Nghiên cứu quy trình chiết xuất và định lượng protein toàn phần của cao địa long khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ HÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỒN PHẦN CỦA CAO ĐỊA LONG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ HÀ PHƯƠNG Mã sinh viên: 1801555 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN CỦA CAO ĐỊA LONG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa DS Trần Ngọc Ánh Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ em hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người cô đáng kính em: TS Hồng Quỳnh Hoa – Giảng viên Bộ môn Thực Vật – Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội Cô tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận, đưa dẫn tận tâm, hữu ích, kịp thời đầy tính khoa học, giúp em vượt qua bước khó khăn, khúc mắc trình thực đề tài Em xin cảm ơn DS Trần Ngọc Ánh, ThS Phạm Thị Linh Giang toàn thể thầy giáo, cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực Vật – Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội vơ nhiệt tình gúp đỡ em thời gian em làm khóa luận Bộ mơn Nhân đây, em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường tồn thể thầy Trường Đại học Dược Hà Nội tham gia đào tạo, trang bị kiến thức cho em giúp đỡ em suốt thời gian em học tập trường Bên cạnh em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô Bộ môn Dược học cổ truyền Bộ mơn Hóa sinh tạo điều kiện mặt thiết bị thí nghiệm để em hồn thành khóa luận cách tốt Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người cổ vũ, động viên em sống trình học tập hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô giáo sức khỏe dồi để gặt hái nhiều thành công nghiệp, cống hiến cho khoa học cơng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, đưa Y tế Việt Nam nói chung ngành Dược Việt Nam nói riêng đạt đến đỉnh cao giới Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Phương Ngô Hà Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu Địa long 1.1.1 Vị trí phân lồi phân bố Pheretima sp 1.1.2 Vị thuốc Địa long 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.2 Phương pháp định lượng protein toàn phần phương pháp Kjeldahl 1.2.1 Nguyên tắc phương pháp Kjeldahl 1.2.2 Tiến hành 10 1.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 12 1.3.1 Phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) 12 1.3.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 12 1.4 Phương pháp chiết xuất 15 1.4.1 Các phương pháp chiết xuất địa long nghiên cứu trước 15 1.4.2 Phương pháp bào chế cao tổng quát 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu thiết bị 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Hóa chất thiết bị phần mềm 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng thẩm định độ lặp lại phương pháp định lượng protein toàn phần Địa long phương pháp Kjeldahl 19 2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long 19 2.2.3 Nội dung 3: Xây dựng quy trình chiết xuất cao hoàn chỉnh 19 2.2.4 Nội dung 4: Định lượng protein toàn phần cao Địa long bào chế phương pháp tối ưu hóa 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Dự kiến quy trình chiết xuất 19 2.3.2 Định lượng protein toàn phần phương pháp Kjeldahl 20 2.3.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long 22 2.3.4 Phương pháp khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất 23 2.3.5 Phương pháp định tính cao Địa long 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Xây dựng thẩm định độ lặp lại phương pháp định lượng protein toàn phần Địa long phương pháp Kjeldahl 26 3.1.1 Quy trình định lượng 26 3.1.2 Thẩm định độ lặp lại phương pháp 27 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất 28 3.2.1 Khảo sát kích thước 28 3.2.2 Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi 29 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất 29 3.2.4 Khảo sát số lần chiết 30 3.3 Phương pháp khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất 32 3.3.1 Kết thực nghiệm 33 3.3.2 Kết tối ưu hóa q trình chiết xuất 33 3.3.3 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào 35 3.4 Kết điều chế cao đặc Địa long theo phương pháp tối ưu 36 3.4.1 Quy trình điều chế cao đặc Địa long 36 3.4.2 Kết định tính 37 3.4.3 Kết định lượng 39 3.5 Bàn luận 40 3.5.1 Về đối tượng nghiên cứu 40 3.5.2 Về quy trình chiết xuất 41 3.5.3 Về phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long 42 3.5.4 Về kết xây dựng q trình định lượng protein tồn phần phương pháp Kjeldahl 43 3.5.5 Về kết thực nghiệm pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long 43 3.5.6 Về kết trình chiết xuất cao Địa long theo điều kiện tối ưu hóa mơ hình bề mặt đáp ứng RSM 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT RSM Response surface methodology Bề mặt đáp ứng OFAT One factor at a time Khảo sát yếu tố sp species Loài DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết khảo sát thông số cho phương pháp định lượng protein toàn phần Địa long 26 Bảng 3.2: Kết định lượng protein toàn phần mẫu thử dược liệu Địa long 27 Bảng 3.3: Hàm lượng protein dịch chiết lần chiết 31 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 33 Bảng 3.5: Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình biểu diễn phụ thuộc hiệu suất chiết protein toàn phần vào hai biến đầu vào 34 Bảng 3.6: Kết kiểm định mô hình thực nghiệm 36 Bảng 3.7: Hệ số lưu giữ Rf sắc kí định tính 39 Bảng 3.8: Kết thực nghiệm mẻ với quy trình chiết lần 39 Bảng 3.9: Kết thực nghiệm mẻ với quy trình chiết lần 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Dược liệu địa long Hình 1.2: Mơ hình q trình vơ hóa 10 Hình 1.3: Mơ hình q trình chưng cất amoniac 11 Hình 1.4: Minh họa thiết kế thí nghiệm phối hợp có tâm hai yếu tố 14 Hình 1.5: Minh họa thiết kế thí nghiệm phối hợp có tâm ba yếu tố 14 Hình 1.6: Sơ đồ quy trình bào chế cao tổng quát 17 Hình 2.1: Dự kiến quy trình bào chế cao Địa long 20 Hình 3.1: Biểu đồ hiệu suất chiết protein tồn phần theo kích thước dược liệu 28 Hình 3.2: Biểu đồ hiệu suất chiết protein tồn phần theo tỷ lệ dược liệu/dung mơi 29 Hình 3.3: Biểu đồ hiệu suất chiết protein toàn phần theo thời gian chiết 30 Hình 3.4: Biểu đồ hiệu suất chiết protein tồn phần theo số lần chiết 31 Hình 3.5: Kết định tính protein dịch chiết Địa long lần 1, 2, 3, 4, thuốc thử Ninhydrin 32 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hiệu suất chiết protein toàn phần từ Địa long vào thời gian chiết tỷ lệ dược liệu/dung môi 35 Hình 3.7: Quy trình chiết cao Địa long quy mơ mẻ 50g 37 Hình 3.8: Cao đặc Địa long 37 Hình 3.9: Định tính dịch hịa tan cao Địa long với thuốc thử Ninhydrin 38 Hình 3.10: Sắc ký lớp mỏng định tính dịch hịa tan cao Địa long 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Địa long (Pheretima sp.) dược liệu quan tâm nay, đặc biệt lên giai đoạn đại dịch Covid-19 bùng phát Các nghiên cứu trước bao gồm đề tài phân tích đặc điểm sinh thái, giống lồi, thành phần hóa học, hàm lượng dinh dưỡng hoạt tính sinh học hoạt chất có Địa long chế phẩm chứa Địa long Các nhà khoa học Địa long có tác dụng sinh học quan trọng như: chống đơng máu, kháng khuẩn, chống oxy hóa [39], kích thích hoạt động tế bào xương [21], ức chế viêm, giảm hen suyễn [27], giảm đau [32], hạ sốt [12], chống ung thư [29], tiêu sợi huyết [38], Trong trình nghiên cứu, nhiều tác giả qua tâm đến protein hàm lượng chúng mẫu dược liệu, ví dụ như: Enzym lumbrokinase [36], [34], [26], enzym cellulase, lignase, peroxidase, catalase [26], G-90 - chiết xuất glyco lipoprotein [21], peptidase khác [7], Các giả thiết hay minh chứng khoa học cho thấy protein Địa long định hoạt chất sinh học vị dược liệu Theo liệu thống kê, hàm lượng protein lồi Địa long hay cịn có tên gọi khác giun đất cao so với nguồn protein khác trứng, thịt lợn, cá hồi [34], Mặc dù sản phẩm bào chế từ giun đất ngun khơng đón nhận hình thái mùi hương Do đó, cần thiết có nghiên cứu theo hướng chiết xuất cao Địa long để hạn chế khó chịu hình thái, mùi vị giúp dễ dàng bào chế chế phẩm đại, dễ bảo quản Hiện số lượng đề tài nghiên cứu quy trình chiết protein Địa long chưa đầy đủ Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất định lượng protein tồn phần cao Địa long” thực với ba mục tiêu: • Xây dựng phương pháp định lượng protein toàn phần Địa long phương pháp Kjeldahl • Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long • Định lượng protein tồn phần cao Địa long bào chế theo phương pháp tối ưu hóa Bảng 3.9: Kết thực nghiệm mẻ với quy trình chiết lần STT Khối lượng Khối lượng Hàm ẩm Hiệu suất Hàm lượng dược liệu cao điều cao (%) điều chế protein toàn (g) chế (g) cao (%) phần cao (%) 50,0204 12,11 19,15 22,37 59,06 50,0053 11,03 14,89 21,45 54,21 50,0009 11,68 14,54 22,81 55,03 Trung bình 16,19 22,21 56,1 SD 2,57 0,70 2,60 RSD (%) 15,85 3,12 4,63 Nhận xét: Nhận thấy quy trình chiết ổn định với kết hiệu suất điều chế cao hàm lượng protein cao điều chế có độ lặp lại có kết trung bình 22,21% 56,1% Mẻ chiết lần lần bào chế cao có hàm lượng protein toàn phần (dưới 60%) thấp hàm lượng protein toàn phần dược liệu ban đầu (63%) Khơng có khác biệt lớn hàm lượng protein cao chiết từ mẻ chiết lần mẻ chiết lần (56,89% 56,1%) mẻ chiết lần cho hiệu suất chiết cao lớn mẻ chiết lần 3.5 Bàn luận 3.5.1 Về đối tượng nghiên cứu Địa long dược liệu ứng dụng làm thuốc lưu truyền gian gian từ lâu trước Theo kinh nghiệm dân gian y học cổ truyền tồn thân phân Địa long sử dụng Địa long biết đến vị thuốc thuốc tiếng Thần dược cứu mệnh Bài thuốc có cơng thức: - Địa long: Người lớn trẻ em từ 15-16 tuổi trở lên: 50g khô; Trẻ em từ 5-6 tuổi đến 13-14 tuổi: 30g khô; Trẻ em 1-2 tháng đến 4-5 tuổi: 20g khô - Đậu đen: 100g 40 - Đậu xanh: 100g - Rau ngót: 200-300g Thuốc thường dùng thang hết bệnh, thầy thuốc thường dùng ba thang, ba ngày (tối nước nhất, sáng nước nhì), hai tháng sau để trừ trừ di chứng méo miệng, mắt xệch, uống thang thứ hai, thang thứ ba bệnh nhân tỉnh táo Đơn thuốc dùng chữa trường hợp lục phủ ngũ tạng xuất huyết, não xuất huyết, hôn mê bất tỉnh kéo dài nhiều ngày, phù thận, phù toàn thân, phù tim, đột ngột phát điên khơng rõ ngun nhân (có sốt khơng sốt), bí đại tiểu tiện, bí trung tiện, khí hư bạch đới nặng người gầy xanh xao [5] Vào tháng cao điểm dịch bệnh Covid-19 bùng phát, có nhiều nguồn thơng tin khơng thống lan truyền việc ăn giun đất điều trị Covid-19 Trên thực tế chưa có nghiên cứu công bố khẳng định việc giun đất có tác dụng điều trị Covid-19 Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu tác dụng sinh học giun đất chứng minh tác dụng vị dược liệu này, ví dụ như: Ức chế viêm, giảm hen suyễn [27], giảm đau [32], hạ sốt [12], chống ung thư [29], tiêu sợi huyết [38], Như chưa có nghiên cứu xác thực việc giun đất ức chế virus corona đưa giả thuyết tác dụng ức chế viêm, hạ sốt, giảm hen suyễn giúp cải thiện triệu chứng bệnh nhân nhiễm Covid-19 sốt cao, khó thở, từ giảm đáng kể thời gian nhiễm bệnh Về thành phần hóa học, nghiên cứu nhiều protein Địa long định tác dụng dược lý vị dược liệu này, ví dụ như: Enzym lumbrokinase phân lập từ giun đất sử dụng liệu pháp chống đông máu [39], Lumbrifebrin, terestrolimbrolysin, eiseniapore hợp chất hoạt động chất kháng khuẩn thể giun đất phần lớn dạng protein [41], [37] Mặt khác, môi trường sống giun đất ẩm, thức ăn giun đất mùn hữu đất, đất có chứa kim loại nặng, chất độc hóa học, loại nấm mốc [24], giun đất tiềm tàng thể độc tính gây tác dụng bất lợi cho người dùng Việc sử dụng Địa long khơng đạt tiêu chuẩn Dược điển bào chế sản phẩm khơng có độ an tồn cao Bên cạnh có nghiên cứu trình oxy hóa lipid nguồn gốc hợp chất tạo mùi bột giun đất [34] Do đó, đề tài đặt mục tiêu chiết xuất cao Địa long với quy trình tối ưu hóa chiết protein để đặt móng phát triển dạng bào chế che giấu mùi vị địa long, với đánh giá độc tính, tác dụng sinh học chế phẩm phát triển từ thuốc Thần dược cứu mệnh 3.5.2 Về quy trình chiết xuất 41 Qua trình tổng quan tài liệu, nghiên cứu trước thường chiết Địa long với dung mơi methanol, ethanol nước cất Phương pháp chiết gồm phương pháp là: ngâm lạnh, chiết nóng siêu âm Với quy trình sử dụng dung mơi methanol gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bào chế, với giai đoạn loại dung mơi khơng xử lý triệt để, chế phẩm bào chế có hàm lượng methanol cao gây độc tính cho người sử dụng Dung môi Ethanol với nồng độ cao gây tổn hại đến sức khỏe người tham gia bào chế, ngồi ethanol hịa tan nhiều hoạt chất đồng nghĩa với việc hòa tan nhiều tạp, protein dễ tủa ethanol nồng độ cao làm giảm hiệu suất chiết Việc sử dụng ethanol với quy mô chiết công nghiệp gây tốn mặt kinh tế Protein hợp chất tan nước, tan nhiều nước nóng nên thực phương pháp ngâm lạnh thời gian chiết xuất cần kéo dài để đảm bảo hiệu suất chiết protein cao Phương pháp siêu âm giúp tăng tốc độ khuếch tán hoạt chất môi trường dung môi việc áp dụng phương pháp siêu âm vào quy mô lớn khó khăn tốn Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết nóng với dung mơi nước để đạt mục tiêu độ an toàn chế phẩm, hiệu suất chiết protein tăng khoảng thời gian chiết ngắn, tiết kiệm kinh tế, dễ dàng phát triển lên quy mô lớn điều kiện sản xuất thực tế 3.5.3 Về phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long Có phương pháp sử dụng phần khảo sát này, phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Với phương pháp OFAT, phương pháp đơn giản dễ thực hiện, không cần xử lý số liệu thống kê phức tạp dễ dàng khoanh vùng giá trị chứa khoảng tối ưu Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp khảo sát biến độc lập, khơng thể khảo sát biến có tương tác khiến cho kết luận đưa khơng có tính tổng qt [8] Với phương pháp RSM, đưa mối quan hệ nhiều phản ứng với yếu tố độc lập Nó xác định ảnh hưởng yếu tố độc lập, bao gồm ảnh hưởng đơn lẻ ảnh hưởng tương tác, toàn trình Hơn nữa, phương pháp đưa mối quan hệ toán học để dự đoán đầu mong muốn [31] Tuy nhiên để thực hiện, phương pháp cần cung cấp biến độc lập có tác động lên hệ thống thơng qua nghiên cứu sàng lọc phân định vùng thử nghiệm [11] để tránh tốn 42 thời gian chi phí thực nghiệm phải thực với toàn yếu tố với khoảng giá trị khảo sát mở rộng Việc sử dụng kết hợp OFAT RSM hạn chế nhược điểm phương pháp, giúp thời gian nghiên cứu rút gọn, giảm thiểu chi phí thực nghiệm kết đưa có tính tổng quát cao Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất protein toàn phần từ Địa long nghiên cứu đặt móng cho việc đưa phương pháp chiết tối ưu kết hợp vào thuốc cổ truyền muốn chiết protein, từ sử dụng lượng nước phù hợp với lượng dược liệu, sắc thời gian sắc thuốc tối ưu 3.5.4 Về kết xây dựng trình định lượng protein toàn phần phương pháp Kjeldahl Nghiên cứu thực định lượng thủ công thủy tinh chịu nhiệt dẫn tới nhiều sai số q trình định lượng Theo nghiên cứu cơng bố trước đây, nhiệt độ giai đoạn vô hóa nên trì 370℃ - 390℃ nhiệt độ 420℃ gây nhiệt phân amoniac thành N2 [23] Ngọn lửa đèn cồn lên đến 600℃ [22] làm thất thoát amoniac theo trình nhiệt phân kể Trong nghiên cứu này, việc đo nhiệt độ đèn cồn không thực hiện, để hạn chế chênh lệch sai số trình, thực nghiệm sử dụng mẫu bình vơ hóa, mẫu đèn cồn, đổ đầy cồn lần bắt đầu vơ hóa thiết kế khoảng cách bình lửa đèn cồn giống thí nghiệm Trên thực tế kết thẩm định độ lặp lại trình định lượng cho RSD < 1,8%, chứng tỏ có lặp lại thí nghiệm Tuy vậy, nghiên cứu đề xuất thực thiết bị định lượng protein hóa tự động để giảm thiểu sai số 3.5.5 Về kết thực nghiệm pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất cao Địa long 3.5.5.1 Khảo sát kích thước Q trình chia nhỏ dược liệu giúp tăng diện tích tiếp xúc dược liệu dung mơi, từ tăng khuếch tán dược chất ngồi mơi trường, tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên Địa long có chất động vật với hàm lượng protein lên tới 60%, xay nhỏ đun nóng với dung mơi nước, protein đơng tụ vón lại, thành mảng phía bề 43 mặt dung mơi làm giảm tính thấm dung mơi vào bên khối dược liệu, hạn chế khả khuếch tán hoạt chất ngồi mơi trường làm giảm hiệu suất chiết 3.5.5.2 Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung mơi Khi tăng tỷ lệ dược liệu/dung mơi lượng hoạt chất hòa tan tăng, giúp tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên protein chất tan phụ thuộc pH dung dịch, việc tăng thể tích nước tăng giải phóng tạp ngồi mơi trường ảnh hưởng pH dung dịch chiết, dẫn đến giảm độ tan protein từ làm giảm hiệu suất chiết protein tồn phần Tuy nhiên mức độ thay đổi pH không lớn, ảnh hưởng yếu tố khơng mạnh Thực nghiệm cho thấy kết khảo sát tỷ lệ khơng có chênh lệch q nhiều 3.5.5.3 Khảo sát thời gian chiết xuất Hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu môi trường Khi gần trạng thái cân trình khuếch tán giảm, trình khuếch tán dừng lại hoạt chất dược liệu cân với mơi trường nồng độ dịch chiết cao Nếu thời gian chiết lâu, hàm lượng hoạt chất không đổi lượng tạp tăng Kết thực nghiệm thu phù hợp với lý thuyết Do nghiên cứu lựa chọn thời gian tối ưu thời điểm đồ thị hiệu suất chiết bắt đầu ngang (khơng có thay đổi) để thu hiệu suất cao đồng thời giảm thiểu chi phí ngun liệu khơng cần thiết 3.5.5.4 Khảo sát số lần chiết Khi tăng số lần chiết giúp tăng lượng dung mơi tăng nhiều lần q trình khuếch tán hoạt chất đạt trạng thái cân từ tăng hiệu suất chiết protein tồn phần Từ kết thực nghiệm cho thấy, sau lần chiết lượng protein gần không tiếp tục khuếch tán tiếp mơi trường q trình tạp khuếch tán ngồi tiếp tục dẫn tới hiệu suất chiết cao tăng hàm lượng protein cao không thay đổi nhiều 3.5.6 Về kết trình chiết xuất cao Địa long theo điều kiện tối ưu hóa mơ hình bề mặt đáp ứng RSM Kết thẩm định lại mơ hình cho thấy có chênh lệch thực nghiệm dự đốn Có thể sai số thiết bị số lượng mẫu chiết lúc thiết bị ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Để hạn chế sai lệch mẫu chiết, giai đoạn khảo sát yếu tố, mẫu chiết bếp với mực nước giữ không thấp dung mơi bình chiết, bếp ln giữ công suất đun 44 Đối với kết mẻ chiết 50g, hiệu suất chiết thấp so với mẻ nhỏ Điều giải thích bị ảnh hưởng điều kiện chiết xuất thiết bị chiết xuất Khối lượng dược liệu thể tích dung mơi tăng lên 10 lần công suất bếp đun giữ nguyên Mặt khác, thể tích lớn nên hạn chế việc cung cấp nhiệt đến tồn dung mơi dẫn đến giảm hiệu suất chiết Cao Địa long thu có hàm lượng protein khoản 55% với hiệu suất chiết cao khoảng 17% hàm lượng protein dược liệu lên tới 63% nên nghiên cứu đặt vấn đề để phát triển tiếp trình tối ưu hóa, ví dụ khảo sát thêm yếu tố: pH, áp suất, 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình thực hiện, đề tài hoàn thành thu kết sau: Đã xây dựng quy trình định lượng protein toàn phần Địa long phương pháp Kjeldahl theo hướng dẫn phụ lục 10.9 Dược điển Việt Nam V với thông số - Khối lượng mẫu: 0,09g Lượng xúc tác: 2,5 g Lượng H2SO4 đặc: 8ml Đã khảo sát yếu tố tỷ lệ dược liệu/dung mơi, kích thước dược liệu, thời gian chiết, số lần chiết ảnh hưởng đến q trình chiết xuất protein tồn phần từ Địa long Bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, lựa chọn điều kiện tối ưu để chiết xuất với thông số: - Thời gian chiết xuất: 3,157 - Tỷ lệ dược liệu/dung môi là: 1g/19,765ml Số lần chiết: lần Kích thước: Cắt nhỏ Bước đầu điều chế cao đặc Địa long với quy mô mẻ 50g theo điều kiện tối ưu, thu hiệu suất chiết cao 17,71 ± 3,93%, cao bào chế có hàm lượng protein 56,89 ± 4,31% KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thêm yếu tố khác để hồn thiện quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ Địa long, từ phát triển lên quy mô pilot quy mô công nghiệp Thử độc tính chế phẩm cao bào chế Tiến hành thử tác dụng virus Dengue cao Địa long Bào chế dạng thuốc giúp cải thiện mùi vị cao Địa long Xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao Địa long 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Hà Nội, Tập Đỗ Tất Lợi (2013), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, tr.976-977 Phạm Xuân Sinh (2002), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Y học, tr.254 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr.44-45 Trần Bảo Ngọc Thưa (2022), "Tổng quan vị thuốc Địa Long (Pheretima sp.) theo kinh nghiệm dân gian y học cổ truyền", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 6(55), tr.161-169 Tiếng Anh Bradstreet, Raymond B (1954), "Kjeldahl method for organic nitrogen", Analytical Chemistry, 26(1), pp.185-187 Hrženjak, Terezija, et al (1998), "Fibrinolytic and anticoagulative activities from the earthworm Eisenia foetida", Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 119(4), pp.825-832 Frey, Daniel D and Wang, Hungjen (2006), "Adaptive one-factor-at-a-time experimentation and expected value of improvement", Technometrics, 48(3), pp.418-431 10 11 12 13 14 Dejaegher, Bieke and Vander Heyden, Yvan (2007), "Ruggedness and robustness testing", Journal of chromatography A, 1158(1-2), pp.138-157 Balamurugan, Mariappan, et al (2008), "Hypothetical mode of action of earthworm extract with hepatoprotective and antioxidant properties", Journal of Zhejiang University Science B, 9, pp.141-147 Bezerra, Marcos Almeida, et al (2008), "Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry", Talanta, 76(5), pp.965-977 Balamurugan, M, et al (2009), "Anti-inflammatory and anti-pyretic activities of earthworm extract—Lampito mauritii (Kinberg)", Journal of ethnopharmacology, 121(2), pp.330-332 Karaca, Ayten (2010), Biology of earthworms, 24, Springer Science & Business Media, pp.48-49 Chen, Chao-Tsung, et al (2010), "Earthworm extracts facilitate PC12 cell differentiation and promote axonal sprouting in peripheral nerve injury", The American Journal of Chinese Medicine, 38(03), pp.547-560 47 15 Khuri, André I and Mukhopadhyay, Siuli (2010), "Response surface methodology", Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Statistics, 2(2), 16 pp.128-149 Liu, Zhizhen, et al (2012), "An extract from the earthworm Eisenia fetida nonspecifically inhibits the activity of influenza and adenoviruses", Journal of 17 Traditional Chinese Medicine, 32(4), pp.657-663 Wahid, Z and Nadir, N (2013), "Improvement of one factor at a time through 18 design of experiments", World Applied Sciences Journal, 21(1), pp.56-61 Sáez-Plaza, Purificación, et al (2013), "An overview of the Kjeldahl method of nitrogen determination Part I Early history, chemistry of the procedure, and titrimetric finish", Critical Reviews in Analytical Chemistry, 43(4), pp.178-223 19 20 21 22 23 24 25 26 Sáez-Plaza, Purificación, et al (2013), "An overview of the Kjeldahl method of nitrogen determination Part II Sample preparation, working scale, instrumental finish, and quality control", Critical Reviews in Analytical Chemistry, 43(4), pp.224-272 Abrams, Dean, Metcalf, David, and Hojjatie, Michael (2014), "Determination of Kjeldahl nitrogen in fertilizers by AOAC official method SM 978.02: Effect of copper sulfate as a catalyst", Journal of AOAC International, 97(3), pp.764-767 Fu, Yuan-Tsung, et al (2014), "Earthworm (Pheretima aspergillum) extract stimulates osteoblast activity and inhibits osteoclast differentiation", BMC complementary and alternative medicine, 14(1), pp.1-9 Yang, Zhan, et al (2014), “Experimental study of ethanol fire at different oxygen concentrations”, 2014 7th International Conference on Intelligent Computation Technology and Automation, IEEE, pp.248-251 Chromý, Vratislav, et al (2015), "The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry I A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine", Critical reviews in analytical chemistry, 45(2), pp.106-111 Zhang, Sisi, et al (2016), "Multi-mycotoxins analysis in Pheretima using ultrahigh-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry based on a modified QuEChERS method", Journal of Chromatography B, 1035, pp.31-41 Aspe, Nonillon M and James, Samuel W (2016), "New species of Pheretima, Amynthas, Polypheretima, and Pithemera (Clitellata: Megascolecidae) from Mindanao and associated islands, Philippines", Zoological Studies, 55 Kusumalelana, Leonard Azdarisha, Suwendar, Suwendar, and Fitrianingsih, Sri Peni (2016), "Preface Study of antibacteria potency from capsule of earth-worm extract (Lumbricus Rubellus) and tape-worm (Pheretima Aspergillum) circulated 48 in markets toward bacteria of Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus in accordance with In Vitro", Prosiding Farmasi, pp.7-14 27 Huang, Chuan-qi, et al (2016), "Pheretima aspergillum decoction suppresses inflammation and relieves asthma in a mouse model of bronchial asthma by NFκB inhibition", Journal of ethnopharmacology, 189, pp.22-30 28 29 Huang, Chuanqi, et al (2018), "Anti-inflammatory activities of GuangPheretima extract in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 murine macrophages", BMC complementary and alternative medicine, 18, pp.1-11 Augustine, Dominic, et al (2018), "Anticancer Prospects of Earthworm Extracts: A Systematic Review of In vitro and In vivo Studies", Pharmacognosy Reviews, 12(23), pp.46-55 30 Fukuda, Isa Martins, et al (2018), "Design of experiments (DoE) applied to pharmaceutical and analytical quality by design (QbD)", Brazilian journal of pharmaceutical sciences, 54 31 Thoai, Dang Nguyen, et al (2018), "Predictive capability evaluation of RSM and ANN in modeling and optimization of biodiesel production from palm (Elaeisguineensis) oil", International Journal of Applied Engineering Research, 13(10), pp.7529-7540 Luo, Wei, et al (2018), "Study of analgesic effect of earthworm extract", Bioscience Reports, 38(1) 32 33 Sun, Jie, et al (2019), "Chromatographic fingerprint and quantitative analysis of commercial Pheretima aspergillum (Guang Dilong) and its adulterants by UPLC- 34 DAD", International Journal of Analytical Chemistry, 2019 Ding, Siyun, Lin, Xiting, and He, Sanger (2019), "Earthworms: A source of protein", J Food Sci Eng 9, pp.159-170 35 Huang, Pei‐Chen, et al (2019), "Pheretima aspergillum extract attenuates high‐ KCl‐induced mitochondrial injury and pro‐fibrotic events in cardiomyoblast cells", Environmental toxicology, 34(8), pp.921-927 36 37 Cheng, Tao-Fang, et al (2020), "Investigation of the chemical compounds in Pheretima aspergillum (E Perrier) using a combination of mass spectral molecular networking and unsupervised substructure annotation topic modeling together with in silico fragmentation prediction", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 184, pp.113197 Hussain, Mudassar, et al (2022), "Medicinal perspective of antibacterial bioactive agents in earthworms (Clitellata, Annelida): A comprehensive review", Journal of Oleo Science, 71(4), pp.563-573 49 38 Feng, Ting-Ting, et al (2022), "A strategy for rapid discovery of marker peptides associated with fibrinolytic efficacy of Pheretima aspergillum based on bioinformatics combined with parallel reaction monitoring", Molecules, 27(9), pp.2651 39 Mustafa, Rozina Ghulam, et al (2022), "Therapeutic Values of Earthworm Species Extract from Azad Kashmir as Anticoagulant, Antibacterial, and Antioxidant Agents", Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology, 2022 Tiếng Indonesia 40 Mardiati, Ni Putu Jeny, et al (2011), “Earthworm Extract as an Innovation for Healing Diabetic Ulcers Based on Axon Density Induction, National Student Science Week Student-Research Creativity Program 2013”, Indonesian Ministry of Research, Technology and Higher Education 41 Yuniati, T (2012), "Bioactivity of Pheretima sp Earthworm Chloroform Extract on the Growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli Bacteria", Universitas Hasanuddin 42 Rauf, Dirayah and Hasyim, Zohra (2018), "Effects of the Crude Extract of Pheretima sp Earthworms on Bacterial Cell Morphology of Salmonella enteritidis", Jurnal Ilmiah Bionature, 19, pp.152-162 Tiếng Trung 43 吴文如 and 李薇 (2007), "地龙类药用动物的比较鉴别", 现代生物医学进展, 7(11), pp.1754-1757 50 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN DƯỢC LIỆU 51 52 PHỤ LỤC 2: HIỆN TƯỢNG ĐƠNG VĨN CỦA DƯỢC LIỆU ĐỊA LONG KHI XAY NHỎ TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT 53 PHỤ LỤC 3: CÁC KÍCH THƯỚC KHẢO SÁT A XAY NHỎ B CẮT NHỎ C NGUYÊN DƯỢC LIỆU ĐỊA LONG 54