯƠNG 4: THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH

4.1 GIỚI THIỆU

4.1.1 Mục đích

Thẩm định phương pháp phân tích là thực hiện các thí nghiệm để cung cấp

b ng chứng cho giá trị sử dụng của phương pháp phân tích Các kết quả của việc thẩm định là thông tin quí giá cho nhà phân tích xem x t, lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp với mục tiêu và năng lực của phòng thí nghiệm

Ví dụ: Trong mẫu thử có đồng thời các ion Ca2+ và Mg2+

chẳng hạn như nước cứng

- Phương pháp chuẩn độ phức chất chelate không thể xác định riêng lẻ nồng

độ của Ca2+ và Mg2+vì EDTA có thể tạo phức được với cả Ca2+ và Mg2+

- Phương pháp Sắc ký Ion có thể xác định chính xác từng ion Ca2+ và Mg2+

R = /RĐơn  RĐa/ ≤ 2U (3.2.1_1)

Có thể tính R b ng công thức đơn giản hơn:

R

R

R 

≤ 0,5% (3.2.1_2) R càng nhỏ thì p pháp phân tích có tính đặc hiệu càng cao

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

 Nếu R 2U hoặc R 0,5 thì phương pháp phân tích có tính đặc hiệu không bị nhiễu bởi các thành phần đã thêm vào

3 Dùng Pp mẫu trắng: Thêm lượng chất khảo sát vào mẫu trắng Dùng Pp phân tích tìm lại nồng độ của mẫu sau khi thêm Tính tốn giá trị chất khảo sát đã thêm vào

Trong đó:

XRecovery = Xsau  Xtrước

XTheory = lượng chất chuẩn thêm

4.2.3 Độ chụm (Precision)

a) Định nghĩa:

Độ chụm hay độ lặp lại diễn tả mức độ gần nhau của một dãy kết quả phân tích bởi cùng phương pháp

Độ chụm được biểu diễn bởi 2 giá trị sau:

 Độ lặp lại (repeatability : là độ lệch chuẩn của dãy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phương pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian liên tục

 Độ tái lập (reproducibility : là độ lệch chuẩn của dãy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phương pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian khơng liên tục cách nhau nhiều ngày

 Độ lệch chuẩn (SD - Standard Deviation):

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

c) Cách thực hiện:

Có thể xác định độ chụm theo trị số độ lệch chuẩn tương đối RSD Tìm b ng Excel theo cách sau:

 Tìm trị số trung bình mean : ở 1 ô trống muốn hiển thị mean, gỏ

=Average chọn dãy số cần tìm mean , enter 

 Tìm độ lệch chuẩn (Standard Deviation – SD): Ở 1 ô muốn hiển thị SD, gỏ

=STDEV chọn dãy số cần tìm , enter 

 Tìm độ lệch chuẩn tương đối & (RSD – Relative Standard Deviation): Ở 1 ô muốn hiển thị gỏ = “ô SD”*100 “ô mean” , enter

4.2.4 Độ tuyến tính (Linearity)

Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phương pháp Sự tương quan tuân theo phương trình bậc 1 Y = f C = ax b

Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính R R được tính b ng Excel R càng gần 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao

Ngoài ra cũng cần xem x t các giá trị a và b như sau:

a: hệ số góc thể hiện độ nhạy của phương pháp phân tích a càng lớn thì phương pháp càng nhạy

b: tung độ gốc thể hiện độ nhiễu của phương pháp phân tích b càng nhỏ thì phương pháp càng ít bị nhiễu

Hình 4.1: So sánh độ nhạy của phương pháp b ng đồ thị

Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích

4.2.5 Giới hạn phân tích (Limit of analysis) – Khoảng áp dụng (Range) 4.2.5.1 Giới hạn phân tích

Giới hạn phân tích gồm các giá trị sau:

a) Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection)

LOD là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được đảm bảo tính đặc hiệu

b) Giới hạn định lượng (LOQ - Limit of Quantitation)

LOQ là giá trị nồng độ giới hạn của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được đảm bảo độ đúng và độ chụm

LOQ được phân thành 2 loại:

 Giới hạn định lượng dưới – LLOQ (Low Limit of Quantitation)

LLOQ là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được

 Giới hạn định lượng trên - HLOQ (High Limit of Quantitation)

HLOQ là giá trị nồng độ lớn nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể xác định số lượng được

4.2.5.2 Khoảng áp dụng (Range)

Khoảng áp dụng là khoảng nồng độ chất khảo sát có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể áp dụng được đáp ứng các yêu cầu tính đặc hiệu, độ đúng, độ chụm …

 Đối với phương pháp phân tích định tính: khoảng áp dụng là từ LOD trở lên

 Đối với phương pháp phân tích định lượng: khoảng áp dụng là từ LLOQ đến HLOQ

Trong phạm vi luận văn này, các phương pháp xây dựng được thực hiện thẩm định với các nội dung:

- Tính đặc hiệu (độ chọn lọc)

- Độ đúng

- Độ chụm

CHƯƠNG 5: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM

 Thực hiện các thí nghiệm để thẩm định phương pháp đã xây dựng Gồm các thí nghiệm sau:

Thực hiện phương pháp dãy nồng độ Glutaraldehyde tăng dần

Vẽ đồ thị hàm số Y = a*x b với x: nồng độ Glutaraldehyde)

 Đánh giá, so sánh các phương pháp với nhau

5.2 PHƯƠNG TIỆN THỰC HIỆN

5.2.1 Hóa chất, thuốc thử

Xem phụ lục 1