Thực hiện 5 thí nghiệm nhƣ sau: TN 2.1: Khảo sát độ chọn lọc
a) Mục đích: Xác định một số chất gây nhiễu đối với phƣơng pháp.
Các chất gây nhiễu cĩ thể là: Formaldehyde; Acetaldehyde, Pentaldehyde.
b) Thực hiện: Sử dụng Pp đã xây dựng đƣợc để định lƣợng các mẫu. Do hạn chế về các chất gây nhiễu, ch thực hiện đối với chất gây nhiễu là Formaldehyde
Chuẩn bị mẫu đo: 2 mẫu nhƣ sau:
- Mẫu 1: Lấy 1ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 10 9ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml.
- Mẫu 2: Lấy 1ml DD Glu 0,04 1ml DD Formaldehyde 0,04 3ml DD phenol 10% + 8ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml.
Đo phổ: Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng. Qu t phổ từ 190 1100nm
c) Kết quả:
Bảng 6.5: Kết quả sự khảo sát độ chọn lọc của phức Glu-Phe
Mẫu 1 2
Độ hấp thu (Abs) 0,853
Khơng đo đƣợc (Bị kết tủa)
d) Nhận xét:
Mẫu 2 gây kết tủa cho thấy cĩ ảnh hƣởng đến Pp đã xây dựng.
TN 2.2: Độ lặp lại của phƣơng pháp quang phổ a) Mục đích: Xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD .
b) Thực hiện:
1 Chuẩn bị DD: Các DD nhƣ TN 1.3
2 Chuẩn bị mẫu đo: 6 mẫu hồn tồn giống nhau nhƣ sau:
Lấy 2ml DD Glu 0,04% + 3ml DD Phenol 10% + 37ml acid H2SO4đ + H2O vđ 50ml.
3 Đo phổ: Set-ref = 482nm; cell so sánh: mẫu trắng; đọc Abs tại max
c) Kết quả:
Bảng 6.6: Kết quả sự khảo sát độ lặp lại của phức Glu-Phe
Mẫu 1 2 3 4 5 6 Độ hấp thu (Abs) 1,683 1,702 1,691 1,689 1,699 1,709 Tính tốn: Abstb= 1,6955; SD; = …= …0,0095446 RSD (%) = *100% tb Abs SD = 0,562939% d) Nhận xét: RSD < 2%.
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
TN 2.3: Khảo sát độ đúng
a) Mục đích: Xác định hệ số trị tìm lại RC).
b) Thực hiện:
1 Chuẩn bị DD: Các DD nhƣ TN 1.3 2 Chuẩn bị mẫu đo: 3 mẫu nhƣ sau:
- Mẫu 1: Lấy 1ml DD Glu 0,04 3ml DD Phenol 10 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml.
- Mẫu 2: Lấy 1ml DD Glu 0,04 1ml DD Gluchuẩn 0,04% + 3ml DD Phenol 10% + 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml.
- Mẫu 3: Lấy 1ml DD Glu 0,04 2ml DD Gluchuẩn 0,04% + 3ml DD Phenol 10% + 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml.
3 Đo phổ: Set-ref = 482nm; cell so sánh: mẫu trắng; đọc Abs tại max
c) Kết quả:
Bảng 6.7: Kết quả sự khảo sát độ đúng của phức Glu-Phe
Mẫu 1 2 3
Lƣợng Glutaraldehyde ban đầu mg 39,4 39,4 39,4
Lƣợng Glutaraldehyde thêm vào mg 0 40 80
Độ hấp thu (Abs) 0,854 1,681 2,519 d) Nhận xét:
Lƣợng Glutaraldehyde tìm lại tính theo Abs: Mẫu 2: R2 = 1 1 2 )*39,4 ( Abs Abs Abs = 854 , 0 4 , 39 * ) 854 , 0 681 , 1 ( = 38,15mg Mẫu 3: R3 = 1 1)*39,4 3 ( Abs Abs Abs = 854 , 0 4 , 39 * ) 854 , 0 519 , 2 ( = 76,81mg Hệ số tìm lại RC): Rc (%) = Recov *100 Thẻoy ery X X R (%) = 38,15 95,37% R (%) = 76,81 96,01%
TN 2.4: Khảo sát khoảng tuyến tính
a) Mục đích: Xác định hệ số tƣơng quan tuyến tính R ; hàm số tƣơng quan tuyến tính Abs = a*CGlu + b.
b) Thực hiện:
Tính tốn theo kết quả của TN 1.7. Sử dụng Ms-Excel để tính các hàm số Abs = a*CGlu b và hệ số R ứng với các khoảng nồng độ Glutaraldehyde.
c) Kết quả:
Bảng 6.8: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phức Glu-Phe
Khoảng nồng độ Glutaraldehyde (mol/L)
Hàm số Abs = a*CGlu + b
Hệ số tƣơng quan tuyến tính (R) 0 > 16.10-5 0,1874x + 0,0926 0,9983 0 > 12.10-5 0,1981x + 0,0554 0,9996 0 > 8.10-5 0,1983x + 0,055 0,9991 0 > 4.10-5 0,1873x + 0,0722 0,9982 2.10-5> 16.10-5 0,187x + 0,0982 0,9975 2.10-5> 12.10-5 0,2014x + 0,0269 0,9999 2.10-5> 8.10-5 0,2058x + 0,01 1,0000 4.10-5> 16.10-5 0,1819x + 0,162 0,9967 4.10-5> 12.10-5 0,1998x + 0,0427 0,9998 8.10-5> 16.10-5 0,168x + 0,3467 0,9960 d) Nhận xét:
Trong khoảng nồng độ Glu 2 > 12).10-5 mol L cĩ hệ số R ≥ 0,999 là đạt yêu cầu. Hàm số tƣơng quan tuyến tính là: Abs = 0,2014*CGlu + 0,0269
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
TN 2.5: Xác định LOD; LOQ và khoảng làm việc
a) Mục đích: Xác định giá trị LOD; LOQ; khoảng làm việc.
b) Thực hiện: Thực hiện nhƣ trình bày ở chƣơng 2.
LOQ đƣợc khảo sát LLOQ và HLOQ để xác định khoảng làm việc.
Đối với LOD:
- Pha và đo mẫu trắng 6 lần : cĩ đƣợc kết quả đo là Abs1 6 - Tính giá trị trung bình của
__
Absvà độ lệch chuẩn SD của 6 kết quả
- Tìm trên đồ thị Abs = a.CGlu b, nồng độ CGlu tƣơng ứng với giá trị AbsLOD =
__
Abs 3 * SD . Nồng độ CGlu đĩ là LOD
c) Kết quả:
Bảng 6.9: Kết quả sự khảo sát độ lặp lại của mẫu trắng
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Độ hấp thu
(Abs) 0,085 0,089 0,091 0,087 0,090 0,086
Độ hấp thu trung bình: Abstb = 0,088
Độ lệch chuẩn SD - Standard Deviation):
SD = 0,0023664
Giá trị AbsLOD =
__
Abs + (3*SD) = 0,088 + (3*0,0023664) = 0,0951
Dị trên đồ thị Sự phụ thuộc của Abs theo nồng độ CGlu TN 1.7 . Trị số CGlu tƣơng ứng với giá trị AbsLOD = 0,0951 là 0,45178.10-5
mol/L.
Vậy LOD = 0,45178.10-5 mol/L hay 0,45mg/L Glutaraldehyde
- Dị trên đồ thị Sự phụ thuộc của Abs theo nồng độ CGlu (TN 1.7). Trị số CGlu(LLOQ) t ứng với AbsLLOQ = 0,111664 là 0,53047.10-5
mol/L.
Trong khoảng nồng độ Glutaraldehyde 0,53047 > 12).10-5 mol L cĩ hệ số R = 0,9999 là đạt yêu cầu. LLOQ = 0,53047.10-5
mol/L 0,53mg/L
Hình 6.9: LLOQ của Glutaraldehyde trong pp Quang phổ
Tức là: LLOQ = 0,53047.10-5 mol/L 0,53mg/L Glutaraldehyde
HLOQ = 12.10-5 mol/L hay 12mg/L Glutaraldehyde
Khoảng làm việc:
Là khoảng nồng độ Glutaraldehyde n m trong khoảng LLOQ HLOQ. Tức là: từ 0,53047.10-5 12.10-5 mol/L Glutaraldehyde.
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
6.3 THÍ NGHIỆM VỀ ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP
Thực hiện 2 thí nghiệm nhƣ sau:
TN 3.1: Định lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu Protectol GA 50
Định lƣợng mẫu nguyên liệu Protectol GA 50 cĩ 50% Glutaraldehyde của BASF Chemical Co – Đức số lơ 09339756PO b ng các Pp quang phổ và chuẩn độ. Hàm lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu này trong khoảng 47,0 53,0%.
TN 3.1.1: Pp Quang phổ a) Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch :
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất .
- DD Glu chuẩn: Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 97,5 w v ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. DD cĩ nồng độ 390mg l
Chuẩn bị mẫu:
- DD mẫu thử: 3 mẫu của cùng lơ hàng.
Lấy m1>3 mg mẫu thử Ethanol vđ 100ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. Lấy 1ml 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
- DD đ c: Lấy 1ml DD Glu chuẩn 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml. DD đ c cĩ nồng độ 7,8mg l
Đo phổ: Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng. Qu t phổ từ 190 1100nm
Đọc kết quả: So sánh Abs tại max của DD thử với DD đ c để suy ra hàm lƣợng Glutaraldehyde cĩ trong mẫu thử.
b) Kết quả:
Hình 6.10:Kết quả khảo sát mẫu 1 nguyên liệu
Bảng 6.10: Kết quả định lƣợng Glu b ng phƣơng pháp quang phổ
Mẫu 1 2 3 DD đ c Lƣợng cân mẫu m1>3) (mg) 1514,2 2 523,6 3 517,6 Nơng độ Glu mg l / / / 7,8 Độ hấp thu Abs 0,608 1,015 1,414 1,597 Hàm lƣợng Glu (%) 49,02 49,11 49,08
Cơng thức tính Glu trong mẫu thử=
1000 * * % 100 * 50 * 50 * 100 * * ) 3 1 _( / / _ d c thu Glu c d Glu DD m Abs C Abs thu
Hàm lƣợng trung bình của Glutaraldehyde trong mẫu thử = 49,07%
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
TN 3.1.2: Pp chuẩn độ
Theo British Pharmacopoeia 2007
Lấy chính xác 2g mẫu thử hịa tan vào 100ml dd hydroxylamine hydrochloride 7 . DD này trƣớc đƣợc trung hịa b ng dd NaOH 1M với ch thị bromophenol blue. Để yên 30 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa cĩ phân đoạn sơi 40 – 600C . Chuẩn độ b ng dd NaOH 1M đến khi màu của lớp nƣớc tƣơng đƣơng với màu của dd hydroxylamine hydrochloride 7 đã trung hịa trƣớc đĩ.
Each ml of 1M sodium hydroxide VS is equivalent to 50.05 mg of C5H8O2.
Theo PTN Vemedim
Lấy chính xác 800mg mẫu thử hịa tan vào 100ml dd hydroxylamine hydrochloride 7 . DD này trƣớc đƣợc trung hịa b ng dd NaOH 1M với ch thị bromophenol blue. Để yên 30 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa cĩ phân đoạn sơi 40 – 600C . Chuẩn độ b ng dd NaOH 1M đến khi màu của lớp nƣớc tƣơng đƣơng với màu của dd hydroxylamine hydrochloride 7 đã trung hịa trƣớc đĩ.
1ml dd NaOH 1M 50,05mg Glutaraldehyde b) Thực hiện:
Chuẩn độ 3 mẫu theo Pp nhƣ trên.
c) Kết quả:
Bảng 6.11: Kết quả định lƣợng nguyên liệu b ng phƣơng pháp chuẩn độ
Mẫu 1 2 3
Lƣợng cân mẫu (m1>3) (mg) 601,8 806,4 907.5
Thể tích dd NaOH 1M đã chuẩn độ ml 5,9 7,9 8,9
Hàm lƣợng Glutaraldehyde (%) 49,07 49,03 49,08
Cơng thức tính Glu trong mẫu thử =
) 3 1 _( % 100 * 05 , 50 * 1 _ thu DD m V M NaOH
TN 3.2: Định lƣợng Glutaraldehyde trong thành phẩm
Định lƣợng mẫu thuốc thú y Vime-Protex của Cơng ty Vemedim b ng các Pp quang phổ và chuẩn độ.
Chai 1000ml, số lơ: 04-020412
Hàm lƣợng Glutaraldehyde trong chế phẩm này 20g/100ml.
THÀNH PHẦN: Trong 1 000ml cĩ: - Glutaraldehyde … 200g - Alkyldimethylbenzylammonium chloride … 152g - Tá dƣợc vừa đủ 1 000ml CƠNG DỤNG:
VIME-PROTEX là dung dịch thuốc sát trùng phổ rộng, tiêu diệt vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh cho gia súc , gia cầm
- Vi khuẩn :E. coli, Salmonella, Pasteurella, mycoplasma, Pseudomonas, ,....
- Virus : Bệnh cúm influenza , Lở mồm long mĩng F.M.D , Gumboro, Dịch tả , Bệnh dại, ...
* Dùng sát trùng :
- Trại chăn nuơi trâu bị, heo, gà, vịt - Dụng cụ chuyên chở gia súc, lị giết mổ
- Tẩy trùng thiết bị, dụng cụ dùng trong chăn nuơi
CÁCH DÙNG:
- Liều chung : 1lít pha với 200-500 lít nƣớc Chai 250ml pha với 50 - 125 lít nƣớc
- Sát trùng trại chăn nuơi : 1:200, phun sƣơng khắp trại hay phƣơng tiện chuyên chở.
- Tẩy trùng thiết bị : 1:500, ngâm dụng cụ.
Làm sạch dụng cụ, sau đĩ dùng thuốc đã pha lỗng phun, xịt hoặc ngâm dụng cụ. Hình 6.11: Thành phẩm Vime-
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
TN 3.2.1: Pp Quang phổ a) Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch :
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất .
- DD Glu chuẩn: Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 97,5 w v ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. DD cĩ nồng độ 390mg l
Chuẩn bị mẫu:
- DD thử: Lấy chính xác 5ml mẫu thử Ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. Lấy 1ml 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
- DD đ c: Lấy 1ml DD Glu chuẩn 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
DD đ c cĩ nồng độ 7,8mg l
Đo phổ: Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng. Qu t phổ từ 190 1100nm
Đọc kết quả: So sánh Abs tại max của DD thử với DD đ c để suy ra hàm lƣợng Glutaraldehyde cĩ trong mẫu thử.
Bảng 6.12: Kết quả định lƣợng thành phẩm b ng phƣơng pháp quang phổ Mẫu 1 2 3 DD đ c Lƣợng mẫu m1>3) (ml) 5 5 5 Nơng độ Glu mg l / / / 7,8 Độ hấp thu Abs 1,607 1,606 1,608 1,597 Hàm lƣợng Glu (g/L) 196,24 196,09 196,34
Cơng thức tính Glu g L trong mẫu thử:
1000 * 5 * 50 * 50 * 50 * * / / _ c d Glu c d Glu DD Abs C Abs thu
Hàm lƣợng trung bình của Glutaraldehyde trong mẫu thử = 196,19g/L
TN 3.2.2: Pp chuẩn độ
Thực hiện theo PTN Vemedim Tiêu chuẩn cơ sở TC-QA-02-152XK)
Lấy chính xác 800mg mẫu thử hịa tan vào 100ml dd hydro ylamine hydrochloride 7 . ( này trước đư c trung hịa b ng dd NaOH M với ch thị bromophenol blue. Để yên 30 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa cĩ phân đoạn sơi 40 – 600C . Chuẩn độ b ng dd NaOH 1M đến khi màu của lớp nƣớc tƣơng đƣơng với màu của dd hydroxylamine hydrochloride 7% đã trung hịa trƣớc đĩ.
1ml dd NaOH 1M 50,05mg Glutaraldehyde a) Thực hiện:
Chuẩn độ 3 mẫu theo Pp nhƣ trên.
b) Kết quả:
Bảng 6.13: Kết quả định lƣợng thành phẩm b ng phƣơng pháp chuẩn độ
Mẫu 1 2 3 Lƣợng mẫu m1>3) (ml) 3 4 5 Thể tích dd NaOH 1M đã chuẩn độ ml 11,8 15,7 19,6 Hàm lƣợng Glutaraldehyde (g/L) 196,86 196,44 196,19
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
Cơng thức tính Glu trong mẫu thử: *1000
1000 * 05 . 50 * ) 3 1 _( 1 _ thu DD V V M NaOH
Hàm lƣợng trung bình của Glutaraldehyde trong mẫu thử = 196,49%
Bảng so sánh kết quả định lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu thành phẩm b ng 2 Pp: Quang phổ Chuẩn độ
Bảng 6.14: So sánh kết quả của 2 phƣơng pháp trên nguyên liệu và thành phẩm
Hàm lƣợng Glutaraldehyde Lý thuyết Quang phổ Chuẩn độ
Nguyên liệu Protectol GA 50 50% 49,07% 49,06%
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
A. KẾT LUẬN
Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, luận văn đã đạt đƣợc những kết quả sau:
1/ Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu và trong thành phẩm b ng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis.
Pp cĩ thực hiện tƣơng đối đơn giản, hĩa chất dễ tìm, thời gian nhanh và cĩ giá trị thực tiễn cao.
Đáp ứng đƣợc yêu cầu: Đối với nguyên liệu cĩ sai số 5,0 Đối với thành phẩm cĩ sai số 10
2/ Nội dung phƣơng pháp đã xây dựng
Chuẩn bị dung dịch :
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất .
- DD đ c Glu 0,04 : Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 100 ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 với cùng dung mơi. 400mg L
Chuẩn bị mẫu:
Dự đốn sơ bộ hàm lƣợng Glutaraldehyde trong mẫu thử để pha loảng mẫu sao cho dd mẫu thử cĩ nồng độ 400mg/L.
Lấy 1ml DD mẫu thử 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Đo phổ:
Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng. Qu t phổ từ 190 1100nm
Đọc kết quả:
So sánh Abs tại max của DD thử với DD đ c để suy ra hàm lƣợng Glutaraldehyde cĩ trong mẫu thử.
Phần IV: Kết Luận
3/ Đặc điểm của các phƣơng pháp:
Độ chọn lọc:
Trung bình. Pp ch thực hiện đƣợc trên những mẫu ch cĩ
Glutaraldehyde hay ch cĩ các chất khơng tham gia phản ứng với h n hợp Phenol + acid H2SO4đđ.
Độ lặp lại: Rất cao. RSD = 0,562939%
Độ đúng: đạt yêu cầu. Hệ số tìm lại: RC = 95,37%
Độ tuyến tính: rất cao.
Hệ số tƣơng quan tuyến tính: R= 0,9999 ;
Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính: Abs = 0,2014*CGlu + 0,0269
(CGlu : nồng độ Glutaraldehyde tính theo mol l