Nguyên tắc:
Glutaraldehyde đƣợc tạo phức với DNPH trƣớc khi chạy HPLC
Do sử dụng lƣợng dƣ DNPH nên trong SK đồ của mẫu ngồi peak chính là phức Glu-DNPH cịn cĩ peak phụ của DNPH.
Thực hiện đồng thời mẫu thử và chất chuẩn Butafosfan để cĩ thể định tính và định lƣợng dựa trên nguyên tắc sau:
- Định tính: là dƣơng tính khi trong SK đồ DD thử cĩ peak cĩ thời gian lƣu thời gian lƣu của peak trong SK đồ DD chuẩn.
Cho ph p sai lệch 3,0 giá trị thời gian lƣu - Định lƣợng:
Lập dãy nồng độ chuẩn Glutaraldehyde từ chất chuẩn cĩ hàm lƣợng xác định. Ph p định lƣợng ch đƣợc chấp nhận khi hệ số tƣơng quan tuyến tính ≥ 0,999 . Vẽ đồ thị hàm số: Speak = a.CGlu + b
Chạy HPLC đối với DD mẫu thử. Ghi nhận trị số diện tích peak tƣơng ứng với peak trong SK đồ DD chuẩn.
Sử dụng phƣơng trình Speak = a.CBu b để tính nồng độ Glutaraldehyde cĩ trong DD mẫu thử. Từ đĩ suy ra hàm lƣợng Glutaraldehyde cĩ trong mẫu thử.
Thực hiện:
- Chuẩn bị mẫu: 1ml dd Glu 10ml DNPH Ethanol vđ 100ml. ( dd Glu = 1ml Glu + 100ml H2O)
- Chƣơng trình HPLC cơ bản là:
Cột: 250-4,6 mm, loại RP-18 hạt 5m cột pha đảo Pha động: 50p Acetonitril : 50 dd đệm acetate pH 5 Đầu dị: UV ở = 365nm.
Triển khai: Bơm đẳng dịng, tốc độ bơm: 0,5 1,0ml phút; Thể tích tiêm: 20l.
Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích
CHƢƠNG 4: THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
4.1 GIỚI THIỆU
4.1.1 Mục đích
Thẩm định phƣơng pháp phân tích là thực hiện các thí nghiệm để cung cấp b ng chứng cho giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích. Các kết quả của việc thẩm định là thơng tin quí giá cho nhà phân tích xem x t, lựa chọn phƣơng pháp phân tích phù hợp với mục tiêu và năng lực của phịng thí nghiệm.
4.1.2 Nội dung
Tổng quát, thẩm định phƣơng pháp phân tích cần khảo sát các nội dung nhƣ sau: - Tính đặc hiệu độ chọn lọc
- Độ đúng - Độ chụm - Độ tuyến tính
- Giới hạn phân tích Khoảng áp dụng - Độ bền vững
Tùy theo đối tƣợng áp dụng của phƣơng pháp phân tích mà nội dung thẩm định cĩ khác nhau.
Ghi chú: * : Bắt buộc thẩm định
Nội dung thẩm định Phân tích định tính Hĩa học Phân tích định lƣợng Độc chất
Tính đặc hiệu * * * Độ đúng * * Độ chụm 0 * * Độ tuyến tính 0 * * Giới hạn phân tích Khoảng áp dụng * (LOD) * * Độ bền vững *
4.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
4.2.1 Tính đặc hiệu (Specificity)
a) Định nghĩa:
Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc của phƣơng pháp phân tích là khả năng xác định chính xác thành phần chất khảo sát trong sự hiện diện của các thành phần khác cĩ trong mẫu thử.
Ví dụ: Trong mẫu thử cĩ đồng thời các ion Ca2+ và Mg2+
chẳng hạn nhƣ nƣớc cứng
- Phƣơng pháp chuẩn độ phức chất chelate khơng thể xác định riêng lẻ nồng độ của Ca2+ và Mg2+vì EDTA cĩ thể tạo phức đƣợc với cả Ca2+ và Mg2+
- Phƣơng pháp Sắc ký Ion cĩ thể xác định chính xác từng ion Ca2+ và Mg2+ .
Nhƣ vậy phƣơng pháp sắc ký ion cĩ tính đặc hiệu hơn phƣơng pháp chuẩn độ phức chất.
Tính đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích thƣờng là yếu tố quyết định đối tƣợng áp dụng của phƣơng pháp.
b) Yêu cầu:
Sự khác biệt giữa giá trị tìm lại của thành phần khảo sát ở mẫu đơn ch cĩ chất khảo sát và mẫu đa thành phần phải nhỏ hơn 2 lần độ khơng đảm bảo đo U của kết quả đo mẫu đơn. Tức là:
R = /RĐơn RĐa/ ≤ 2U. (3.2.1_1) Cĩ thể tính R b ng cơng thức đơn giản hơn:
Don R R = / /*100% Don Da Don R R R ≤ 0,5%. (3.2.1_2)
R càng nhỏ thì p pháp phân tích cĩ tính đặc hiệu càng cao.
c) Cách thực hiện:
Pha dung dịch chuẩn của chất khảo sát. Thực hiện phƣơng pháp phân tích để cĩ trị số RĐơn. Thực hiện ít nhất 6 lần để tính U.
Pha dung dịch đa thành phần, gồm chất khảo sát cùng nồng độ với dung dịch chuẩn và các chất cĩ khả năng gây nhiễu. Thực hiện phƣơng pháp phân tích để cĩ trị số R
Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích
Nếu R 2U hoặc R 0,5 thì phƣơng pháp phân tích cĩ tính đặc hiệu khơng bị nhiễu bởi các thành phần đã thêm vào .
4.2.2 Độ đúng (Accuracy; Trueness)
a) Định nghĩa:
Độ đúng là độ gần của kết quả phân tích của phƣơng pháp đối với giá trị thực hoặc giá trị lý thuyết của mẫu.
Độ đúng thƣờng đƣợc biểu diễn qua giá trị tìm lại nhƣ sau:
Rc (%) = Recov *100 Thẻoy ery X X Rc càng lớn thì phƣơng pháp cĩ độ đúng càng cao b) Yêu cầu:
Tùy theo nồng độ của chất khảo sát cĩ trong mẫu mà RC phải n m trong các khoảng sau:
Theo Cục Nơng dƣợc và thuốc thú y Australia
Nồng độä C (%) Rc (%) C 10,0 98,0 102,0 1,0 C < 10,0 90,0 110,0 0,1 C < 1,0 80,0 120,0 C < 0,1 75,0 125,0 c) Cách thực hiện: Cĩ thể xác định RC theo các cách sau:
1 Dùng Pp phân tích để tìm lại nồng độ của chất khảo sát trong dung dịch cĩ nồng độ đã biết trƣớc.
3 Dùng Pp mẫu trắng: Thêm lƣợng chất khảo sát vào mẫu trắng. Dùng Pp phân tích tìm lại nồng độ của mẫu sau khi thêm. Tính tốn giá trị chất khảo sát đã thêm vào.
Trong đó:
XRecovery = Xsau Xtrước
XTheory = lượng chất chuẩn thêm
4.2.3 Độ chụm (Precision)
a) Định nghĩa:
Độ chụm hay độ lặp lại diễn tả mức độ gần nhau của một dãy kết quả phân tích bởi cùng phƣơng pháp.
Độ chụm đƣợc biểu diễn bởi 2 giá trị sau:
Độ lặp lại (repeatability : là độ lệch chuẩn của dãy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phƣơng pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian liên tục.
Độ tái lập (reproducibility : là độ lệch chuẩn của dãy kết quả đo của cùng một mẫu trong cùng điều kiện của phƣơng pháp phân tích thực hiện trong khoảng thời gian khơng liên tục cách nhau nhiều ngày .
Độ lệch chuẩn (SD - Standard Deviation):
SD đƣợc tính b ng cơng thức: SD
b) Yêu cầu:
RSD càng nhỏ thì Pp phân tích càng đƣợc tin cậy. Tùy theo nồng độ của chất khảo sát cĩ trong mẫu mà RSD phải n m trong các khoảng sau:
Theo Cục Nơng dƣợc và thuốc thú y Australia
Nồng độ C(%) RSD(%) C 10,0 2,0 1,0 C < 10,0 5,0 0,1 C < 1,0 10,0 Rc (%) = Recov *100 Thẻoy ery X X
Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích
c) Cách thực hiện:
Cĩ thể xác định độ chụm theo trị số độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD . Tìm b ng Excel theo cách sau:
Tìm trị số trung bình mean : ở 1 ơ trống muốn hiển thị mean, gỏ =Average chọn dãy số cần tìm mean , enter
Tìm độ lệch chuẩn (Standard Deviation – SD): Ở 1 ơ muốn hiển thị SD, gỏ =STDEV chọn dãy số cần tìm , enter .
Tìm độ lệch chuẩn tƣơng đối & (RSD – Relative Standard Deviation): Ở 1 ơ muốn hiển thị gỏ = “ơ SD”*100 “ơ mean” , enter.
4.2.4 Độ tuyến tính (Linearity)
Độ tuyến tính diễn tả sự tƣơng quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phƣơng pháp. Sự tƣơng quan tuân theo phƣơng trình bậc 1. Y = f C = ax b
Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tƣơng quan tuyến tính R . R đƣợc tính b ng Excel. R càng gần 1 thì phƣơng pháp thử cĩ độ tuyến tính càng cao.
Ngồi ra cũng cần xem x t các giá trị a và b nhƣ sau:
a: hệ số gĩc thể hiện độ nhạy của phƣơng pháp phân tích. a càng lớn thì phƣơng pháp càng nhạy.
b: tung độ gốc thể hiện độ nhiễu của phƣơng pháp phân tích. b càng nhỏ thì phƣơng pháp càng ít bị nhiễu.
Hình 4.1: So sánh độ nhạy của phƣơng pháp b ng đồ thị Pp 1 cĩ đồ thị dốc hơn đồ thị của Pp 2 a1 > a2) ==> Pp (1) cĩ độ nhạy lớn hơn Pp (2) Phƣơng pháp (1) Phƣơng pháp (2) Cùng giá trị S Giá trị nồng độ nhỏ ==> Pp nhạy hơn Giá trị nồng độ lớn hơn ==> Pp k m nhạy hơn
Phần II: Tổng quan Chương 4: Thẩm định phương pháp phân tích
4.2.5 Giới hạn phân tích (Limit of analysis) – Khoảng áp dụng (Range) 4.2.5.1 Giới hạn phân tích
Giới hạn phân tích gồm các giá trị sau:
a) Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection)
LOD là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phƣơng pháp phân tích cĩ thể phát hiện đƣợc đảm bảo tính đặc hiệu
b) Giới hạn định lƣợng (LOQ - Limit of Quantitation)
LOQ là giá trị nồng độ giới hạn của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phƣơng pháp phân tích cĩ thể xác định số lƣợng đƣợc đảm bảo độ đúng và độ chụm
LOQ đƣợc phân thành 2 loại:
Giới hạn định lƣợng dƣới – LLOQ (Low Limit of Quantitation)
LLOQ là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phƣơng pháp phân tích cĩ thể xác định số lƣợng đƣợc.
Giới hạn định lƣợng trên - HLOQ (High Limit of Quantitation)
HLOQ là giá trị nồng độ lớn nhất của chất khảo sát chứa trong mẫu mà phƣơng pháp phân tích cĩ thể xác định số lƣợng đƣợc.
4.2.5.2 Khoảng áp dụng (Range)
Khoảng áp dụng là khoảng nồng độ chất khảo sát cĩ trong mẫu mà phƣơng pháp phân tích cĩ thể áp dụng đƣợc đáp ứng các yêu cầu tính đặc hiệu, độ đúng, độ chụm … .
Đối với phƣơng pháp phân tích định tính: khoảng áp dụng là từ LOD trở lên
Đối với phƣơng pháp phân tích định lƣợng: khoảng áp dụng là từ LLOQ đến HLOQ
Trong phạm vi luận văn này, các phƣơng pháp xây dựng đƣợc thực hiện thẩm định với các nội dung:
- Tính đặc hiệu (độ chọn lọc) - Độ đúng
CHƢƠNG 5: HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM
5.1 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Nguyên tắc:
Dựa vào các nguyên tắc lý thuyết đã nêu trong các chƣơng 1 và 2 để hoạch định thí nghiệm.
Tiến hành:
Khảo sát các thơng số, chọn giá trị tối ƣu để xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Glutaraldehyde trên cơ sở một quá trình cơ bản đƣợc lập ra từ lý thuyết và tài liệu tham khảo.
Thực hiện các thí nghiệm để thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng. Gồm các thí nghiệm sau:
1/ Độ chọn lọc
Sử dụng acid Phosphoric H3PO4 và Diethylamin [NH C2H5)2] làm chất gây nhiễu.
2/ Độ lặp lại
Thực hiện 6 lần TN của phƣơng pháp đã xây dựng đối với một mẫu thử.
3/ Độ đúng
Thực hiện phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu đã định lƣợng, dùng phƣơng pháp đã xây dựng để tìm lại lƣợng thêm vào.
4/ Độ tuyến tính
Thực hiện phƣơng pháp dãy nồng độ Glutaraldehyde tăng dần.
Vẽ đồ thị hàm số Y = a*x b với x: nồng độ Glutaraldehyde). Đánh giá, so sánh các phƣơng pháp với nhau.
5.2 PHƢƠNG TIỆN THỰC HIỆN
5.2.1 Hĩa chất, thuốc thử
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
5.3 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM
5.3.1 Thí nghiệm về phƣơng pháp quang phổ
TN 1.1: Khảo sát độ hấp thu của Phenol, Glutaraldehyde , acid H2SO4 và ethanol theo bƣớc sĩng ()
a) Mục đích:
- Xác định phổ hấp thu của Phenol, Glutaraldehyde,dung mơi acid H2SO4 đđ và ethanol
- Xác định sự ảnh hƣởng của dung mơi acid H2SO4 đđ và lƣợng dƣ Phenol đối với phức Glutaraldehyde – Phenol (Glu-Phe).
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ UV-Vis qu t bƣớc sĩng viết tắt: Quét phổ từ 190 1100nm, cell trắng là cốc rổng đối với 4 mẫu sau:
- Mẫu 1: dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - Mẫu 2: dd acid sulfuric: 7ml acid H2SO4đđ pha trong H2O vđ 10ml - Mẫu 3: Ethanol nguyên chất .
- Mẫu 4: dd Glutaraldehyde 0,1 pha trong ethanol
2- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng: cốc rổng đối với 4 mẫu trên.
TN 1.2: Khảo sát Abs theo của mẫu trắng a) Mục đích:
-Xác định phổ hấp thu các thành phần tạo phức nhƣng khơng cĩ Glutaraldehyde.
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ UV-Vis qu t bƣớc sĩng viết tắt: Quét phổ từ 190 1100nm, cell trắng là cốc rổng đối với 1 mẫu sau:
- Mẫu 5 : 5ml DD phenol 10% + 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml. 2- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell so sánh: là cốc rổng.
TN 1.3: Khảo sát Abs của phức Glutaraldehyde – Phenol (Glu-Phe) theo
a) Mục đích:
- Xác định phổ hấp thu của phức Glu – Phe trong Acid H2SO4 - Xác định giá trị bƣớc sĩng hấp thu cực đại max)
b) Nội dung:
1- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng là 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đối với 1 mẫu:
- Mẫu 6: 1ml Glutaraldehyde 5ml DD phenol 10 10ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
2- Dùng phần mềm của máy để xác định max trong phổ đồ mẫu 6.
TN 1.4: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid H2SO4 a) Mục đích:
- Xác định nồng độ acid H2SO4 tối ƣu cho sự tạo phức
- Đo phổ (tại max đối với các hổn hợp cĩ nồng độ acid H2SO4 thay đổi.
b) Nội dung:
1- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng là 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đối với 10 mẫu:
Mẫu 7: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 16 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml.
Mẫu 8: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 14 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 9: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 12 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 10: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 10 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 11: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 9 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
Mẫu 13: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 7 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 14: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 6 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 15: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 4 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 16: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 2 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
2- Dùng Excel để vẽ đồ thị hàm số viết tắt: Vẽ đồ thị Abs = f x với x là H2SO4 trong 10 mẫu trên.
TN 1.5: Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng dƣ phenol a) Mục đích:
- Xác định ảnh hƣởng của lƣợng dƣ Phenol đối với độ hấp thu Abs của phức Glu – Phe
- Xác định tỷ lệ thành phần của phức Glutaldehyde – Phenol. Theo lý thuyết phức Glutaraldehyde – Phenol cĩ tỷ lệ 2:1.
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ set-ref = 482nm, cell trắng: 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đo Abs tại max viết tắt: đo phổ đối với 10 mẫu:
Mẫu 17: 2 ml DD Glu 0,04 1ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 18: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 19: 2 ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 1% + 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 20 : 2 ml DD Glu 0,04 4ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 22: 2 ml DD Glu 0,04 1ml DD phenol 10% + 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 23: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 24: 2 ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 25: 2 ml DD Glu 0,04 4ml DD phenol 10% 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 26: 2 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric