Lương hồng hà nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ quả cần tây sử dụng dung môi eutectic khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  LƯƠNG HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN TỪ QUẢ CẦN TÂY SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG HỒNG HÀ 1801164 NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT APIGENIN TỪ QUẢ CẦN TÂY SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thu Hằng ThS Nguyễn Văn Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Khoa Dược liệu - DHCT HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thu Hằng Cô dành nhiều thời gian tâm huyết để bảo, hướng dẫn, truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu, động viên khích lệ tơi suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Văn Phương, người thầy nhiệt huyết, người hướng dẫn, quan tâm, hỗ trợ truyền động lực cho suốt chặng đường làm khóa luận vừa qua Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giảng viên kỹ thuật viên công tác môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp tơi q trình thực khóa luận Để hồn thành khóa luận khơng thể khơng nhắc tới giúp đỡ nhiệt tình bạn, em sinh viên học tập nghiên cứu khoa học môn Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai em Trần Thị Hương Giang Ngô Hằng Nga động viên, hỗ trợ sát cánh suốt thời gian qua Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, phịng ban tồn thể thầy Trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức quan trọng, bổ ích khơng tảng cho q trình thực khóa luận mà cịn hành trang cho chặng đường phía trước Lời cảm ơn cuối tơi xin gửi đến gia đình, bạn bè, người bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi để tơi có thêm động lực vượt qua khó khăn sống học tập Và hẳn, khóa luận tơi cịn hạn chế lực thiếu sót q trình nghiên cứu Tôi mong lắng nghe tiếp thu ý kiến đóng góp thầy bạn bè để khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Lương Hồng Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Cần tây 1.1.1 Thành phần hóa học 1.1.2 Tác dụng sinh học 1.1.3 Các quy trình chiết xuất flavonoid từ Cần tây 1.2 Các phương pháp thủy phân glycosid 1.2.1 Phương pháp thủy phân glycosid acid 1.2.2 Phương pháp thủy phân glycosid enzym 1.3 Các phương pháp chuyển apiin thành apigenin Cần tây 1.4 Tổng quan dung môi eutectic 1.4.1 Định nghĩa 1.4.2 Thành phần 10 1.4.3 Ứng dụng 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị phần mềm 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến 14 2.3.2 Phương pháp định lượng apigenin dịch chiết Cần tây 15 2.3.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện tối ưu đến trình chiết xuất 15 2.3.4 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dịch chiết Cần tây 16 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất apigenin từ Cần tây 17 3.1.1 Thời gian chiết xuất 17 3.1.2 Tỷ lệ dung môi/dược liệu 18 3.1.3 Hàm lượng nước hệ dung môi 19 3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất apigenin từ Cần tây 19 3.2.1 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 19 3.2.2 Kết tối ưu hóa trình chiết xuất 21 3.2.3 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào 24 3.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dịch chiết Cần tây 25 3.3.1 Lượng nước 25 3.3.2 Nhiệt độ thủy phân 26 3.3.3 Thời gian thủy phân 27 3.3.4 Dung môi eutectic 28 3.4 Bàn luận 30 3.4.1 Về việc chiết xuất apigenin từ Cần tây 30 3.4.2 Về việc thủy phân dịch chiết Cần tây 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ANOVA Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance) DES Dung môi eutectic (Deep Eutectic Solvent) DMSO Dimethyl sulfoxid HBA Chất nhận liên kết hydro (Hydrogen Bond Acceptor) HBD Chất cho liên kết hydro (Hydrogen Bond Donor) HPLC Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) kl/kl Tỷ lệ khối lượng/khối lượng MLR Hồi quy tuyến tính đa biến (Multiple Linear Regression) OFAT Phương pháp thay đổi yếu tố (One factor at a time) RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) STT Số thứ tự XO Xanthin oxidase DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký Tên bảng hiệu Trang 1.1 Khung cấu trúc apigenin, apiin dẫn xuất chúng 3.1 Kết mã hóa biến đầu vào mức -1; 0; 19 3.2 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 20 Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình biểu thị 3.3 mối tương quan hàm lượng apigenin dịch chiết với 23 biến đầu vào 3.4 Kết kiểm định mô hình thực nghiệm 25 3.5 Các hệ dung môi lựa chọn để khảo sát 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ STT Hình Tên hình Trang 1.1 Khung cấu trúc hóa học flavonoid Cần tây 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 14 3.1 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 17 3.2 Kết khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu 18 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng apigenin dịch chiết với biến đầu vào 22 3.4 Kết tối ưu điều kiện chiết xuất 24 3.5 Kết khảo sát lượng nước hệ dung môi 26 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ thủy phân 27 3.7 Kết khảo sát thời gian thủy phân 28 10 3.8 Hàm lượng apigenin mẫu dịch chiết 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Cần tây (Apium graveolens L.) loài trồng phổ biến giới di thực Việt Nam Bên cạnh vai trò làm thực phẩm gia vị, Cần tây sử dụng rộng rãi loại thảo dược [3], [49] Ngoài tác dụng chống viêm [55], giảm đau [2], hạ huyết áp [61], chống ngưng tập tiểu cầu kéo dài thời gian đơng máu [39], Cần tây cịn đánh giá dược liệu tiềm để phòng điều trị bệnh gút với tác dụng hạ acid uric ức chế xanthin oxidase [50] Flavonoid nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng Cần tây, thành phần apigenin chứng minh tác dụng hạ acid uric ức chế xanthin oxidase [26], [34], [48] Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất apigenin từ Cần tây cần thiết để từ phát triển sản phẩm phòng điều trị bệnh gút từ dược liệu Trong công bố trước đây, dung môi hữu methanol, ethanol, hexan… thường sử dụng quy trình chiết xuất flavonoid từ Cần tây [33] Đây dung môi sử dụng phổ biến chiết xuất dược liệu đem lại hiệu chiết tương đối tốt, rẻ tiền, dễ kiếm Tuy nhiên, dung môi thường dễ bay nhiệt độ phòng, dễ cháy nổ Đồng thời, việc sử dụng dung môi thời gian dài cịn tác động xấu đến mơi trường sức khỏe người Với mối quan tâm ngày tăng sinh thái kinh tế, xu hướng chiết xuất sử dụng dung mơi xanh [54] Các đặc tính lý tưởng dung mơi xanh bao gồm độc tính thấp, không bắt lửa, ổn định, không gây đột biến dễ điều chế [62] Trong nghiên cứu tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng năm 2021 [49] chiết xuất cao đặc giàu apigenin luteolin từ Cần tây sử dụng hệ dung môi eutectic (DES - Deep Eutectic Solvent) Đây coi hệ dung môi xanh, thân thiện với môi trường giải pháp thay cho dung môi hữu truyền thống với ưu điểm bật an tồn, dễ tổng hợp, dễ phân hủy, dễ dàng tái chế với khả chiết xuất chọn lọc hợp chất có hoạt tính sinh học [49] Việc sử dụng dung môi eutectic khắc phục nhược điểm dung môi hữu truyền thống Tuy nhiên, quy trình chiết xuất thực nhiệt độ cao Mặt khác, phần lớn apigenin Cần tây tồn dạng glycosid dạng aglycon Vì thế, hàm lượng apigenin thu theo quy trình tương đối thấp so với hàm lượng apigenin tồn phần dược liệu Do đó, để cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ Cần tây dung môi eutectic, việc sử dụng quy trình chiết xuất với hỗ trợ sóng siêu âm nhiệt độ thường thực thủy phân dịch chiết để chuyển glycosid thành aglycon lựa chọn để tăng hàm lượng apigenin sản phẩm Mặc dù có số nghiên cứu sử dụng phương pháp thủy phân glycosid để làm tăng hàm lượng aglycon chiết xuất chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu chưa có nghiên cứu ứng dụng q trình thủy phân glycosid dung mơi eutectic để chiết xuất apigenin từ Cần tây Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ Cần tây sử dụng dung môi eutectic” thực với mục tiêu: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu cho trình chiết xuất apigenin từ Cần tây Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn điều kiện cụ thể cho trình thủy phân dịch chiết Cần tây hệ dung môi eutectic - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 24,98 ml/g Tại điều kiện này, hàm lượng apigenin dịch chiết 0,0438 mg/g Dựa vào điều kiện tối ưu trên, mơ hình kiểm định thực nghiệm lần với điều kiện sau: - Thời gian chiết xuất: 25 phút - Hàm lượng nước hệ dung môi: 33% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 25 ml/g Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm Thông số Hàm lượng apigenin (mg/g) Giá trị dự đốn Giá trị thực nghiệm Độ xác 0,0438 0,0433 ± 0,0003 98,86% Nhận xét: Độ xác giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm hàm lượng apigenin dịch chiết 98,86% cho thấy phù hợp mơ hình giá trị thực nghiệm, mơ hình có chất lượng độ xác cao 3.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dịch chiết Cần tây Tiến hành chiết xuất Cần tây hệ dung mơi eutectic sau thủy phân dịch chiết thu theo quy trình trình bày mục 2.3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân: lượng nước, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, dung môi eutectic với thông số đánh giá hàm lượng apigenin thu 3.3.1 Lượng nước Tiến hành khảo sát lượng nước thêm vào dung môi tương ứng với nồng độ acid citric 0,1M; 0,25M; 0,5M; 0,75M 1M Các thông số khác cố định bao gồm: thời gian thủy phân: 30 phút nhiệt độ thủy phân: 60◦C Kết khảo sát yếu tố lượng nước hệ dung mơi trình bày hình 3.5 25 1.40 Hàm lượng (mg/g) 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.1 0.25 0.5 0.75 Nồng độ acid citric (M) Hình 3.5 Kết khảo sát lượng nước hệ dung môi Nhận xét: Khi nồng độ acid citric tăng từ 0,1 M đến M, hàm lượng apigenin dao động không nhiều Tuy nhiên lượng nước nhiều dẫn đến trình xử lý dịch chiết bay nước tốn nhiều thời gian cịn lượng nước q khó thao tác khuấy trộn trình đun hồi lưu Do vậy, nồng độ acid citric 0,5 M lựa chọn 3.3.2 Nhiệt độ thủy phân Tiến hành khảo sát nhiệt độ thủy phân với giá trị 40◦C, 50◦C, 60◦C, 70◦C, 80◦C, 90◦C, 100◦C Các thông số khác cố định bao gồm: thời gian thủy phân: 30 phút, nồng độ acid citric: 0,5M Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất trình bày hình 3.6 26 1.80 Hàm lượng (mg/g) 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 40 50 60 70 80 90 100 Nhiệt độ (◦C) Hình 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ thủy phân Nhận xét: Hàm lượng apigenin dịch chiết tăng lên khoảng nhiệt độ từ 40◦C đến 100◦C đạt giá trị lớn 100◦C Điều giải thích nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng Do đó, nhiệt độ tăng tốc độ hiệu suất chiết tăng 3.3.3 Thời gian thủy phân Tiến hành khảo sát thời gian thủy phân với giá trị 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút Các thông số khác cố định bao gồm: nhiệt độ thủy phân: 100◦C, nồng độ acid citric: 0,5M Kết khảo sát thời gian thủy phân trình bày hình 3.7 27 1.8 Hàm lượng (mg/g) 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 15 phút 30 phút 45 phút 60 phút 90 phút Thời gian(phút) Hình 3.7 Kết khảo sát thời gian thủy phân Nhận xét: Từ biểu đồ hình 3.7 cho thấy, khoảng thời gian từ 15 phút đến 30 phút, thời gian thủy phân tăng lên hàm lượng apigenin tăng lên Khi tăng thời gian lớn 30 phút hàm lượng apigenin dịch chiết giảm dần Điều giải thích tăng thời gian chiết xuất apigenin dạng liên kết glycosid thủy phân hết dẫn đến hàm lượng apigenin thu dịch chiết tăng lên Tuy nhiên, trình thủy phân tiếp tục, tỉ lệ hoạt chất không tăng mà tỉ lệ tạp tăng, ngồi đun lâu q khiến hoạt chất bị phân hủy, kèm theo thủy phân nhiệt độ cao thời gian dài gây phá vỡ cấu trúc hệ làm cho hiệu suất giảm Như vậy, thời gian thủy phân ngắn q khơng chiết hết hoạt chất dược liệu thời gian thủy phân dài q lượng hoạt chất dịch chiết giảm lượng tạp tăng 3.3.4 Dung mơi eutectic Để sơ đánh giá vai trò betain, acid citric DES đến trình thủy phân flavonoid từ Cần tây thành apigenin, khóa luận tiến hành khảo sát số hệ DES với HBA betain so sánh với khả thủy phân hệ eutectic betain - acid citric, betain, acid citric cao chiết ethanol (bảng 3.5) Các hệ DES tổng hợp cách phối hợp cặp chất HBA HBD theo tỷ lệ mol xác định, thêm nước 33% (kl/kl), 28 sau đun cách thủy 80◦C kết hợp với khuấy trộn đến thu chất lỏng đồng nhất, suốt Bảng 3.5 Các hệ dung môi lựa chọn để khảo sát STT Cao chiết HBA HBD Tỷ lệ HBA:HBD Ethanol Betain Acid citric 1:1 Ethanol Betain - - Ethanol - Acid citric - DES Betain Acid citric 1:1 DES Betain Acid acetic 1:8 DES Betain Propylen glycol 1:4 Các hệ DES lựa chọn tiến hành khảo sát theo bước mô tả mục 2.3.1 Kết trình bày hình 3.8 1.6 Hàm lượng (mg/g) 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Mẫu thử Hình 3.8 Hàm lượng apigenin mẫu dịch chiết Nhận xét: Acid citric khơng có khả thủy phân flavonoid từ Cần tây thành apigenin Khi thủy phân cao ethanol betain acid citric betain cho hàm lượng apigenin cao 10 lần so với acid citric Tuy nhiên, kết thủy phân với DES cho hàm lượng apigenin cao 29 Sử dụng dung môi eutectic betain - acid citric, hàm lượng apigenin thu chiết DES cao rõ rệt so với cao chiết ethanol Điều giải thích khả chiết xuất ethanol so với hệ dung mơi DES [49], lượng hoạt chất tham gia phản ứng thủy phân hệ eutectic/ethanol so với hệ eutectic Vì hàm lượng apigenin hệ eutectic/ethanol Trong số hệ DES khảo sát, hệ betain - acid citric cho hiệu suất chiết xuất apigenin cao hệ betain - acid acetic cho hàm lượng apigenin thấp Như vậy, yếu tố thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân dung mơi eutectic có ảnh hưởng đến q trình thủy phân dịch chiết Cần tây lượng nước hệ dung môi không ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng apigenin thu Từ kết khảo sát trên, quy trình thủy phân dịch chiết Cần tây xây dựng với điều kiện sau: - Thời gian thủy phân: 30 phút Nhiệt độ thủy phân: 100◦C Nồng độ acid citric: 0,5M Dung môi eutectic: Hệ dung môi betain - acid citric tỷ lệ 1:1 3.4 Bàn luận 3.4.1 Về việc chiết xuất apigenin từ Cần tây Trong năm gần đây, xu hướng chiết xuất lên lựa chọn dung môi thân thiện với môi trường cho quy trình chiết xuất thơng thường Các đặc tính lý tưởng dung mơi xanh bao gồm độc tính thấp, khơng bắt lửa, ổn định, khơng gây đột biến dễ điều chế Ngồi ra, dung mơi xanh phải có chi phí thấp, xử lý đơn giản tái sử dụng Những dung mơi thân thiện với môi trường để khơng đáp ứng nhu cầu phản ứng hóa học cần thiết mà tuân thủ hướng dẫn quy định liên quan đến ô nhiễm môi trường [62] Trong lĩnh vực chiết xuất, loại dung môi gọi dung môi eutetic (DES) xuất công cụ hứa hẹn nhiều triển vọng So với dung môi hữu thông thường, DES thu hút ý đáng kể thực tế chúng không thân thiện với môi trường, không độc hại hợp chất hữu phân hủy sinh học mà cịn có chi phí thấp, dễ điều chế phịng thí nghiệm [57] Các kỹ thuật thông thường để thu flavonoid, chẳng hạn đun nóng, đun sơi hồi lưu, thường địi hỏi thời gian chiết xuất dài nhiệt độ chiết xuất cao Do đó, nhiều cơng nghệ chiết xuất phát triển để tách flavonoid khỏi thực vật Chiết xuất có 30 hỗ trợ siêu âm biết đến phương pháp nhanh chóng hiệu để chiết xuất flavonoid từ thực vật [58] Ngoài ra, cần dung mơi gây ô nhiễm so với phương pháp truyền thống nên coi thân thiện với môi trường [17] Bên cạnh đó, dung mơi eutectic phù hợp với q trình chiết xuất siêu âm có số điện môi cao dung môi hữu thơng thường hấp thụ nhiều lượng hơn, điều mang lại hiệu suất chiết xuất tốt tiết kiệm lượng trình chiết xuất [10] Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm thay rẻ tiền đơn giản cho kỹ thuật chiết xuất truyền thống Trong nghiên cứu này, hệ betain - acid citric tỷ lệ 1:1 ứng dụng để chiết apigenin từ Cần tây với hỗ trợ sóng siêu âm nhiệt độ thường Các điều kiện ảnh hưởng đến q trình chiết xuất tối ưu hóa để thu dịch chiết Cần tây với hàm lượng apigenin cao Để xác định điều kiện chiết xuất tối ưu cách nhanh chóng, xác, phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) bề mặt đáp ứng (RSM) áp dụng giúp rút ngắn thời gian khảo sát tiết kiệm chi phí cho nghiên cứu Từ kết khảo sát phân tích ảnh hưởng yếu tố thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi/dược liệu, hàm lượng nước hệ dung mơi eutectic, quy trình chiết xuất apigenin Cần tây xây dựng hồn chỉnh Quy trình đơn giản, dễ thực hiện, không gây độc người thân thiện với mơi trường Ngồi ra, quy trình chiết xuất đề tài nghiên cứu cịn có khác biệt so với quy trình chiết sử dụng dung môi DES để chiết apigenin tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng [49] tiến hành nhiệt độ phòng với hỗ trợ sóng siêu âm Việc khơng gia nhiệt giúp cho quy trình đơn giản hơn, dễ kiểm sốt hơn, giúp tiết kiệm lượng, phịng tránh cháy nổ có giá trị kinh tế công nghiệp 3.4.2 Về việc thủy phân dịch chiết Cần tây Quả Cần tây giàu flavon glycosid, đặc biệt apigenin 7-O-apiosylglucosid (apiin) Bởi hấp thụ flavonoid glycosid ruột thay đổi tùy theo aglycon đường nhóm chức khác gắn vào, q trình glycosyl hóa flavon xác định vị trí hiệu hấp thụ chúng Tương tự flavonoid khác, flavon glucosid bị thủy phân β-glucosidase ruột hấp thụ ruột non Tuy nhiên, flavonoid glycosid với gốc disaccharid malonyl có khả kháng β-glucosidase ruột cao so với glucosid đơn giản chúng nên hạn chế sinh khả dụng chúng [47] Ngồi ra, so với glycosid nó, apigenin báo cáo có hoạt tính sinh học mạnh 31 đặc tính chống viêm [17] chống oxy hóa [31] Vì vậy, việc chiết xuất apigenin Cần tây dạng aglycon giúp cải thiện sinh khả dụng hợp chất Các quy trình chiết xuất flavonoid từ Cần tây đa số tập trung chiết xuất glycosid toàn phần mà chưa chuyển dạng glycosid thành dạng aglycon Trong nghiên cứu này, dịch chiết Cần tây thu nhờ hỗ trợ sóng siêu âm tiến hành phản ứng thủy phân để chuyển dạng glycosid thành dạng aglycon Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân khảo sát pháp thay đổi yếu tố (OFAT) bao gồm nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, hàm lượng nước, dung môi eutectic Kết cho thấy nhiệt độ thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hàm lượng apigenin thu lượng nước không ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng apigenin Nhiệt độ thủy phân cho hàm lượng apigenin cao 100◦C tiệm cận với nhiệt độ sôi nước nên điều kiện nhiệt độ 100◦C lựa chọn tối ưu Lượng nước không ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng apigenin lượng nước nhiều dẫn đến khó khăn q trình xử lý dịch chiết cịn lượng nước q khó thao tác khuấy trộn trình đun hồi lưu Do vậy, nồng độ acid citric 0,5 M lựa chọn Từ kết khảo sát hệ dung môi cho thấy acid citric khơng có khả thủy phân flavonoid từ Cần tây thành apigenin Trong hệ dung môi khảo sát, thủy phân cao ethanol betain acid citric betain cho hàm lượng apigenin cao 10 lần so với acid citric Tuy nhiên, kết thủy phân hệ eutectic betain – acid citric cho hàm lượng apigenin cao Trong nghiên cứu tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng sự, cao đặc giàu apigenin luteolin từ Cần tây chiết xuất dung môi DES [49] Trong hệ DES khảo sát hệ có thành phần betain propylen glycol có tỷ lệ 1:8 có khả chiết xuất tốt nhất, điều kiện ảnh hưởng đến trình chiết xuất tối ưu hóa để thu hàm lượng apigenin cao lớn tương ứng 0,1532 mg/g Khi so sánh với quy trình chiết xuất tác giả Nguyễn Thu Hằng cộng sự, kết cho thấy, hàm lượng apigenin nghiên cứu 1,6664 mg/g, cao khoảng 10,8 lần Như vậy, hiệu suất chiết xuất apigenin tăng lên đáng kể 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: Đã tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất apigenin từ Cần tây bao gồm: thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi/dược liệu, hàm lượng nước hệ dung môi phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Từ lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu sau: - Thời gian chiết xuất: 25 phút - Hàm lượng nước hệ dung môi: 33% - Lượng dung môi sử dụng: 25 ml/g nguyên liệu Đã tiến hành thủy phân dịch chiết Cần tây khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân dịch chiết Cần tây bao gồm: thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân, lượng nước, dung môi eutectic Kết cho thấy thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân dung mơi eutectic có ảnh hưởng đến trình thủy phân dịch chiết Cần tây lượng nước hệ dung mơi khơng ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng apigenin thu Từ lựa chọn điều kiện thủy phân sau: - Thời gian thủy phân: 30 phút Nhiệt độ thủy phân: 100◦C Nồng độ acid citric: 0,5M Dung môi eutectic: Hệ dung môi betain - acid citric tỷ lệ 1:1 ĐỀ XUẤT Nghiên cứu chế phản ứng thủy phân apiin thành apigenin dung môi eutectic 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, tập 2, tr.1102-1103 Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thu Hằng (2016), “Đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau hạt cần tây động vật thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 56(10), tr.24-27 Nguyễn Thu Hằng cộng (2014), “Định lượng flavonoid toàn phần hạt cần tây phương pháp đo quang”, Tạp chí Nghiên cứu Dược thông tin thuốc, 8(4), tr.25-28 Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân (2014), “Nghiên cứu ảnh hưởng in vitro dịch chiết hạt cần tây ngưng tập tiểu cầu q trình đơng máu”, Tạp chí Nghiên cứu Dược thơng tin thuốc, 5(1), tr.25-28 Viện dược liệu (2004), “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2”, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.566 Tiếng Anh Abranches Dinis O., and João AP Coutinho (2022), "Type V deep eutectic solvents: Design and applications", Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry, pp.100612 Ahluwalia Vinod K., et al (1988), "Furanocoumarin glucosides from the seeds of Apium graveolens", Phytochemistry, 27(4), pp.1181-1183 Ahn-Jarvis J H., Parihar A., Doseff A I (2019), “Dietary flavonoids for immunoregulation and cancer: food design for targeting disease”, Antioxidants, 8, pp.202 Al Aboody, Mohammed Saleh (2021), "Cytotoxic, antioxidant, and antimicrobial activities of Celery (Apium graveolens L.)", Bioinformation, 17(1), pp.147 10 Ali Khoddami, Meredith A Wilkes, and Thomas H Roberts, “Techniques for analysis of plant phenolic compounds”, Molecules, 2013, 18, pp.2328–2375 11 Baananou Sameh, et al (2013), "Antiulcerogenic and antibacterial activities of Apium graveolens essential oil and extract", Natural product research, 27(12), pp.1075-1083 12 Beier R C., et al (1983), "HPLC analysis of linear furocoumarins (psoralens) in healthy celery (Apium graveolens)", Food and Chemical Toxicology, 21(2), pp.163165 13 Boonruamkaew, Phetcharat, et al (2017), "Apium graveolens extract influences mood and cognition in healthy mice", Journal of natural medicines, 71, pp 492-505 14 Bubalo Marina Cvjetko, et al (2016), "Green extraction of grape skin phenolics by using deep eutectic solvents", Food Chemistry, 200, pp.159-166 15 Cherng Jaw-Ming, Wen Chiang, et al (2008), "Immunomodulatory activities of common vegetables and spices of Umbelliferae and its related coumarins and flavonoids", Food chemistry, 106(3), pp.944-950 16 de Araújo M E M B., Moreira Franco Y E., et al (2013), “Enzymatic deglycosylation of rutin improves its antioxidant and antiproliferative activities”, Food Chem, 141, pp.266–273 17 Denis Nchang Che, et al (2020), "Anti‐atopic dermatitis effects of hydrolyzed celery extract in mice", Journal of food biochemistry, 44(6), pp.13198 18 Denis Nchang Che, et al (2021), "Citric acid and enzyme‐assisted modification of flavonoids from celery (Apium graveolens) extract and their anti‐inflammatory activity in HMC‐1.2 cells", Journal of Food Biochemistry, 45(7), pp.13774 19 El Achkar Tracy, et al (2021), "Basics and properties of deep eutectic solvents: a review", Environmental chemistry letters, 19, pp.3397-3408 20 Faezeh Tashakori-Sabzevar, Masoud Ramezani, et al (2016), "Protective and hypoglycemic effects of celery seed on streptozotocin-induced diabetic rats: experimental and histopathological evaluation", Acta diabetologica, 53, pp.609-619 21 Freischmidt A., Untergehrer M., et al (2015), “Quantitative analysis of flavanones and chalcones from willow bark”, Die Pharmazie - An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 70, pp.565–568 22 Gao Lin-Lin, et al (2014), "Inhibition Effects of Celery Seed Extract on Human Stomach Cancer Cell Lines Hs746T", Frontier and Future Development of Information Technology in Medicine and Education, pp.2553-2560 23 Gregory L Hostetler, Ken M Riedl, and Steven J Schwartz (2013), "Effects of food formulation and thermal processing on flavones in celery and chamomile", Food chemistry, 141(2), pp.1406-1411 24 Han Dandan, Kyung Ho Row (2011), "Determination of luteolin and apigenin in celery using ultrasonic‐assisted extraction based on aqueous solution of ionic liquid coupled with HPLC quantification", Journal of the Science of Food and Agriculture, 91(15), pp.2888-2892 25 Haselmair-Gosch C., Miosic S., et al (2018), “Great cause—small effect: undeclared genetically engineered orange petunias harbor an inefficient dihydroflavonol 4-reductase”, Frontiers in Plant Science, 9, pp.149 26 Huang Jingqun, et al (2011), "Effects of genistein, apigenin, quercetin, rutin and astilbin on serum uric acid levels and xanthine oxidase activities in normal and hyperuricemic mice", Food and Chemical Toxicology, 49(9), pp.1943-1947 27 Iraj Javadi, et al (2015), "Protective effects of celery (Apium graveloens) seed extract on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats", Journal of Babol University of Medical Sciences, 17(1), pp.70-76 28 Jablonský Michal, et al (2019), "Use of deep eutectic solvents in polymer chemistry–a review", Molecules, 24(21), pp.3978 29 Jae Young Shin, et al 2019, "Anti‐inflammatory effect of hydrolyzed celery leaves extract in murine primary splenocyte", Journal of food biochemistry, 43(9), pp.12970 30 Jianfeng L (2016), “Celery seed extract, preparation and preparation method thereof”, Patent Number CN106474169 31 Jun Hu, et al (2018), "Antioxidant and anti-inflammatory flavonoids from the flowers of Chuju, a medical cultivar of Chrysanthemum morifolim Ramat", Journal of the Mexican Chemical Society, 61(4), pp.282-289 32 Kooti Wesam, and Nahid Daraei (2017), "A review of the antioxidant activity of celery (Apium graveolens L)", Journal of evidence-based complementary & alternative medicine, 22(4), pp.1029-1034 33 Kooti Wesam, et al (2015), "A review on medicinal plant of Apium graveolens", Advanced Herbal Medicine, 1(1), pp.48-59 34 Li Meng-Yao, et al (2018), "Advances in the research of celery, an important Apiaceae vegetable crop", Critical Reviews in Biotechnology, pp.172-183 35 Li Xiaoxia, and Kyung Ho Row (2016), "Development of deep eutectic solvents applied in extraction and separation", Journal of separation science, 39(18), pp.3505-3520 36 Liu Yang, et al (2018), "Natural deep eutectic solvents: properties, applications, and perspectives", Journal of natural products, 81(3), pp.679-690 37 Long-Ze Lin, Shengmin Lu, and James M Harnly (2007), "Detection and quantification of glycosylated flavonoid malonates in celery, Chinese celery, and celery seed by LC-DAD-ESI/MS", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(4), pp.1321-1326 38 Lu Zhan Guo, et al (2011), “Chemical composition and ability of scavenging DPPH radical of essential oil and residue from the celery seed”, Advanced Materials Research, 183, pp.18-21 39 Madhavi Doddabele, et al (2013), "A pilot study to evaluate the antihypertensive effect of a celery extract in mild to moderate hypertensive patients", Age , 57(10), pp.1-3 40 Mansi Kamal, et al (2009), "Hypolipidemic effects of seed extract of celery (Apium graveolens) in rats", Pharmacognosy magazine, 5(20), pp.301-305 41 Marongiu B, et al (2013), "Isolation of the volatile fraction from Apium graveolens L.(Apiaceae) by supercritical carbon dioxide extraction and hydrodistillation: Chemical composition and antifungal activity", Natural product research, 27(17), pp.1521-1527 42 Mazimba Ofentse (2017), "Umbelliferone: Sources, chemistry and bioactivities review", Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, 55(2), pp.223-232 43 Michael GL Hertog, Peter CH Hollman, and Dini P Venema (1992), "Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(9), pp.15911598 44 Mohamad Shazeli Che Zain, et al (2020), "Ultrasound-assisted extraction of polyphenolic contents and acid hydrolysis of flavonoid glycosides from oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) leaf: Optimization and correlation with free radical scavenging activity", Processes, 8(12), pp.1540 45 Mohammad Chand Ali, et al (2019), "Effective extraction of flavonoids from Lycium barbarum L fruits by deep eutectic solvents-based ultrasound-assisted extraction", Talanta, 203, pp.16-22 46 Moussa-Ayoub T.E., et al (2011), “Identification and quantification of flavonol aglycons in cactus pear (Opuntia ficus indica) fruit using a commercial pectinase and cellulase preparation”, Food Chem, 124, pp.1177–1184 47 Né meth K et al (2003), “Deglycosylation by small intestinal epithelial cell βglucosidase is critical step in absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in humans”, European Journal of Nutrition, 42, pp.29-42 48 Nguyen Thu Hang, et al (2014), “Pharmacognostic Study of Apium graveolens L Seeds”, J.Med.Mater, 19(3), pp.173-177 49 Nguyen Thu Hang, et al (2022),"Green extraction of apigenin and luteolin from celery seed using deep eutectic solvent", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 207, pp.114406 50 Nguyen Thuy Duong, et al (2014), “Anti-hyperuricemic effects and inhibitory activity of liver xanthine oxidase by apium gra violens seeds in potassium oxonatepretreated mice”, Journal of Medicinal Materials, 19(5), pp.303-306 51 Nuutila A.M., Kammiovirta K., Oksman-Caldentey K.M (2002), “ Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis”, Food Chem, 76, pp.519–525 52 Pisano Pablo L., et al (2018), "Structural analysis of natural deep eutectic solvents Theoretical and experimental study", Microchemical Journal, 143, pp.252-258 53 Powanda, Michael C, Whitehouse, et al (2015), “ Celery seed and related extracts with antiarthritic, antiulcer, and antimicrobial activities”, Novel natural products: therapeutic effects in pain, arthritis and gastro-intestinal diseases, pp.133-153 54 Promila Sharan and Sushila Singh (2018), “Applications of green solvents in extraction of phytochemicals from medicinal plants: A review”, The Pharma Innovation, 7(3), pp 238-245 55 Ramezani Mina, et al (2009), "Antinociceptive and anti-inflammatory effects of isolated fractions from Apium graveolens seeds in mice", Pharmaceutical biology, 47(8), pp.740-743 56 Ruesgas-Ramon mariana, Figueroa-Esoinoza maria Cruz, et al (2017), “Application of deep eutactic solvents (DES) for phenolic compunds extraction: overview, challenges, and opportunities”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(18), pp.3591-3601 57 Sara C Cunha, José O Fernande (2018), “Extraction techniques with deep eutectic solvents”, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 105, pp.225-239 58 Shang Xianchao, et al (2018), "Environmentally-friendly extraction of flavonoids from Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja leaves with deep eutectic solvents and evaluation of their antioxidant activities", Molecules, 23(9), pp.2110 59 Shaopeng Li, et al (2019), "Anti‑gouty arthritis and anti‑hyperuricemia properties of celery seed extracts in rodent models", Molecular medicine reports, 20(5), pp.4623-4633 60 Smith Emma L., et al (2014), "Deep eutectic solvents (DESs) and their applications", Chemical reviews, 114(21), pp.11060-11082 61 Sowbhagya H B (2014), "Chemistry, technology, and nutraceutical functions of celery (Apium graveolens L.): an overview", Critical reviews in food science and nutrition, 54(3), pp.389-398 62 Thenrajan Raja Sekharan, et al (2021), “Neoteric solvents for the pharmaceutical industry: an update”, Drug Discov Today, 26(7), pp 1702-1711 63 Tian X.-J., Yang X.-W., et al (2009), “Studies of intestinal permeability of 36 flavonoids using Caco-2 cell monolayer model”, International Journal of Pharmaceutics, 367, 58–64 64 Yuan-Yuan Zang, et al (2020), "One-pot preparation of quercetin using natural deep eutectic solvents", Process Biochemistry, 89, pp.193-198 65 Yuntao Dai, et al (2016), "Application of natural deep eutectic solvents to the extraction of anthocyanins from Catharanthus roseus with high extractability and stability replacing conventional organic solvents", Journal of Chromatography A , 1434, pp.50-56 66 Zhang Qian, et al (2011), "Optimization of ultrasonic‐assisted enzymatic hydrolysis for the extraction of luteolin and apigenin from celery", Journal of food science, 76(5), pp.680-685 67 Zhou Kailan, Zhao Feng, et al (2009), “Triterpenoids and flavonoids from celery (Apium graveolens)”, Journal of natural products, 72(9), pp 1563-1567 68 Zobel Alicja M., et al (1991), "Identification of eight coumarins occurring with psoralen, xanthotoxin, and bergapten on leaf surfaces", Journal of chemical ecology, 17, pp.1859-1870