Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẠC CẦM MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA LÁ CÂY HỒNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẠC CẦM MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA LÁ CÂY HỒNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Vũ Văn Điền Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Những sự quan tâm giúp đỡ quý báu đó đã góp phần giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Văn Điền, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và cho tôi nhiều lời khuyên quý báu. Thầy đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền đã luôn giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm tại Bộ môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Cao Văn Thu (Bộ môn Vi sinh – Sinh học) và TS. Nguyễn Quốc Huy (Bộ môn Thực vật), những người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong công việc, đồng thời cũng là nguồn động viên khích lệ tinh thần giúp tôi cố gắng hoàn thành tốt khóa luận của mình. Do hạn chế về thời gian và phạm vi đề tài, kết quả nghiên cứu của tôi mới chỉ là bước đầu, đồng thời trong quá trình thực hiện khó tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những góp ý của thầy cô và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Bạc Cầm My MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.2. Thành phần hóa học 5 1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 8 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11 2.2. Nội dung nghiên cứu 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu 14 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng 16 3.1.1. Đặc điểm hình thái 16 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu 17 3.1.3. Đặc điểm bột lá 19 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng 20 3.2.1. Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 20 3.2.2. Chiết xuất, định tính và định lượng các phân đoạn 28 3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng 42 3.3.1. Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần 42 3.3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của phân đoạn chloroform và ethyl acetat 45 3.4. Bàn luận 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AST Ánh sáng thường D. Diospyros EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập từ lá Hồng đối với một số chủng vi sinh vật 9 2 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng 27 3 Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 31 4 Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 32 5 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao lỏng toàn phần các nồng độ 1:1, 1:2, 1:4 44 6 Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 phân đoạn chloroform và ethyl acetat 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang 1 Hình 1.1. Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây 4 2 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 14 triterpenoid phân lập từ lá Hồng 6 3 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá Hồng 7 4 Hình 3.1. Cành mang lá cây Hồng 16 5 Hình 3.2. Hình thái lá cây Hồng 16 6 Hình 3.3. Ảnh chụp vi phẫu gân lá Hồng 17 7 Hình 3.4. Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Hồng 18 8 Hình 3.5. Đặc điểm bột dược liệu lá Hồng 19 9 Hình 3.6. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Hồng 30 10 Hình 3.7. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng với hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1) 34 11 Hình 3.8. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 35 12 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng với hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1) 37 13 Hình 3.10. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 38 14 Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat với hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (9:6:1) 40 15 Hình 3.12. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 41 16 Hình 3.13. Sơ đồ sắp xếp khoanh giấy lọc các mẫu thử hoạt tính kháng khuẩn 43 17 Hình 3.15. Vòng vô khuẩn của mẫu thử phân đoạn chloroform và ethyl acetat với vi khuẩn Bacillus pumilus và Shigella flexneri 46 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Hồng (Diospyros kaki L.f.) là một loài cây thuộc họ Thị (Ebenaceae), có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, sau đó du nhập vào Việt Nam [10]. Hồng là một nguồn cung cấp phong phú các acid amin, carotenoid, flavonoid, protein, vitamin…[29] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chứng minh các chất phân lập từ lá Hồng có nhiều tác dụng sinh học quan trọng như tác dụng hạ huyết áp [18], kháng khuẩn, chống ung thư [11], chống viêm, hạ lipid máu [29], chống oxy hóa [23]… Điều này cho thấy tiềm năng phát triển lớn của dược liệu này. Ở Việt Nam, cây Hồng được trồng chủ yếu để làm cây ăn quả. Một số bộ phận của cây được dùng làm thuốc như tai Hồng (Thị đế), nước ép từ quả Hồng (Thị tất), chất đường từ quả Hồng (Thị sương) [6]… Lá Hồng cũng được sử dụng làm lá trà để chữa bệnh tăng huyết áp. Tuy nhiên, việc sử dụng lá Hồng làm thuốc mới chỉ dừng lại ở kinh nghiệm dân gian, chưa có cơ sở khoa học chứng minh tác dụng và hướng dẫn sử dụng loại dược liệu này. Các tài liệu của Việt Nam về lá Hồng còn rất hạn chế, chủ yếu là thông tin về đặc điểm hình thái thực vật. Với mục đích cung cấp cái nhìn tổng quát về thực vật, hóa học và sinh học cho dược liệu lá Hồng, đặt cơ sở bước đầu cho những nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát huy hết tiềm năng của dược liệu này, chúng tôi tiến hành xây dựng đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng” với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng. 3. Thử hoạt tính kháng khuẩn của lá cây Hồng. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật 1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros Cây Hồng có tên khoa học là Diospyros kaki L.f., tên đồng nghĩa: Diospyros chinensis Blume, là một loài thuộc chi Diospyros. Cây còn có các tên gọi khác như thị đinh, mác pháp (Tày)… Tên nước ngoài: Kaki – persimmon, Japanese persimmon (Anh); kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier du Japon, coing de Chine (Pháp) [10], Shi Zi (Trung Quốc) [19]. Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 1987 [1],[6], [24], vị trí phân loại của chi Diospyros được tóm tắt như sau: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dilleniidae) Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae) Bộ Thị (Ebenales) Họ Thị (Ebenaceae) Chi Diospyros 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Diospyros 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường xanh. Lá mọc so le, nguyên [7]. Thỉnh thoảng có các vết mờ rải rác hoặc các vết rỗ lớn [22]. Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lưỡng tính. Hoa đực mọc thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thường kết hợp thành 2 vòng xoắn. Hoa cái thường đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lép 1-16 hoặc không có; bầu thường có 2 ô. Đài hoa thường có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống, 3-7 thùy, rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường hẹp theo bề ngang [22]. 3 1.1.2.2. Phân bố Chi Diospyros là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (ở châu Á có tới 200 loài) và một số nơi thuộc khu vực ôn đới, trong đó đa dạng nhất ở khu vực Đông và Đông Nam Á, chỉ có một số loài ở Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [24]. Trung Quốc có 60 loài, nhiều nhất ở Đông Nam và Tây Nam Trung Quốc [22]. Ở nước ta, đã thống kê được 70 loài [7], 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, 2 loài có quả ăn được là Hồng (D.kaki) và Cậy (D.lotus) [10]. 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Diospyros kaki L.f. 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật Cây gỗ lớn cao tới 15m. Lá mọc so le; có cuống ngắn, dài không quá 1 cm. Phiến lá thuôn hình trứng hoặc trái xoan, dài 6 – 18 cm, rộng 3 – 9 cm, đầu có mũi lồi ngắn, gốc lá nhọn dần, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có lông tơ, mép nguyên hay hơi lượn sóng. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, màu vàng nhạt. Cây đực, cây cái riêng biệt hoặc có khi hoa đực, hoa cái có trên cùng một cây. Hoa đực tụ họp thành xim 3 hoa ở nách lá, có 2 lá bắc, 14-24 nhị thường là 16. Hoa cái mọc đơn độc, đài xẻ 5 thùy, bầu có 4 vòi nhụy và 4 ô, thường có vách giả chia làm 8 ngăn [8], [10], [22]. Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, nhẵn, phẳng hoặc có sống dọc, mang đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ. Hạt dẹt, màu nâu vàng hoặc nâu đen. (Hình 1.1) Mùa hoa: tháng 3 – 7, mùa quả: tháng 8 – 10 [10]. 1.1.3.2. Phân bố Diospyros kaki L.f. loài nguyên sản ở Nhật Bản và Trung Quốc, sau được du nhập sang các nước Đông Nam Á khác như ở vùng Bắc Thái Lan, đảo Java, Sumatra (Indonesia); Malaysia. Ở Italia, Israel, Brazil, Mỹ (California) cũng có trồng loài hồng này. Ở Việt Nam, D. kaki là loài hồng được trồng phổ biến. Đây là cây ăn quả lâu đời ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra. Cây thường trồng ở vườn nhà, vườn [...]... nối với máy vi tính có cài đặt phần mềm WinCATS, VideoScan Các dụng cụ, thiết bị thuộc bộ môn Dược học cổ truyền và một số bộ môn khác, trường Đại học Dược Hà Nội 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây Hồng 14  Mô tả đặc điểm hình thái lá nghiên cứu  Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột lá Hồng 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Hồng  Định tính các nhóm chất... phản ứng hóa học  Chiết xuất, định tính và định lượng một số phân đoạn 2.2.3 Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng  Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần đối với 5 chủng vi khuẩn Gram (-) và 5 chủng vi khuẩn Gram (+)  Thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết các phân đoạn chloroform và ethyl acetat đối với các chủng vi khuẩn trên 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu về thực vật... có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học của lá cây Hồng 1.3 Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 1.3.1 Tác dụng hạ huyết áp Lá Hồng đã được sử dụng như một bài thuốc dân gian để điều trị bệnh tăng huyết áp tại nhiều nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…[29] Flavonoid từ lá Hồng có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin theo cách phụ thuộc vào liều [10] Tại Nhật Bản, tác dụng. .. TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là lá cây Hồng trơn được thu hái tại xã Yên Mỹ, huyện Thanh Trì, Hà Nội vào tháng 10 năm 2013 và tháng 5 năm 2014 Mẫu được thu hái và xử lý như sau:  Mẫu cành mang lá và quả tươi dùng để giám định tên khoa học  Mẫu lá tươi được rửa sạch, dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái và vi... phẫu  Mẫu lá khô: Lá được rửa sạch, phơi se, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô - Một phần mẫu được tán mịn, dùng để nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu - Phần mẫu còn lại được xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát, dùng để chiết xuất nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn Mẫu nghiên cứu được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược... hiển vi Nhận biết các đặc điểm theo tài liệu [4]  Nghiên cứu đặc điểm bột lá Soi bột lá dưới kính hiển vi, quan sát các đặc điểm Làm nhiều tiêu bản bột, chụp ảnh ghi lại đầy đủ các đặc điểm của bột lá Nhận biết các đặc điểm theo hướng dẫn trong tài liệu [2] 2.3.2 Nghiên cứu về hóa học  Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học Tiến hành theo các phương pháp hóa thực vật thường quy... 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng 3.1.1 Đặc điểm hình thái Lá Hồng mọc so le, đơn Cuống lá dài 0,5 – 1,5 cm Phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 6 – 20 cm, rộng 3 – 9 cm; ngọn lá có mũi lồi nhọn, gốc lá thuôn dần; mép lá nguyên hoặc hơi lượn sóng; mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu nhạt, có lông Gân lá hình lông chim Hình 3.1 Cành mang lá cây Hồng. .. Nam, hồng mới được phát triển ở Đà Lạt (Lâm Đồng) Các giống hồng đang được trồng hiện nay vô cùng phong phú như hồng Hạc, hồng Lạng, hồng vuông, hồng trứng… [10] Hình 1.1 Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây Chú thích: 1 Toàn cây 2 Cây mang quả 3 Cành mang lá 4 Cành mang hoa 5 Quả hồng 6 Tai hồng 5 1.2 Thành phần hóa học Trên thế giới, nhiều hợp chất đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của. .. lập từ lá hồng có hoạt tính kháng VSV đối với cả nấm và vi khuẩn, trong đó tác dụng mạnh trên nhiều vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 10 1.3.3 Tác dụng chống ung thư Lupeol phân lập từ lá Hồng cho kết quả rõ ràng về khả năng chống ung thư thử nghiệm trên tế bào MCF-7 và tế bào HeLa với nồng độ ức chế 50% (IC50) lần lượt là 20,7 và 23,4 μg/mL Uvaol, α-amyrin và kampferol cũng cho thấy tác dụng kháng tế... học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Diospyros kaki Thunb., họ Thị (Ebenaceae) (Phụ lục 1) 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất  Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật Nước cất Xanh methylen Nước tẩy Javen Đỏ carmin Acid acetic 5% Glycerin  Thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa học - Dung môi: Ethanol, nước cất, . Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học của. Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học của lá cây Hồng. 1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 1.3.1. Tác dụng hạ huyết áp Lá Hồng đã được sử dụng như một. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BẠC CẦM MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA LÁ CÂY HỒNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ