Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cây dây đòn gánh ( gouania leptostachya DC họ táo ta rhamnaceae)

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y TẾ TRƯỜNG Đạ• I Họ• C D ơ• c HÀ NƠI • NGUYễ N VĂN AN NGHIÊN CỨU Đặ• C ĐIỂM THự• C Vậ• T,7 THÀNH PHẦN HĨAHOC VÀ TÁC Dụ• NG • KHÁNG KHUẨN, KHá NG NẤM CỦA CÂY DÂY ĐÒN GÁNH (Gouania ỉeptostachya DC họ Táo ta Rhamnaceaẹ) LUậ• N Vă N THAC s ĩ DƯợ• C Họ• C • CHUYÊN NGÀNH: D ợ c LIỆU - D ợ c c ổ TRUYỀN MÃ SỐ : 60.73.10 Người hướng dẫn: TS.Trần Văn ơn PGS.TS Nguyễn Thái An 1TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI ĨIẰ ivrAĩ T H Ư V IỆ N HA NỌI 20jị0 ịa tháng é) năm120.ẲA SSoKCB: c HJ].X.5 Lời cảm ơn Sau thời gian nghiên cứu thực đề tài, thời điểm hồn thành luận văn lúc tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Trần Văn n - Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nộỉngười động viên, giành nhiều thời gian quỷ báu hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu thực luận vãn PGS.TS Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội- người bảo tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực nghiên cứu luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược co truyền, Bộ môn Vỉ sinh trường Đại học Dược Hà Nội Tập thể cán Viện hóa học - Trung tâm khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận vãn Các thầy, cô Trường Đại học Dược Hà Nội, trang bị đầy đủ kiến thức động viên giúp đỡ suốt năm học tập nghiên cứu Cuối xin bày tỏ lòng biết 071 sâu sắc tới anh chị, bạn lớp cao học chuyên ngành Dược liệu - Dược co truyền khoả 13 chia sẻ, động viên khích lệ tơi q trình học tập nghiên cứu giúp tơi hồn thành tốt luận văn Xỉn chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng 12 năm 2010 N G U YỄ N VẨN A N M ỤC LỤC ĐẶT VÁN Đ È .1 CHƯƠNG 1: TỎNG Q U A N 1.1 v ề mặt thực v ậ t 1.1.1 Vị trí phân loại chi Gouania Jacq 1.1.2 Đặc điểm thực vật tính đa dạng sinh học chi Gouania Jacq 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố loài Gouania leptostachya DC .3 1.1.4 Đặc điểm thực vật phân bố loài Gouania javanica Miq 1.2 v ề thành phần hoá học .5 1.2.1 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Gouania Jacq 1.2.2 Thành phần hóa học Dây đòn gánh G.leptostachya D C 1.3 v ề măt sinh h • • o c 1.3.1 Tác dụng sinh học sổ loài thuộc chi Gouania J a cq 1.3.2 Tác dụng sinh học Dây đòn gánh 1.3.2 Tính vị cơng 1.3.3 Công dụng 1.4 Một số thuốc có Dây đòn gánh 1.4.1 Chữa sung tấy, tụ máu, đau nhức chấn thương 1.4.2 Chữa bỏng bỏng vôi 1.4.3 Chữa sốt cao gây co giật trẻ em 1.4.4 Chữa rắn cắn 1.4.5 Diệt c h ấ y .8 1.5 Vài nét phương pháp xác địnhcấu trúc họp chất hữu CO’ 1.5.1 Phổ hồng ngoại 1.5.2 Phổ khối lượng 1.5.3 Phổ cộng hưởng tù’ hạt nhân 10 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 14 2.1 Nguyên liệu nghiên c ứ u 14 2.2 Hóa chất thiết bị dùng trongnghiên cử u 14 2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hóa chất 14 2.2.2 Vi sinh vật thí nghiệm 14 2.2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 16 2.3.1 Nghiên cứu thực v ậ t 16 2.3.2 Nghiên cứu hóa học 16 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh h ọ c 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 18 3.1 Đặc điểm thực vật mẫu Dây đòn g n h 18 3.1.1 Đặc điểm thực vật mẫu A I 18 3.1.2 Đăc vât• mẫu A 21 • điểm thưc • 3.1.3 Đăc vât• mẫu A 24 • điểm thuc • 3.2 Ket nghiên cứu thành phần hóa h ọc .29 3.2.1 Định tính nhóm chất phản ứng hóa học 29 3.2.2 Chiết x u ấ t .36 3.2.3 Phân lập chất từ cắn phân đoạn butanol 36 3.2.4 Nhận dạng chất phân lập đ ợ c 38 3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 49 3.3.1 Giống vi sinh vật kiểm định 49 3.3.2 Môi trường thủ’ nghiệm 50 3.3.4 Kết thử nghiệm 51 3.3.5 Kết luận 52 CHƯƠNG 4: BÀN LU Ậ N 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 57 DANH MỤC CÁC CHỮ VIỂT TẮT 13c NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 'H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 'l i - ’}! c o s y 1D-NMR ]H -'H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều One-Dimensional NMR 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR DC Dịch chiết DMSO Dimethylsulfoxide DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer ESI-MS Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) NC Nghiên cứu NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy SKC Sac ký cột Column Chromatography SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật (ppm) Độ dịch chuyển hóa học (parts per milion) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật mẫu Bảng 3.2 Kết định tính chất dược liệu Dây đòn gánh Bảng 3.3 Bảng liệu phổ NMR C Bảng 3.4 Bảng liệu phổ NMR C Bảng 3.5 Bảng liệu phổ NMR C1 Bảng 3.6 Khối lượng nồng độ mẫu Bảng 3.7 Kết thử tác dụng kháng khuẩn Bảng 3.8 Ket thử tác dụng kháng nấm DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Ảnh mẫu AI lúc hoa Hình 3.2 Đặc điểm hoa mẫu AI Hình 3.3 Đặc điểm hoa mẫu A2 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân Hình 3.6 Sơ đồ phân lập chất từ Dây đòn gánh Hình 3.7 Cấu trúc hóa học Acid Gouanic A Hình 3.8 Cấu trúc hóa học Axit Ceanothenic Hình 3.9 Cấu trúc hóa học hợp chất Axit Gouanic c ĐẶT VÁN ĐÈ Theo thống kê giới, 10% nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu bệnh da [18] Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm Đây điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh ngồi da phát triển Tuy chưa có thống kê đầy đủ, theo số nghiên cứu khu vực cho thấy tỉ lệ mắc bệnh da Việt Nam dao động khoảng từ 10 — 14% [13], [16], [20] Bên cạnh đó, việc lạm dụng loại kháng sinh phổ rộng kéo dài, corticoid, chiếu xạ, bệnh nhân nhiễm HIV, hay việc sử dụng tràn lan hố mỹ phẩm ngồi da, nhiễm môi trường, v.v yếu tố khiến tỉ lệ mắc bệnh da ngày tăng, đồng thời dẫn tới tượng vi khuẩn kháng thuốc ngày nhiều Trong thuốc chữa bệnh da chưa đáp ứng nhu cầu chừa bệnh người dân, hầu hết thuốc tổng hợp hóa học dễ gây nhiều tác dụng phụ Vì vậy, việc tiếp tục tìm kiếm thuốc chữa bệnh ngồi da có tác dụng kháng khuẩn, kháng vi nấm gây bệnh nhu cầu tất yếu Với điều kiện tự nhiên đa dạng, Việt Nam có hệ thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao [11], với khoảng 4.000 loài sử dụng làm thuốc [7], có Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC) Cây Dây đòn gánh từ lâu sử dụng dân gian để chữa sưng tấy, đau nhức đòn đánh, bị thương ngã, đau người, mụn nhọt, đinh độc, bỏng, vết thương, lở ngứa, v.v Đây lồi có đặc điểm hình thái giống nằm chi Gouania Jacq Việt Nam [1][33] Riêng loài Gouanỉa leptostachya DC lại có thứ khác [1], [6 ] Trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học năm 2009 Nguyễn Thị Thuỷ [22], tác giả cho thấy cắn phân đoạn n-butanol chiết từ loài Gouania ỉeptostachya DC có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt v ấ n đề đặt tác dụng cắn phân đoạn hay hay vài thành phần nằm phân đoạn này, hoạt tính chúng có đủ tác dụng mạnh để ứng dụng? Với mong muốn chứng minh kinh nghiệm sử dụng Dây đòn gánh dân gian tìm hiểu sâu thành phần hay nhóm chất có tác dụng điều trị, đồng thời nhằm nâng cao giá trị sử dụng dược liệu, làm phong phú kho tàng thuốc Việt Nam, đề tài: “Nghiên cửu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học tác dụng khảng khuẩn, kháng nấm Dây đòn gánh (Gouania ỉeptosíachya DC.)” tiến hành với mục tiêu sau: Nghiên cứu mặt thực vật hai loài chi Gouanỉa Jacq Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu nghiên cứu Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mẫu nghiên cứu Từ mục tiêu đề ra, đề tài tiến hành với nội dung sau: Nghiên cứu đặc điểm thực vật phân biệt hai loài chi Gouanỉa Jacq Định tính, chiết phân đoạn tiến hành phân lập, nhận dạng 1-3 chất tinh khiết từ phân đoạn chiết xuất Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phân đoạn chất phân lập từ phân đoạn nghiên cứu A N —C8—MeOD—C13CPD 1—I m H H n i n H i n m H i n H n m n o o o o r o m ' i c o c o H h ^ H i n ^ h CNJ i n n M — VOV£>VX>C\ J r Hi f ~»*- t cn to H* TJ Q> U) z z tn r t-h ro II II II CO 'TJ 'TJ t* H* —* o ► K» z z PI t* h-* M Ul -J -J 1—» z c o 1—» H-* CO o o h-1 o NJ o 1— c_n o o o o o o o o o o o o o 00 VO U5 VO VO VO o o o o o o o o o CJ o o o o o 00 o 01 C/J C/J c/1 to 1—» o o UI h-* Xk £» n H T i O O G r f TJ < 33 n z o H o t—» cn M -J a\ CO o 00 o s N> (D o KO H-* 00 CD Ư1 O O v O C O U ^ Ư1 o o o o N) UJ o ^0 M H a ?0 z H- 0» n o ƯÌ r r 03 H fD (T> 73 o G > n ►Q c HU1 Cfl H* (-*■ H* o c N) ho h-* H3 rt H- 0) o a; TJ VO t—i1 I—* QĨ c fB —» a o OJ ► ( t UI o (5 rt 0) A N —C8—MeOD—C13CPD &DEPT DEPT90 " ' 'I I I I ' " 190 180 D E P T 135 C13CPD 170 160 ' " I I " ■ 150 140 130 120 110 100 90 "T "T” "T" 80 70 60 TTTT 50 "T" 40 30 20 ppm A N —C8—MeOD—C13CPD &DEPT DEPT90 ' ' r|— 65 60 ~r "T T 55 50 45 40 r T T" T 35 30 25 20 15 ppm 35 30 25 20 15 ppm ' I T, , IT’T, I , r I■, , , I' ' — - D E P T 135 CH&CH3 CH2 ~1— 65 60 I I 55 50 45 T T 50 45 40 I— I I 40 C13CPD TI 65 ' ' > ' ~7I 60 r— , I 55 T T , IT, , T}, , , , I,, , , r— - . . r r 35 30 25 20 15 ppm A N -C 8-M eO D -H M B C AN -C 8-M eO D -H M BC 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 ppm u iđ đ g - ' £ s ■e ■ D Q H H -G & N - D - N Y s ' rndd O'T ■T £ ‘T 9'T 8'T D ZNH -aom -8D -NY 0'3 Z'z uiđđ •T s 'T ■z s •z ■£ s •£ DỖSH-aoeH-8D-NY •ỷ s• •s uiđđ Z ’£ V'£ '£ ■£ 0• Z'V D Ồ S H —ŨO&N—8 D —N Y p •V •p 8•V mdd ■I Z'ĩ V"l ■T 'T 'z D 0SH -aom -8D -N Y Z'Z fr'z File: E:\Du Lieu FT-MS\11-2010\AN_C9.trans B ase -P e ak Amplitude: 59.5662 Scans: Positive Ions Internal Calibration 423.7 100 80 60 563.0 40 397.1 20 374.6 577.4 358.3 427.8 481.0 376.7 393.0 417.5 472.8 _Jl_ I I I I I r rT T T T T T T T T T T T T T 200 250 Li Jll uilJi ill n I I I I I I I I I I I“n~rrTT~| -r I 300 350 400 fT T T T J Mass/Charge A I_ L I I I I I I I I I I I r r r i 450 _L I I I I I I I IT T 500 |"T 550 I I I I I I I I I I 600 C u r r e n t Data P a me t er s NAME 1AN_C8 EXPNO PROCNO A N -C 8-M eO D -C O S Y G P ppm Date_ Time INSTRUM PROBHD PƯLPR0G TD SOLVENT NS DS SWH FIDRES AQ RG DW DE TE _A_ 1.0^ 1.5 D1 dl3 D16 IN0 MCREST MCWRK oa 2.0 p NƯC1 P0 PI PL1 SFOl 2.5 3.0 L Hz Hz sec usee usee K sec sec sec sec sec sec sec AM -— rwn M NM INFT tj Li fI 1H 10 30 us ee 10.30 us ee 0 dB 0 2 MHz GRADIENT CHANNEL S I N E 100 S I N E 100 0.00 0.00 0.00 0.00 10 0 ===== % % % % % 10 0 % 1000.00 u see FI - A c q u i s i t i o n p a r a m e t e r s ND0 TD 160 0 3 MHz SFOl 0 0 Hz FIDRES 9 ppm sw FnMODE QF 3.5ID 4.0 F2 - P r o c e s s i n g p a r a m e t e r s 1024 SI 0 0 0 MHz SF WDW SINE SSB 0 Hz LB GB 1.40 PC 4.5 5.0- GPNAM1 GPNAM2 GPX1 GPX2 GPY1 GPY2 GPZ1 GPZ2 P16 20101110 44 spect mm M u l t i n u c l c osygpqf 204 MeOD 5000.000 2.441406 0.2049500 128 100.000 6.00 300.0 0.00000300 8 9 0.00000400 0.00020000 0.00020000 0.00000000 48689198 - 5.0 I 4.5 , , I 4.0 I 3.5 -I 3.0 -T I I 2.5 2.0 I 1.5 1.0 , , ppm FI - P r o c e s s i n g p a r a m e t e r s 1024 SI MC2 QF 50 29 99 MHz SF WDW SINE SSB 0 Hz LB GB C u r r e n t Data P a r a me t e r s NAME 21AN_C8 EXPNO PROCNO A N -C 8-M eO D -C O S Y G P F2 - A c q u i s i t i o n P a r a m e t e r s 20101110 Date_ 9.44 Time INSTRUM spect PROBHD mm M u l t i n u c l PULPROG cosygpqf 204 TD MeOD SOLVENT NS DS SWH 0 0 Hz FIDRES 4 Hz 0.2049500 sec AQ RG 128 DW 100.000 u see DE 6.00 usee TE 300.0 K 00000300 sec D1 1.48689198 sec dl3 00000400 s ec Dl 0.00020000 sec INO 00020000 sec MCREST 00000000 sec 1.48689198 sec MCWRK ppm ======:*- CHANNEL f l ======== NUC1 PO PI PL1 SFOl GPNAM1 GPNAM2 GPXl GPX2 GPY1 GPY2 GPZ1 GPZ2 P16 1H 10 30 10.30 0.00 500.1322506 usee usee dB MHz rDAnTTMT MC1 bKnUl t NÍ PU&M i^nnNWDlj S I N E 100 S I N E 100 0.00 0.00 0.00 0.00 10 0 10 0 1000.00 % % % % % % usee Fl - A c q u i s i t i o n p a r a m e t e r s NDO TD 160 SFOl 0 3 MHz 0 0 Hz FIDRES sw 9 ppm FnMODE QF F2 - P r o c e s s i n g p a r a m e t e r s 1024 SI SF 0 0 0 MHz WDW SINE SSB 0 0 Hz LB GB 1.40 PC 4.5- ppm Fl - P r o c e s s in g param et er s 1024 SI MC2 QF 0 9 9 MHz SF WDW SINE SSB 0 0 Hz LB GB C u r r e n t Data P a r a m e t e r s NAME 21 AN_C EXPNO PROCNO AN—C —MeOD—COSYGP ppm F2 - A c q u i s i t i o n P a r a m e t e r s Date_ 0101110 Time 9.44 INSTRƯM spect PROBHD mm M u l t ỉ n u c l PƯLPROG cosygpqf TD 204 SOLVENT MeOD NS DS SWH 0 0 Hz FIDRES 4 Hz AQ 0.2049500 s ee RG 128 DW 100 000 u s ec DE 6.00 usec TE 300.0 K dO 0.00000300 s ee DI 1.48689198 s ee dl3 00000400 see D16 00020000 sec IN0 0.00020000 s ec MCREST 0.00000000 s ec MCWRK 48689198 s ec ' ầIẳ /s - 1.2O) 1.4- 6- < NƯC1 P0 PI PL1 SFOl 8- oa 2.02 — — 2.4- — 1H 10.30 usee 10.30 usee 0 dB 0 2 MHz GRADIENT CHANNEL GPNAM1 S I N E 100 GPNAM2 S I N E 100 GPXl 0.00 GPX2 0.00 GPY1 0.00 GPY2 0.00 GPZ1 10 00 GPZ2 10 00 P16 1000 00 - ===== % % % % % % usee FI - A c q u i s i t i o n p a r a m e t e r s ND0 TD 160 SFOl 0 3 MHz FIDRES 0 0 Hz sw 9 ppm FnMODE QF 8- F2 - P r o c e s s i n g p a r a m e t e r s SI 1024 SF 0 0 0 MHz WDW SINE SSB LB 0.00 Hz GB PC 1.40 3.03.2r -MC2 3.4- CHANNEL f l 1— ’— I— '— I— 3.2 3.0 PPm Fl - Processing parameters SI 1024 QF SF 0 9 9 MHz WDW SINE SSB LB 0.00 Hz GB ... hoá học tác dụng khảng khuẩn, kháng nấm Dây đòn gánh (Gouania ỉeptosíachya DC.) ” tiến hành với mục tiêu sau: Nghiên cứu mặt thực vật hai loài chi Gouanỉa Jacq Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu nghiên. .. 1.1.4 Đặc điểm thực vật phân bố loài Gouania javanica Miq 1.2 v ề thành phần hoá học .5 1.2.1 Thành phần hóa học số loài thuộc chi Gouania Jacq 1.2.2 Thành phần hóa học Dây đòn gánh G .leptostachya. .. lupuloỉdes có tác dụng tốt [27] 1.3.2 Tác dụng sinh học Dây đòn gánh Trong nghiên cứu sàng lọc thực Ấn Độ, cao khô chiết cồn phần mặt đất Dây đòn gánh có tác dụng tần số biên độ hơ hấp, có tác dụng hạ