Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng nhuận tẩy của quả Bồ kết quả nhỏ (Fructus Gleditsiae australis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - TRẦN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG NHUẬN TẨY CỦA QUẢ BỒ KẾT QUẢ NHỎ (Fructus Gleditsiae australis) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - TRẦN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG NHUẬN TẨY CỦA QUẢ BỒ KẾT QUẢ NHỎ (Fructus Gleditsiae australis) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực đồng nghiệp gia đình Trước hết tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học, thầy cô giáo, kỹ thuật viên môn Dược học cổ truyền, Thực vật, Dược liệu môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển người thầy tận tình hướng dẫn, ln quan tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cám ơn PGS.TS Nguyễn Thùy Dương – Phó trưởng mơn Dược lực Ths Nghiêm Đức Trọng – môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi nghiên cứu hồn thành luận văn Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, tơi muốn gửi tới gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp người bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2019 DS Trần Văn Thành MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI GLEDITSIA 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1.Vị trí phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.1.3 Phân bố 1.1.1.4 Đặc điểm số loài thuộc chi Gleditsia 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng công dụng 1.1.3.1 Công dụng dân gian 1.1.3.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học số loài Gleditsia 14 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY BỒ KẾT QUẢ NHỎ 16 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 16 1.2.2 Thành phần hóa học 17 1.2.3 Tác dụng sinh học công dụng 17 1.2.3.1 Công dụng dân gian 17 1.2.3.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 19 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 21 2.1.2.1 Hóa chất dung mơi 21 2.1.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 21 2.1.3 Động vật thí nghiệm 22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 22 2.2.1.1 Nghiên cứu hình thái 22 2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 23 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 23 2.2.2.1 Định tính……………………………………………… ……22 2.2.2.2 Định lượng số chất Bồ kết 31 2.2.3 Đánh giá độc tính cấp tác dụng nhuận tẩy qua đường trực tràng 35 2.2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.2.3.2 Động vật thí nghiệm 36 2.2.3.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá độc tính cấp theo đường thụt trực tràng 36 2.2.3.4 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng nhuận tẩy theo đường trực tràng 37 2.2.3.5 Theo dõi, đánh giá kết 38 2.3.PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ XỬ LÝ KẾT QUẢ 38 CHƯƠNG III KẾT QUẢ 64 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 64 3.1.1 Đặc điểm hình thái: 64 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 67 3.1.2.1 Mô tả vi phẫu thân 67 3.1.2.2 Mô tả vi phẫu gai 68 3.1.2.3 Mô tả vi phẫu 69 3.1.2.4 Mô tả vi phẫu 70 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 71 3.2 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 72 3.2.1 Định tính 72 3.2.1.1 Định tính phản ứng hóa học 72 3.2.2 Định lượng Vitexin Bồ kết 77 3.2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 77 3.2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng Vitexin Bồ kết theo tiêu chuẩn AOAC 79 3.3 THỬ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC ……………………………………………………………………… 89 3.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao Bồ kết đường thụt trực tràng 89 3.3.1.1.Thử nghiệm thăm dò 89 3.3.1.2.Thử nghiệm thức 89 3.3.1.3 Kết luận Error! Bookmark not defined CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 94 4.1 VỀ THỰC VẬT 94 4.2 VỀ HÓA HỌC 94 4.3 VỀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 95 KẾT LUẬN .Error! Bookmark not defined Về thực vật 98 Về hóa học 98 Về thử độc tính cấp nghiên cứu tác dụng sinh học………………….97 KIẾN NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số máy móc sử dụng nghiên cứu Phụ lục 2: Tiêu thực vật Bồ kết nhỏ - Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl Phụ lục 3: Chất đối chiếu Vitexin Phụ lục 4: Sắc kí đồ HPLC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT COX Cyclooxygenase D/c Dịch chiết Dd Dung dịch DĐVN Dược điển Việt nam EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol HIV Human immunodeficiency virus HPLC High Performance Liquid Chromatography HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IL Interleukin LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol PGE2 Prostaglandin thụ thể E2 TĐ Tương đương TLC Thin Layer Chromatography TPHH Thành phần hóa học TT Thuốc thử UV Ultra Violet DANH SÁCH CÁC BẢNG STT Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Dãy dung dịch đối chiếu khảo sát độ tuyến tính 31 Bảng 3.1 Kết định tính sơ nhóm chất 73 Bồ kết Bảng 3.2 Kết sắc kí lớp mỏng 75 Bảng 3.3 Chương trình gradient nồng độ hệ dung mơi 79 khai triển Bảng 3.4 Khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 80 Bảng 3.5 Kết đo diện tích pic mẫu Vitexin 82 Bảng.3.6 Dung dịch đối chiếu để xác định độ 83 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ 84 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 85 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác trung gian 86 10 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ xác trung gian 86 mẫu thử 11 Bảng 3.11 Khảo sát chất đối chiếu trước định lượng 88 12 Bảng 3.12 Kết xác định hàm lượng Vitexin 88 Bồ kết 13 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm tác dụng nhuận tẩy 92 cao chiết Bồ kết qua đường trực tràng 14 Bảng 3.14 Các thông số thống kê số lần tiết phân 94 15 Bảng 3.15 Kết thống kê thử nghiệm tác dụng nhuận 94 tẩy SPSS16 DANH SÁCH CÁC HÌNH STT Tên hình ảnh Trang Hình 1.1(a) Một số hợp chất có chi Gleditsia Hình 1.1(b) Một số hợp chất có chi Gleditsia Hình 1.2 Cấu trúc 19 saponin phân lập từ lồi Gleditsia sinensis Hình 1.3 Cây Bồ kết nhỏ Gleditsia australis 17 Hình 2.1 Hệ thống chấm sắc ký lớp mỏng CAMAG 29 LINOMAT Hình 2.2 Máy HPLC – UV SHIMADZU Nhật Bản 30 Hình 3.1 Thân cành mang hoa Bồ kết 64 (Gleditsia australis) thực địa Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái Bồ kết 65 Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái hoa Bồ kết 66 10 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái Bồ kết 67 11 Hình 3.5 Vi phẫu thân Bồ kết (Gleditsia australis) 67 12 Hình 3.6 Vi phẫu gai Bồ kết (Gleditsia australis) 68 13 Hình 3.7 Vi phẫu Bồ kết (Gleditsia australis) 69 14 Hình 3.8 Vi Phẫu Bồ kết (Gleditsia australis) 70 15 Hình 3.9 Đặc điểm bột Bồ kết (Fructus Gleditsiae 71 australis) 16 Hình 3.10 Sắc kí đồ HPTLC 76 17 Hình 3.11 Phân tích sắc kí đồ hệ thống HPTLC 77 phần mềm VideoScan 18 Hình 3.12 Số lượng pic săc kí đồ chất đối chiếu 77 Vitexin (A) Bồ kết (B) 19 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu Vitexin với điều 79 kiện khảo sát 20 Hình 3.14 Sắc ký đồ dược liệu Bồ kết với điều kiện 79 sắc ký khảo sát 21 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng (a), mẫu đối chiếu 81 (b), mẫu thử (c) mẫu thử thêm đối chiếu (d) 22 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ 83 (mg/ml) diện tích pic (mAU.s) Vitexin 23 Hình 3.17 Giới hạn phát (LOD) Vitexin 87 Sắc kí đồ thử độ tuyến tính nồng độ C100 Sắc kí đồ thử độ tuyến tính nồng độ C120 Sắc kí đồ thử độ tuyến tính nồng độ C150 Sắc kí đồ thử độ thêm 10% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 10% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 10% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 20% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 20% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 20% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 30% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 30% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ thêm 30% chuẩn – lần Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ lặp lại thử Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 1) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 2) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 3) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 4) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 5) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – chuẩn (lần 6) Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – mẫu thử Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – mẫu thử Sắc kí đồ thử độ xác trung gian – mẫu thử Sắc kí đồ định lượng cao Bồ kết – mẫu thử Sắc kí đồ định lượng cao Bồ kết – mẫu thử Sắc kí đồ định lượng cao Bồ kết – mẫu thử ... Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Vang (Caesalpinioideae) Chi Gleditsia [12],[15],[18] 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Chi Gleditsia chủ... kết vừa mọc hoang dại vừa trồng khắp nơi Cây thường thấy số tỉnh Hải Phòng, Quảng Ninh, Hà Nam, Thanh Hóa, Nghệ An, Ở Tây Nguyên, bồ kết trồng để tạo bóng chắn gió cho Cà phê Cây trồng nhiều... O OH O OH O HO OH OH Is oquercetin Hình 1.1(a) Một số hợp chất có chi Gleditsia Pentahydroxy flavanone Luteolin-7-O-glucoside 3-O-trans-pcoumaroyl alphitolic acid 2-hydroxypyracrenic acid Hình1.1(b)